L’immunopathogenèse de l’infection au VIH-1 est principalement causée par la déplétion des LT CD4 (lymphocytes T-CD4). Cette mort des LT CD4 dépend de plusieurs facteurs comme la lyse des LT CD4 infectés et la présence de vésicules extracellulaires et d’exosomes libérées par les cellules dendritiques et les LT CD4 infectés au VIH-1. L’analyse protéomique des exosomes issus des cellules dendritiques mises en culture avec le VIH-1 a révélé la présence de molécules pro-apoptotiques comme le Dap-3 (Death Associated Protein 3). Nous avons proposé comme hypothèse que le Dap-3 puisse être contenu dans d’autres types de vésicules extracellulaires et que le Dap-3 vésiculaire contribue à la déplétion des LT CD4. Après avoir optimisé l’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3, nous avons déterminé la présence de Dap-3 dans les vésicules extracellulaires issues des cellules RAJI-CD4-DCIR infectées au VIH-1. L’utilisation de gradients de vélocité nous a permis d’observer la présence de Dap-3 dans les fractions du gradient contenant les exosomes issus des cellules RAJI-CD4-DCIR infectées, mais également dans d’autres fractions du gradient de vélocité encore non caractérisées. Chez les patients, nous avons montré une hétérogénéité des vésicules extracellulaires dans les fractions du gradient de vélocité issues des plasmas des patients VIH-1+. Ces résultats indiquent la présence de plusieurs populations de vésicules extracellulaires séparées par la méthode du gradient de vélocité. Enfin, la transfection des cellules RAJI-CD4-DCIR et des cellules dendritiques a été mise au point avec les ARN anti-sens de Dap-3 afin de produire éventuellement des vésicules Dap-3 négatives. Ce projet de recherche aura permis de valider les outils nécessaires à la poursuite de l’étude du rôle de Dap-3 dans la pathogenèse de l’infection au VIH-1.

Les vésicules extracellulaires (VE) jouent un rôle de communication intercellulaire pouvant réguler le système immunitaire. Les VE sont composées de différentes populations que l'on retrouve dans tous les fluides biologiques et constituent des biomarqueurs ainsi que des outils thérapeutiques dans diverses pathologies comme les cancers. Une étude dans notre laboratoire a révélé le potentiel de biomarqueur des vésicules extracellulaires plasmatiques (VEsp) chez des patients infectés par le virus de l'immunodéficience humaine de type-1 (VIH-1). Cette étude a montré un enrichissement des VE acétylcholinestérase positive (AChE+) et des marqueurs protéiques de la population des exosomes chez les patients infectés. Nous avons proposé comme hypothèse que la population de VEsp AChE+ serait des exosomes et que cette population constituerait un meilleur biomarqueur de l'infection par le VIH-1 que l'ensemble des VE. Les VEsp AChE+ d'une nouvelle cohorte de patients ont été caractérisées. Dans un premier temps, la purification des VEsp AChE+ a été optimisée afin de séparer les grosses vésicules des petites. Dans un deuxième temps nous avons validé que la population de VEsp AChE+ est une population homogène et spécifique dont le potentiel de biomarqueur de l'infection a été validé. Pour terminer la caractérisation de cette population, elle a été séparée dans un gradient de vélocité à l'iodixanol afin de valider que cette population de vésicules était des exosomes. Ce projet a permis de valider que la population d'exosomes AChE+ purifiées et caractérisées dans une cohorte de patients atteints du VIH-1+, représente un biomarqueur de l'évolution de l'infection par le VIH-1.

Le CD154 joue un rôle crucial dans l’activation des cellules présentatrices d’antigènes. Il a été démontré que le CD154 est incorporé à la surface du VIH-1 et que de tels virus activent des lymphocytes B. Nous avons vérifié s’ils ont également la capacité d’activer des macrophages humains. Nous avons observé une augmentation de la production d’IL-8 par les macrophages dérivés de monocytes (MDM), mais celle-ci varie grandement en fonction des différentes productions virales et des donneurs utilisés. L’induction de la sécrétion d’IL-8 est spécifique au CD154 puisqu’une forme mutée ne l’induit pas et est indépendante de la gp120. L’expression des MMP-1 et -2 est influencée par le CD154 sur les cellules 293T, mais l’effet spécifique de CD154 est perdu lorsque des virus sont utilisés. L’ensemble de ces résultats suggère que l’incorporation de CD154 par le virus pourrait être un moyen additionnel d’attirer des cellules cibles au site d’infection et ainsi favoriser la réplication virale. / CD154 interacts with CD40 found on antigen-presenting cells such as macrophages and plays a crucial role in activating these cells and initiating immune responses. We have previously reported that CD154 is incorporated within HIV-1 envelope and is effective at activating primary B lymphocytes. In this study, we tested if such CD154-bearing virions are also effective in activating human monocyte-derived-macrophages (MDM). We observed an increase in IL-8 secretion, but it is highly variable depending on viral productions and donors used. The induction of IL-8 production is specific to CD154 since a mutant form does not induce it and is independent of gp120. The production of MMP-1 and -2 is influenced by CD154 on 293T cells but the specificity is lost when viral particles are used. These results suggest a possible way used by the virus to attract target cells to the site of infection and thereby favour its own replication.

Très tôt après l'entrée initiale du VIH-1 dans l'organisme, le système immunitaire est déjoué, permettant ainsi au virus de se répliquer activement. Cette replication engendre une depletion massive des lymphocytes T CD4⁺ ainsi qu'un dysfonctionnement des lymphocytes B. Nous savons que les premières cellules liant le VIH-1 sont les cellules dendritiques. De plus, ces cellules ont la capacité de migrer avec le virus jusqu'aux organes lymphoïdes secondaires où elles peuvent alors transmettre efficacement le VIH-1 aux lymphocytes T CD4⁺. Afin d'approfondir nos connaissances sur la pathogenèse associée au VIH-1, il est essentiel d'étudier intensivement les intervenants et plus particulièrement les cellules dendritiques et les récepteurs retrouvés à leur surface susceptibles de lier le VIH-1 lors de la primo-infection. La gpl20 du VTH-1 peut se lier au récepteur CD4 et corécepteurs afin de mener à une infection productive des cellules dendritiques. Toutefois, d'autres récepteurs, comme les récepteurs lectines de type C tels que le DC-SIGN sont connus pour leurs rôles dans l'infection en trans et donc le transfert efficace du vims des cellules dendritiques vers les lymphocytes T CD4⁺. Les cellules dendritiques myéloïdes, résidentes des muqueuses, expriment plusieurs lectines de type C dont le DCIR (dendritic cell ùnmunorecptor) qui a fait l'objet de mes études doctorales. Au cours de ces études, nous avons montré que le DCIR favorisait l'infection en trans et en cis des cellules dendritiques et que le domaine neck et le motif ITTM du DCIR étaient responsables de ces effets. De plus, nous avons mis en évidence pour la première fois que le DCIR était exprimé sur les lymphocytes T CD4⁺ en apoptose à la suite de l'infection par le VIH-1. L'expression du DCIR sur les cellules apoptotiques pourrait favoriser la dissémination et le transfert du VIH-1. Nous avons aussi montré l'importance de la signalisation engendrée par le domaine ITIM du DCIR dans l'infection par le VIH-1. L'ensemble de ces études ont permis de caractériser le rôle du DCIR dans la pathogénèse associé à l'infection par le VIH-1, en plus d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques très pertinentes pour contrer cette épidémie. Enfin, ces études montrent aussi l'importance d'étudier les autres récepteurs lectines de type C afin de bien comprendre le rôle de chacune dans l'infection par le VIH-1.

Chez les patients atteints du VIH-1, le PD-L1, une molécule de costimulation inhibitrice des lymphocytes T, est régulé à la hausse. Puisque plusieurs molécules cellulaires sont incorporées dans le VIH-1 et que certaines conservent leur fonction de signalisation une fois incorporées, nous avons vérifié si le PD-L1 pouvait être incorporé dans le VIH-1 pour ensuite induire certains défauts fonctionnels chez des lymphocytes T exprimant son récepteur PD-1. Nos résultats démontrent que non seulement le VIH-1 acquiert le PD-L1 en bourgeonnant de macrophages dérivés de monocytes ou de lymphocytes T CD4+ humains in vitro, mais que cette acquisition se produit également in vivo. Lorsqu'il est mis en présence de lymphocytes T CD8+ exprimant le PD-1, le VIH-1 porteur du PD-L1 favorise l'activation des caspases, signe potentiel de l'induction de l'apoptose. Ces résultats démontrent qu'en acquérant le PD-L1, le VIH-1 pourrait bien être directement impliqué dans l'épuisement de la réponse immunitaire.

Malgré le nombre croissant d'individus infectés par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) chaque année, il n'existe toujours pas de vaccin efficace qui prévienne son infection chez l'homme. Seulement en 2020, on peut encore compter 37,6 millions d'infection et 690 000 décès liés au SIDA. Le développement d'un vaccin contre le SIDA, sûr et efficace, serait donc un moyen très pertinent pour combattre les ravages de cette maladie. Le virus de la stomatite vésiculeuse (VSV), membre de la famille des Rhabdoviridae, infecte principalement les bovins, mais est relativement bénin pour l'humain, n'étant associé qu'à de légers symptômes pseudo-grippaux. Par ailleurs, le VSV recombinant a déjà été utilisé pour le développement de vaccins humains contre divers virus, notamment Ebola, Marbourg, Lassa, la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (CCHFV), Nipah, les coronavirus MERS et SRAS, Zika, Influenza et VIH. Dans ce travail, effectué dans le cadre plus large du développement de nouveaux candidats vaccins contre le VIH, basé sur les VSV recombinants (rVSV), nous proposons différents schémas de purification pour le traitement de ces candidats. Une série de filtres avec des tailles de pores et des supports de filtration différents ont été testés pour leur efficacité à éliminer les débris cellulaires du surnageant de culture cellulaire tout en permettant aux particules infectieuses de traverser le filtre. Cette microfiltration en série a également été appliquée pour éliminer le besoin de centrifugation à basse vitesse à l'étape de la clarification et améliorer les rendements, la simplicité et l'extrapolabilité des schémas proposés. Afin de réduire le volume de l'échantillon à traiter, l'application de différentes unités d'ultrafiltration (UF), soit des unités d'UF centrifuge ou à flux tangentiel (TFUF), ont été testées. Pour ce faire, les paramètres de fonctionnement de la TFUF ont été maintenus à des valeurs ne générant que de faible taux de cisaillement (≤ 2000 s⁻¹) pour préserver l'intégrité du rVSV. Pour l'étape de la purification chromatographique proprement dite, plusieurs technologies candidates ont été testées pour leur capacité à séparer les particules infectieuses de l'ADN et des protéines contaminants. Des résines échangeuses d'anions fortes et faibles, à savoir HiTrap™ DEAE FF, HiTrap™ ANX FF, HiTrap™ Q FF et HiTrap™ XL (Cytiva), ont été testées en colonne. Dans les meilleures conditions, ces colonnes ont permis de récupérer 77 % des particules infectieuses tout en éliminant respectivement 93 % et 92,7 % des protéines totales et de l'ADN. Par la suite, un schéma de purification chromatographique en deux étapes utilisant initialement un adsorbeur échangeur d'ion membranaire (Sartobind® Q, Sartorius), suivi d'une résine multimodale (Captocore™ 700, Cytiva) a également été testé car les adsorbeurs membranaires sont plus pratiques pour les procédés à grande échelle. La purification des rVSV à l'aide de ce protocole a permis de récupérer 51 % de particules infectieuses et a éliminé 95 % et 85 % de l'ADN et des protéines contaminants, respectivement. Cependant, étant donné que les micrographies électroniques de ces préparations virales purifiées présentaient encore une quantité notable de vésicules extracellulaires ou d'exosomes, deux résines à base de céramique d'hydroxyapatite (CHT) ont aussi été testées pour leur capacité à séparer les rVSV de ces contaminants. La colonne CHT II (BioRad) a montré des résultats prometteurs en terme d'élimination des vésicules extracellulaires, comme vérifié par microscopie électronique à transmission (TEM). De plus, une récupération de 78 % de rVSV infectieux ainsi que l'élimination de 98 % de l'ADN résiduel et de 99 % des protéines ont été mesurées dans les éluats de cette colonne. / Despite the growing number of Human immune deficiency virus (HIV) infected individuals every year, there is still no effective vaccine that prevents new HIV infection in humans. As of 2020, a total of 37.6 million individuals were found globally to be infected with HIV. With 690,000 AIDS-related death reports in 2020, developing a safe and effective HIV vaccine is of utmost importance. Vesicular stomatitis virus(VSV), a member of the Rhabdoviridae family, mainly infects cattle, but its infection in human is mainly benign and can only be associated with mild flu-like symptoms. In addition, the VSV platform has already been used to develop vaccines against a variety of virus infections, including Ebola, Marburg, Lassa, Crimean-Congo hemorrhagic fever (CCHFV), Nipah, MERS- and SARS- coronaviruses, Zika, Influenza, and HIV. In the current work, carried out within the broader framework of developing new vaccine candidates against HIV based on recombinant VSVs (rVSVs), we propose different purification schemes for the DSP of the candidate vaccine. A series of filters with different pore sizes and filtration media were tested for their effectiveness in removing cellular debris from the cell culture supernatant while allowing the infectious particles to pass through the filter. Serial microfiltration was also applied to eliminate the need for low-speed centrifugation at the clarification step and improve the proposed schemes' yield, simplicity, and scalability. In order to reduce the volume of the sample to be processed, the application of different ultrafiltration (UF) units, either centrifugal based UF units or tangential flow UF (TFUF) systems, were tested. The TFF operation parameters were maintained at values generating low shear (≤2000 s⁻¹ shear rate) for preserving the integrity of the rVSV as an enveloped virus. For the actual chromatographic purification step, multiple candidate technologies were tested for their ability to separate infectious particles and to remove the contaminant DNA and proteins. Strong and weak anion exchanger resins, namely, HiTrap™ DEAE FF, HiTrap™ ANX FF, HiTrap™ Q FF, and HiTrap™ XL (Cytiva), were put into test in the column mode. In best condition, these columns resulted in the recovery of 77 % infectious particles while eliminating 86.6 % and 92.7 % of the total proteins and DNA, respectively. Subsequently, a two-step chromatographic purification scheme initially used a membrane adsorber (Sartobind® Q, Sartorius), followed by a multimodal resin (Captocore™ 700, Cytiva) was tested since membrane adsorbers are more applicable for large-scale processes. Purification of rVSVs using this protocol resulted in the recovery of 51 % infectious particles but removed 95 % of the contaminant DNA contents and 85 % of total proteins. However, since the electron micrographs of these purified virus preparations still showed a noticeable amount of extracellular vesicles or exosomes (visually through TEM), two resins based on ceramic hydroxyapatite (CHT) were screened for their ability in separating the rVSVs from these contaminants. The CHT II (BioRad) column showed promising results in removing extracellular vesicles from the virus preparations as verified by transmission electron microscopy (TEM). Moreover, a recovery of 69.2 % infective rVSVs alongside the removal of 88 % residual DNA and 87 % of protein contents was measured in this column's eluates.

Malgré l'introduction de traitements antirétroviraux efficaces, l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) reste un problème de santé publique majeur. Le foie a été identifié parmi les organes cibles du VIH, ayant pour conséquence des altérations hépatiques associées à des comorbidités chez les individus infectés. Cet organe est composé de nombreux types cellulaires. Parmi ceux-ci, on retrouve des cellules de l'immunité adaptative, les lymphocytes T, tout comme des cellules de l'immunité innée, les cellules iNKT qui représentent d'ailleurs une sous-population de cellules T CD4. Il a été proposé que les cellules iNKT jouent un rôle de pont entre l'immunité innée et adaptative et constituent le foie lors d'une lésion hépatique. De plus, il a été démontré que ces cellules sont infectées par le VIH. Dans ce contexte, nous avons analysé la dynamique d'infection des cellules iNKT du foie et des lymphocytes T CD4 conventionnels, à titre de comparaison, dans le but d'évaluer leurs contributions au cours de l'infection virale dans notre modèle de macaque rhésus infecté par le VIS. Nos résultats ont mis en évidence la présence de cellules iNKT (*invariant natural killer T cells*), se distinguant des lymphocytes T CD4 conventionnels par l'expression des molécules CXCR6, CD161, CCR6 et CD16. Nous avons également démontré que les cellules iNKT hépatiques possèdent un phénotype TCM tandis que les lymphocytes T CD4 possèdent un phénotype TEM. De plus, notre étude montre la présence d'ADN viral au sein de ces cellules en plus des LT CD4, suggérant que les cellules iNKT du foie pourraient représenter des réservoirs viraux du VIS. / Despite the introduction of highly active antiretroviral therapy, human immunodeficiency virus (HIV) infection continues to be a major global public health issue. The liver has been identified as a target organ for HIV causing liver injuries associated with comorbidities in infected individuals. Many cellular types compose this organ. These include adaptive immunity cells, such as CD4 T lymphocytes, as well as innate immunity cells, such as iNKT cells, which also represent a subset of CD4 T cells. iNKT cells have been proposed to act as a bridge between innate and adaptive immunity and constitute the liver during liver injury. Furthermore, it has been demonstrated that these cells are infected by HIV. In this context, we analyzed the infection dynamics of iNKT cells and CD4 T conventional cells, for comparison, to evaluate their contribution during viral infection in our rhesus macaque model infected with SIV. Our results showed the presence of iNKT cells (*invariant natural killer T cells*), differing from CD4 T conventional cells by the expression of CXCR6, CCR6, CD161 and CD16 molecules. We also demonstrated that iNKT liver cells harbor a TCM phenotype whereas CD4 T cells harbor a TEM phenotype. Moreover, our data show the presence of viral DNA within these cells in addition to CD4 T cells, suggesting that iNKT cells from the liver could represent SIV viral reservoir.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les inhibiteurs de la protéase (PI) du virus de l'immunodéficience humain (VIH) doivent, pour être actifs, pénétrer à l'intérieur des cellules cibles du VIH, comme les lymphocytes et être présents à des concentrations suffisantes au niveau de la protéase virale.<br /> <br />Certaines protéines d'efflux pourraient diminuer les concentrations intracellulaires d'IP. Ce travail étudie la pharmacocinétique intracellulaire des IP et leurs mécanismes de transfert à travers la membrane cellulaire à l'aide de modèles cellulaires.<br /> <br />Les IP pénètrent dans la cellule par diffusion passive et s'accumulent par fixation aux protéines cytosoliques.<br />Nous avons également étudié l'expression de la P-glycoprotéine à l'aide de cellules mononucléées du sang périphérique de patients infectés par le VIH et traités par des multithérapies antivirales à base d'IP.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est l’agent étiologique du SIDA. Il pénètre dans les cellules cibles par fusion membranaire médiée par le complexe enveloppe (Env) exprimé à la surface du virion. Le complexe est constitué d’une sous-unité de surface (gp120), et d’une sous-unité transmembranaire (gp41), exprimées sous forme trimérique. La liaison de gp120 au récepteur CD4 induit un premier changement de conformation qui expose la boucle hypervariable V3. Cette dernière lie un corécepteur, CCR5 et/ou CXCR4, induisant de nouveaux changements conformationnels au niveau de gp41 qui aboutissent à l’insertion du peptide de fusion, situé à l’extrémité N-terminale de gp41, dans la membrane de la cellule cible. Suite à la liaison du corécepteur, la région « heptad repeat 1 » (HR1) de gp41 interagit avec la région « heptad repeat 2 » (HR2) du même monomère pour former une structure coiled-coil hexamérique. Ce repliement permet le rapprochement des membranes virale et cellulaire, conduisant à la fusion des membranes.<p>Le processus d’entrée constitue une cible de choix pour inhiber la propagation du virus et à l’heure actuelle, il existe deux classes d’inhibiteurs d’entrée utilisés en clinique :les inhibiteurs de fusion et les inhibiteurs du CCR5. Le but de ce travail de thèse est l’étude des déterminants de l’enveloppe virale impliqués dans l’échappement du VIH-1 au traitement avec des inhibiteurs de fusion et de l’entrée.<p>La première partie de ce travail de thèse a étudiée l’effet modulateur des déterminants de l’enveloppe virale sur le niveau de résistance et de l’infectivité des virus primaires porteurs de mutations de résistance à l’enfuvirtide dans HR1 et de mutations compensatrices dans HR2. Nous avons sélectionné 5 patients ayant reçu un traitement à long terme incluant de l’enfuvirtide. Les enveloppes de virus ont été clonées à partir d’échantillons plasmatiques séquentiels, prélevés avant le début du traitement et pendant le suivi du traitement à l’enfuvirtide. Les séquences ont été caractérisées génotypiquement et phénotypiquement à l’aide de tests viraux recombinants mis au point à cet effet, et ciblant soit la région HR1-HR2, soit l’enveloppe entière. Pour les échantillons pré-thérapeutiques, les virus recombinants Env exprimaient des taux de sensibilité à l’enfuvirtide plus variables que les virus recombinants HR1-HR2, et une sensibilité à l’enfuvirtide significativement moindre que les virus HR1-HR2, indiquant que le contexte génétique de l’enveloppe affecte directement le niveau de susceptibilité du virus envers l’enfuvirtide. Après échec virologique, l’analyse phénotypique comparative des virus résistants suggère que les régions HR1-HR2 contiennent, à elles seules, les déterminants qui régissent la résistance. Le seul facteur associé à une modulation significative de la résistance est le tropisme. L’infectivité des virus Env a augmenté au cours du temps, alors que pour les virus HR1-HR2, l’infectivité est restée stable. Nos résultats suggèrent donc que le niveau de résistance confère un avantage sélectif initial sous pression sélective par l’enfuvirtide, alors que, une fois le niveau de résistance optimisé, l’infectivité des virus résistants est le facteur qui détermine la sélection des virus sous pression de sélection prolongée.<p>La deuxième partie de notre travail a été consacrée au rôle des virus dans des sites sanctuaires tels que le système nerveux central, et au rôle de séquences archivées dans les PBMCs dans l’échappement aux inhibiteurs d’entrée.<p>Dans une première étude clinique, nous avons illustré le rôle direct de la suppression incomplète du virus dans le système nerveux central dans l’acquisition de mutations de résistance à l’enfuvirtide et dans l’échec virologique. Le génotypage des virus plasmatiques et des virus isolés du liquide céphalo-rachidien d’un patient en échec de traitement a montré que la mutation de résistance à l’enfuvirtide était apparue dans le liquide céphalo-rachidien avant qu’elle ne devienne détectable dans le plasma, au moment de l’échec virologique. Le virus plasmatique résistant était phylogénétiquement proche du virus résistant isolé à partir du LCR, suggérant que la mutation de résistance a émergé dans ce compartiment. Ainsi, la pénétration incomplète des antirétroviraux dans le système nerveux central a abouti à la sélection de virus résistants, qui ont ensuite traversé la barrière céphalo-rachidienne pour atteindre la circulation périphérique.<p>Dans une seconde étude clinique, la caractérisation génotypique et phénotypique du tropisme de virus plasmatiques et cellulaires de deux patients en échec de traitement par du maraviroc ainsi que l’analyse phylogénétique rétrospective nous a permis de mettre en évidence l’importance de la recombinaison génétique dans la diversification des populations virales et son importance dans l’échec thérapeutique au maraviroc par l’émergence de virus X4. Par cette étude nous avons également pu souligner l’importance de l’administration iatrogène d’interleukine-2 sur la distribution et la modulation des populations X4 et R5 au niveau des compartiments cellulaires et plasmatiques et son importance dans l’échec thérapeutique au maraviroc.<p>En conclusions, nos résultats ont permis de mettre en évidence le pouvoir adaptatif du VIH-1 dans l’échappement au traitement aux inhibiteurs de l’entrée ainsi que le rôle majeur des sites sanctuaires et des virus archivés.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished