Le mélanome métastatique est un des cancers les plus agressifs avec une croissance constante du nombre de nouveaux cas par an dans le monde.Deux mutations sont principalement à l’origine de ce cancer : BRAF(V600) et NRAS(Q61). Les principaux traitements sont des thérapies ciblant BRAF lui-même ou MEK, prescrites en monothérapie ou en combinaison. La moitié des patients répondent à ce traitement mais malheureusement rechutent dans les 6 mois à 1 an après le début du traitement. Les mécanismes de résistance décrits passent par une réactivation de la voie des MAPK, de la voie PI3K/Akt/mTOR ou par une dérégulation de l’apoptose.Les deux premières voies de signalisation permettent la régulation d’un complexe : le complexe d’initiation de la traduction eIF4F. Ce complexe est composé de 3 protéines : eIF4E, une protéine qui s’associe à la coiffe 7-methyl-guanosine, eIF4A une hélicase et eIF4G une protéine échafaudage dont un des rôles est de maintenir la cohésion de ce complexe.Le complexe eIF4F étant en aval de deux voies dérégulées dans le mélanome, le but de ma thèse a été de mettre en évidence une potentielle implication de ce complexe dans la résistance aux thérapies ciblant BRAF et MEK.Pour cela, dans un premier temps, nous avons traiter des lignées cellulaires de mélanome BRAF(V600) sensibles et résistantes aux anti-BRAF et anti-MEK. Nous avons ensuite quantifié les interactions eIF4E-eIF4G, synonymes d’activation du complexe eIF4F, et les interactions eIF4E-4EBP1, synonymes d’inhibition de la traduction par une technique de Proximity Ligation Assay (PLA). Ces expériences ont permis de conclure que les inhibiteurs de BRAF et de MEK induisaient une dissociation du complexe dans les lignées sensibles, alors qu’il reste maintenu dans les lignées résistantes. Ces résultats ont été confirmés sur des tumeurs de patients répondeurs et non répondeurs à ces mêmes traitements. Par la suite, nous avons reproduits ces expériences avec un panel de lignées cellulaires mutées en NRAS(Q61) et avons observé les mêmes résultats.Nous avons donc pu mettre en évidence l’implication du complexe eIF4F dans la résistance aux thérapies ciblant la voie des MAPK dans les mélanomes mutés en BRAF et en NRAS, mais également découvert une nouvelle cible thérapeutique potentielle.La seconde partie de cette thèse a consisté au test de plusieurs inhibiteurs connus et spécifiques d’eIF4A (silvestrol, flavaglines, hippuristanol, patéamine A) ou de l’interaction eIF4E-eIF4G (4EGI1). Tous ces inhibiteurs ont sensibilisé les lignées résistantes aux thérapies ciblées mais aucun ne pouvait être potentiellement utilisable en clinique.L’utilisation d’un vecteur bicistronique dans le cadre d’un criblage de drogue a permis d’identifier 4 flavaglines qui inhibent significativement le complexe d’initiation de la traduction. L’une d’entre elles (FL3) a été testé in vivo dans un modèle de xénogreffes issues de lignées cellulaires de mélanomes résistantes. Les résultats ont montré un effet synergique de cette drogue en combinaison avec le vemurafenib (anti-BRAF) ainsi qu’une inhibition de la croissance tumorale. En conclusion, nous avons identifié une nouvelle cible thérapeutique et un nouveau biomarqueur de résistance aux thérapies ciblées dans deux contextes mutationnels de mélanome différents : BRAF et NRAS. / In BRAF(V600) or NRAS(Q61)-mutant tumours, most mechanisms of resistance to drugs that target the BRAF and/or MEK kinases rely on reactivation of the RAS–RAF–MEK–ERK mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal transduction pathway or on activation of the alternative PI(3)K–AKT–mTOR pathway (which is ERK independent). These two pathways converge to regulate the formation of the eIF4F eukaryotic translation initiation complex. By using an in situ method to detect the eIF4E-eIF4G and eIF4E-4EBP1 interactions, we recently showed that the persistent formation of the eIF4F complex, comprising the eIF4E cap-binding protein, the eIF4G scaffolding protein and the eIF4A RNA helicase, is associated with resistance to anti-BRAF and/or anti-MEK in BRAF(V600)-mutant cancer cell lines. We next focused on NRAS-mutant cancer cell lines and found that this complex is also involved in the resistance to anti-MEK compounds. Strikingly, inhibiting the eIF4F complex in BRAF or NRAS-mutated cell lines is able to overcome resistance and to synergize with drugs targeting BRAF or MEK kinases. As a result, eIF4F appears to be a promising therapeutic target in a BRAF or NRAS-mutation context.

Le profil d'expression aberrant des micro(mi)ARN est une caractéristique typique de nombreux cancers, dont le carcinome hépatocellulaire (CHC), une tumeur hépatique maligne primaire qui se classe seconde dans le monde en termes de mortalité par cancer. Notre équipe a récemment montré la baisse d’expression de miR-4510 dans des échantillons de patients atteints de CHC et son activité « suppresseur de tumeur ». L'analyse de données protéomiques recueillies à partir de cellules Huh7 transfectées par miR-4510 a révélé une diminution importante de plusieurs oncogènes, dont la sérine / thréonine protéine kinase RAF1. J’ai également découvert que le taux de protéine RAF1 était significativement surexprimé chez les patients atteints de CHC. Le rôle de RAF1 et de miR-4510 dans le CHC étant mal compris, j’ai étudié la fonction du couple RAF1/miR-4510 dans la tumorigenèse du foie. Mes analyses ont montré que miR-4510 régule négativement les taux de protéine RAF1 et d'ARNm. Une analyse par le système de double fluorescence-FunREG a révélé que miR-4510 interagit directement avec la région 3’ non-traduite de l’ARN de RAF1 via un site unique. La déplétion de RAF1 dans deux lignées tumorales de CHC par miR-4510 ou ARN interférant désactive leur caractère tumorigène in vitro et in vivo. Collectivement, mes données suggèrent que miR-4510 participe à la carcinogenèse du foie via son action directe sur RAF1 et la régulation de la voie MAPK/ERK. En conclusion, mon étude soutient l’hypothèse selon laquelle un traitement à base de miR-4510 pourrait être efficace pour traiter les patients atteints de CHC de type avancé ou réfractaire à la chimiothérapie. / Aberrant micro(mi)RNA expression signature is a hallmark of many cancers including hepatocellular carcinoma (HCC), a primary malignant liver disease which ranks second in cancer mortality worldwide. Our team previously reported the downregulation of miR-4510 in HCC samples and identified this miRNA as a strong tumor suppressor in liver. Proteomic data analysis collected from Huh7 cells transfected by miR-4510 showed a significant decrease of multiple oncogenes including RAF1 serine/threonine protein kinase. I also found that RAF1 protein level is significantly increased in HCC patients. The role of RAF1 and miR-4510 in HCC being poorly understood, I studied the function of RAF1/miR-4510 pair in tumorigenesis of the liver. My results showed that miR-4510 overexpression significantly decreases both RAF1 protein and mRNA levels and inhibits MAPK/ERK signaling. The dual fluorescence-FunREG assay revealed that miR-4510 directly interacts with RAF1 3’-untranslated region through a unique site. Silencing of RAF1 in two hepatic cell lines by miR-4510 or a specific small interfering RNA suppressed important tumorigenic features (proliferation, migration….) both in vitro and in vivo. Collectively, my data suggest that miR-4510 participates in liver carcinogenesis through RAF1 targeting and MAPK/ERK signaling inactivation. In addition, my study suggests that miR-4510-based therapy may represent a promising strategy to treat patients with advanced or refractory HCC.

Les léiomyosarcomes (LMS) sont des tumeurs d’origine mésenchymateuse caractérisées par une différenciation musculaire lisse. La voie de signalisation PI3K/mTOR (qui contrôle la prolifération et la survie cellulaire) joue un rôle majeur dans le développement de ces tumeurs. De nos jours, cette voie est devenue une cible thérapeutique majeure en oncologie. Cette étude est la première qui évalue le bénéfice thérapeutique de l’inhibition de la voie PI3K/mTOR pour des patients atteint de LMS. Nous avons mis en évidence qu’une double inhibition de PI3K et mTOR est associée à une activité antitumorale supérieure à celle observée avec une inhibition de PI3K ou mTOR seule. Nous avons également montré que l’inhibition de la voie PI3K/mTOR est associée à une activation paradoxale de la voie MAPK et qu’un ciblage concomitant de cette voie est associé à une synergie antitumorale in vitro et in vivo. Afin de caractériser les mécanismes de résistance secondaire à l’inhibition de la voie PI3K/mTOR, nous avons développé in vitro et in vivo un modèle de résistance secondaire à l’inhibiteur double cible PI3K/mTOR. Nous avons notamment détecté une sous-population de cellules résistantes à l’inhibiteur et ayant des caractéristiques proches de celles des cellules souches. Nous avons mis en évidence que l’inhibition pharmacologique d’EZH2, une protéine cruciale du complexe Polycomb, permet de restaurer la sensibilité des modèles résistants. Ces résultats apportent de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints de LMS. / Leiomyosarcomas (LMS) are tumors of mesenchymal origin characterized by a smooth cell differentiation. The PI3K/mTOR pathway has been shown to play a crucial role in the tumorigenesis of LMS. Several agents targeting this pathway are under clinical development for the treatment of solid tumors and hematological malignancies. We report here the first study evaluating its potential therapeutic benefit for patients with LMS. We have demonstrated that dual inhibition of PI3K and mTOR is associated with more effective antitumor activity than agents targeting PI3K or mTOR only. We have also shown that PI3K and mTOR inhibition is associated with a paradoxal activation of the MAPK pathway and that combined treatment with MEK inhibitor resulted in synergistic antitumor activity in vitro and in vivo. Moreover, we developed in vitro and in vivo resistant model to dual PI3K/mTOR inhibitor. Interestingly, we have found that a cancer stem cell-like subpopulation may be involved in treatment resistance. We have shown that pharmacological inhibition of EZH2, a crucial protein of the Polycomb complex, is able to reverse dual PI3K/mTOR inhibitor resistance in vitro and in vivo. These results provide new therapeutic strategies for patients with LMS.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le cancer papillaire de la thyroïde (CPT) est la tumeur endocrine la plus fréquente. Des anomalies moléculaires activant la voie des MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases) sont identifiées, de façon mutuellement exclusive, dans environ 70% des cas. Il s’agit de réarrangements chromosomiques, le plus souvent de type RET/PTC (10%), de mutations ponctuelles activatrices des trois isoformes de l’oncogène RAS (H, N et K-RAS) (10%), ou de l’oncogène B-RAF (50%). La mutation « hot spot » B-RAFV600E est la plus fréquemment identifiée, elle est associée à une plus grande agressivité clinique (diagnostic à un stade tardif, risque de récidives et de décès accru). Ces évènements moléculaires ont pour conséquence commune l’activation de la voie des MAPK, se traduisant en aval par la phosphorylation de MEK (Mitogen-activated Extracellular signal-Regulated Kinase) puis de ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase). Cette dernière est régulée négativement par des phosphatases, appartenant à la famille des Dual Specificity Phosphatases (DUSPs), d’expression ubiquitaire, et en particulier de deux phosphatases spécifiques de ERK, l’une cytoplasmique (DUSP6) et l’autre nucléaire (DUSP5). Nous avons fait l’hypothèse que ces phosphatases pouvaient être soit des gènes suppresseurs de tumeurs (leur perte d’expression conduisant à une augmentation de phosphorylation de ERK et une prolifération accrue), soit des marqueurs du degré d’activation de la voie MAPK dans le cadre d’une boucle de rétrocontrôle négatif. Ceci nous a conduits à analyser la régulation et l’expression de ces phosphatases dans trois modèles : la lignée cellulaire PCCL3 (thyroïde de rat), exprimant l’un des trois principaux oncogènes mutés dans les CPT (RET/PTC3 ou H-RASV12 ou B-RAFV600E) sous le contrôle d’un promoteur inductible par la doxycycline, des lignées cellulaires humaines dérivant de CPT et des CPT humains. (...) / Papillary thyroid cancer (PTC) is the most common endocrine malignancy. Mutually exclusive and activating alterations of the MAPK pathway (Mitogen-Activated Protein Kinases) are identified in 70% of cases. Common mutations found in PTCs are point mutation of the B-RAF (50%) and RAS genes (10%) as well as RET/PTC chromosomal rearrangements (10%). The hot spot B-RAFV600E mutation is the most frequently alteration identified and is connected with agressive clinical characteristics (high stage at diagnosis, high recurrence risk and death). These molecular events lead to constitutive activation of the MAPK pathway, resulting in MEK (Mitogen-activated Extracellular signal-Regulated Kinase) and ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase) phosphorylation. ERK is negatively regulated by phosphatases and among them, Dual Specificity Phosphatases (DUSPs), ubiquitary expressed, in particular two ERK-specific phosphatases DUSP5 (nuclear) and DUSP6 (cytosolic). We hypothesized that these phosphatases could have tumor supressor properties (i.e. their loss would be associated with an increase in MAPK pathway activation) or may serve as a surrogate marker of MAPK pathway activation in the context of a negative feedback loop. We analysed regulation and expression of both phosphatases in 3 models: three PCCL3 cell lines (rat thyroid cells) expressing one of the most common oncogene identified in PTCs (RET/PTC3 or H-RASV12 or B-RAFV600E) under the control of a doxycycline-inducible promoter, human PTC-derived cell lines and human PTC. We demonstrated that MAPK pathway activation was correlated with induction of DUSP5 and DUSP6. These phosphatases are involved in a negative feedback loop that contributes to a tight regulation of phospho-ERK levels. DUSP5 and DUSP6 mRNA are overexpressed in human PTCs, especially in B-RAF mutated tumors suggesting a higher MAPK signaling output in these agressive PTCs. Silencing of DUSP5 and/or DUSP6 by small interfering RNA does not affect proliferation of human B-RAFV600E thyroid carcinoma-derived cell lines, suggesting the lack of tumor suppressor gene role. Compensatory changes in expression of DUSPs when a specific one is inactivated may explain this lack of effect. On the opposite, a DUSP6 pharmacological inhibitor induced a concentration dependent decrease in proliferation of human B-RAFV600E cells, suggesting « off-target » effect of this inhibitor. In a second part, we analysed the regulation of DUSP5 expression, which is a target of the MAPK pathway activation. We demonstrated, using pharmacological inhibitors, that DUSP5 is an early response gene, regulated mostly by the MAPK pathway, at the transcriptional level. Two contiguous CArG boxes that bind serum response factor (SRF) were found in a 1Kb promoter region, as well as several E twenty-six transcription factor family binding sites (EBS). These sites potentially bind Elk-1, a transcription factor activated by ERK1/2. Using wild type or mutated DUSP5 promoter reporters, we demonstrated that SRF plays a crucial role in serum induction of DUSP5 promoter activity, the proximal CArG box being important for SRF binding in vitro and in living cells. Moreover Elk-1 was bound in vitro to a promoter region containing the proximal CArG box and a putative EBS. Its specific binding to SRF was necessary to elicit promoter response to dominant positive Elk-VP16 and to enhance the response to serum stimulation. Altogether our results suggest that the MAPK pathway is more active in B-RAFV600E PTC than in PTC with other genetic alteration and could explain their clinical agressivity. DUSP5 and DUSP6, as well as phosphorylated MEK, are markers of activation of the MAPK pathway. Neither phosphatase has tumor suppressor properties in our thyroid cancer cell models. Our results suggest redundancy and functional compensation among DUSPs. (...)

G protein-coupled receptors (GPCRs) form the biggest family of membrane receptors and are involved in numerous physiological processes. Collectively, these receptors are also prominently targeted by the pharmaceutical industry due to their implications in multiple diseases and disorders. GPCR signaling is tightly regulated. Several kinases, activated downstream of the receptor, initiate negative feedback loops; and arrestins play a crucial role in these regulatory processes by desensitizing the ligand–activated receptor and promoting its endocytosis. By doing so, arrestins control the duration and the amplitude of signal transduction at the cell surface. In the last few years, several non-canonical roles have also been attributed to arrestins, such as the post-endocytic activation of several signalling pathways, or the regulation of crosstalks between GPCRs and various other signalling events. My thesis project was aimed at providing a better understanding of the non-canonical functions of arrestins. The first objective of my research work was to investigate a possible reciprocal effect of the activation of the extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) on GPCR signaling. We demonstrated that stimulation of ERK1/2, either by a cell surface receptor or a constitutively active mutant, leads to a reduction in steady-state expression levels of many GPCRs at the cell surface. This receptor redistribution mechanism is dependent on beta-arrestins phosphorylation. In vitro kinase assays combined with complementation experiments in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) lacking beta-arrestins, revealed that beta-arrestin-2 phosphorylation on Ser14 and Thr276 is essential for the ERK1/2-promoted GPCR sequestration. This ERK1/2- and arrestins mediated regulatory process was found to result in a global dampening of cell responsiveness. The second objective of my research work was to identify and develop a small organic compound that inhibits the interaction between arrestins and the adaptor protein AP-2, without interfering with the recruitment of arrestin to the receptor. This inhibitor, named Barbadin, was found to specifically block endocytic processes that are dependent on the interaction between arrestins and the appendage domain of the b-subunit of AP-2. We demonstrated its value as an analytical tool in studying the role of the arrestins in GPCR signaling, such as cAMP production and ERK1/2 activation. These results support the concept that beta-arrestin/AP-2-dependent signaling is important to both G protein-dependent and -independent pathways. The third objective of my research work was to develop a BRET-based biosensor able to detect signal-dependent PTEN conformational changes. This biosensor was validated by monitoring PTEN activation induced by targeted mutations affecting key intramolecular interactions or by modulating signalling pathways that impact PTEN function. We also demonstrated the value of this biosensor in studying PTEN/protein interactions using two known interactors that activate PTEN, beta-arrestin-2 and RhoA. Finally, we uncovered PTEN activation by several GPCRs, previously unknown as PTEN regulators. Given the central role of the tumor suppressor PTEN in oncogenesis, this biosensor could also provide a precious tool for anti-cancer drug research. To conclude, my research work highlighted non-canonical mechanisms for arrestins to activate GPCR-dependent signaling pathways, such as cAMP, ERK1/2 and PTEN, as well as negatively regulate GPCR signaling upon phosphorylation by ERK1/2. This work was made possible by the development of new tools: a beta-arrestin inhibitor named Barbadin and a PTEN BRET-based biosensor that have both shown their usefulness in studying beta-arrestin noncanonical signaling. / Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de récepteurs membranaires et sont impliqués dans un grand nombre de processus physiologiques. Cette famille de récepteurs constitue aussi une cible majeure dans la recherche pharmaceutique au vu de son importance dans de nombreuses pathologies. La signalisation des RCPG est étroitement régulée. Plusieurs kinases activées en aval du récepteur initient des boucles de régulation négative. Les arrestines jouent un rôle clé dans ces processus de régulation en favorisant la désensibilisation du récepteur activé par le ligand, suivie de son endocytose. Ainsi, les arrestines contrôlent la durée et l’amplitude de la transmission du signal à la surface de la cellule. Ces dernières années, plusieurs rôles non-canoniques ont été attribués aux arrestines comme l’activation de voies de signalisation post-endocytiques, ou la modulation de la régulation croisée entre les RCPG et d’autres acteurs de la signalisation cellulaire. Le premier objectif de mon travail de recherche est d’examiner l’effet réciproque de l’activation des kinases ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1/2) sur la signalisation des RCPG. Nous avons démontré que la stimulation de ERK1/2, soit par un récepteur de surface soit par l’utilisation d’un mutant constitutivement actif, conduit à la baisse de l’expression de surface basale de nombreux RCPG. Des essais kinases in vitro, combinés à des expériences de complémentation dans des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), où les gènes beta-arrestine-1/2 ont été supprimés, démontrent l’importance de la phosphorylation par ERK1/2 des résidus Ser14 et Thr276 dans ce mécanisme de séquestration des RCPG. Cette régulation, contrôlée par ERK1/2 et arrestine, conduit à une baisse globale de la capacité de réponse de la cellule aux stimuli extracellulaires. Le deuxième objectif de mon travail de recherche est d’identifier et de développer une petite molécule organique qui inhibe l’interaction entre l’arrestine et la protéine adaptatrice du complexe d’endocytose AP-2, sans toutefois empêcher la formation du complexe arrestine/récepteur. Cet inhibiteur, nommé Barbadin, bloque sélectivement les processus d’internalisation dépendants de l’interaction entre arrestine- et la sous-unité beta2 de la protéine adaptatrice AP-2. Barbadin représente le premier inhibiteur des fonctions d’arrestine, et nous avons démontré son utilité comme outil analytique pour déterminer la contribution des arrestines dans l’activation de plusieurs voies de signalisation en aval des RCPG, telles que la production d’AMP cyclique (AMPc) ou l’activation des kinases ERK1/2. Nos résultats démontrent l’importance du complexe arrestine/AP-2 dans la signalisation dépendante et indépendante des protéines G. Le troisième objectif de mon travail de recherche est de développer un biosenseur BRET capable de mesurer les changements de conformation du suppresseur de tumeur PTEN. Nous avons validé ce biosenseur en mesurant l’activation de PTEN suite à des mutations ciblées déstabilisant les interactions intramoléculaires au sein de cette protéine ou en modulant différentes voies de signalisation qui affectent sa fonction. Nous avons démontré l’intérêt de ce nouvel outil dans l’étude des interactions entre PTEN et des partenaires protéiques, en utilisant deux interacteurs connus pour activer PTEN : b-arrestine-2 et RhoA. Finalement, en utilisant ce biosenseur, nous avons démontré pour la première fois la capacité de plusieurs RCPG à induire l’activation de PTEN. Étant donné le rôle central de PTEN dans le développement tumoral, ce biosenseur constitue aussi un outil précieux pour la recherche de nouveaux médicaments anticancer. Ainsi, au travers de ces trois lignes directrices, nous avons pu mettre en lumière de nouveaux rôles non-canoniques des arrestines, soit dans l’activation de voies de signalisation, (comme la production d’AMPc, l’activation de ERK1/2 ou de PTEN), soit comme régulateur négatif de la signalisation des RCPG après phosphorylation par ERK1/2. Ce travail a été rendu possible par le développement de nouveaux outils pour l’étude des RCPG : un inhibiteur de beta-arrestine, Barbadin, et un biosenseur BRET de PTEN ; tous deux ayant démontré leur utilité dans l’étude des voies de signalisation non-canoniques des arrestines.