Die Aktivierung von Endothelzellen durch Bakterien und ihre Produkte trägt wesentlich zur Ausbildung klinischer Symptome in bakteriellen Infektionen bei. Die Freisetzung von Chemo- und Zytokinen führt im Konzert mit der Expression von Adhäsionsmolekülen durch das Endothel zur Rekrutierung und Aktivierung von Granulozyten. Zur Regulation der Entzündungsreaktion tragen parakrine und systemische Effekte, ausgelöst durch die Liberation von vasoaktiven Substanzen und Zytokinen durch Endothelzellen, bei. Der Zusammenbruch der endothelialen Barrierefunktion, gekennzeichnet durch den Verlust der Permselektivität der endothelialen Grenzschicht, verursacht Ödembildung. In dieser Arbeit wurde die molekulare Interaktion von Bakterien und ihren Produkten mit Endothelzellen untersucht. Effekte auf die Rekrutierung von Granulozyten und die endotheliale Barrierefunktion wurden charakterisiert. Dabei konnten aktivierte Signalwege identifiziert werden. Darauf basierend folgte die Entwicklung erster therapeutischer Ansätze. Zusammengefasst erbrachten diese experimentellen Untersuchungen neue Erkenntnisse zum Verständnis der Bakterien-Endothel Interaktion. / Activation of endothelial cells by bacteria and their products contributed significantly to clinical signs of bacterial infections. Liberation of chemo- and cytokines in concert with expression of adhesion molecules by the endothelium resulted in recruitment of granulocytes. Paracrine and systemic effects of vasoactive agents and cytokines secreted by endothelial cells contributed the regulation of inflammation. Loss of endothelial barrier function induced edema formation. This postdoctoral lecture qualification addressed the molecular interaction of bacteria and their products with endothelial cells. The recruitment of granulocytes, the regulation of endothelial barrier function and activated signalling pathways in endothelial cells were analyzed. Based on these experiments new therapeutic strategies have been tested. In summary, extended these experimental investigations the understanding of bacterial-endothelial interaction.

Ischemia followed by reperfusion, as happens in myocardial infarction, or the development of acute respiratory distress syndrome, are associated with a exaggerated extravasation of leukocytes into the surrounding tissue , which may cause severe bystander damage. In animal models of these diseases, pharmacological blockage of the leukocyte adhesion molecule, L-selectin (CD62L), has been shown to be partially protective by reduction or inhibition of leukocyte-mediated secondary tissue damage. The aim of this project was the development of an in vitro assay to investigate the relative effectiveness of potential L-selectin antagonists. Ideally, the assay should require low sample volumes and allow for measurements of larger series of reagents. The assay system investigated was based on the homotypic granulocyte aggregation under shear stress, which mimicks the L-selectin-dependent adhesion of leukocytes to previously arrested neutrophils on vascular endothelium. After optimizing numerous variables of the aggregation assay, the requirement of L-selectin for the homotypic granulocyte aggregation induced was demonstrated by inhibition experiments using soluble L-selectin or monoclonal antibodies directed against the lectin domain of L-selectin. Several carbohydrate polymers with L-selectin binding properties, such as the seaweed-derived fucose polymer fucoidin, high-molecular-weight dextran sulfate or heparin, also inhibited neutrophil aggregation in a dose-dependent fashion. However, despite employing a flow cytometry-based read-out technique, the assay remained extremely labor intensive, precluding investigations of extended series. Therefore, the homotypic aggregation experiments with freshly isolated human granulocytes remains a useful tool to further evaluate specific questions of L-selectin dependent adhesion processes, but it is not apt for transfer into routine laboratories.

Die vorliegende Habilitationsschrift faßt publizierte Ergebnisse zum Themenschwerpunkt der Immunszintigraphie mit Antigranulozyten-Antikörpern bzw. Antikörperfragmenten zur Entzündungsdiagnostik bei Problemindikationen und zur Knochenmarkszintigraphie zusammen. In der Diagnostik der subakuten Endokarditis und der Prothesenendokarditis ermöglichen Immunszintigraphie mit dem NCA-95-Antigranulozyten-Antikörper und die transösophageale Echokardiographie zusammen einen zuverlässigen Entzündungsnachweis auch bei denjenigen Patienten, bei denen jeweils eine der beiden Methoden versagt. Bei Patienten mit Fieber unbekannter Genese ist die Immunszintigraphie der Sonographie und dem CT im frühen Nachweis abdomineller Abszesse überlegen. Bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen stellt der szintigraphische Ausschluß entzündlicher Herde eine wichtige Information auf dem Weg zur Diagnose einer seronegativen Autoimmunerkrankung dar. Schließlich erlaubt die Immunszintigraphie mit differenzierter Betrachtung photopenischer Läsionen im hämopoetisch aktiven Knochenmark bei Patienten mit einer metastasierenden neoplastischen Erkrankung als Fieberursache einen frühen Nachweis maligner Knochenmarkherde. Für die Diagnostik entzündlicher Darmerkrankungen sind die immunszintigraphischen Verfahren mit dem NCA-95-Antigranulozyten-Antikörper und mit dem NCA-90-Antigranulozyten-Antikörper-Fab'-Fragment wegen bei beiden Methoden vorliegender unspezifischer Darmaktivität und fallweise beobachteter, falsch negativer Ergebnisse nicht geeignet. Bei Patienten mit Low-grade-Entzündungen der Knochen und Gelenke und vorangegangenen Gelenkoperationen weist die Immunszintigraphie mit dem NCA-90-Antigranulozyten-Antikörper-Fab'-Fragment eine überaus hohe Sensitivität, jedoch geringe Spezifität auf. Der klinische Nutzen dieser Immunszintigraphie könnte im Nachweis oder Ausschluß einer Low-grade-Entzündung im untersuchten Gelenk bei Patienten mit rheumatoider Arthritis oder anderen, zeitgleich vorliegenden Entzündungen außerhalb des Gelenkes liegen. In der Knochenmarkdiagnostik mittels der Immunszintigraphie mit dem NCA-95-Antigranulozyten-Antikörper wurde eine hoch signifikante inverse Korrelation des Uptake-Index mit dem Alter der Probanden festgestellt. Bei Patienten mit Panzytopenie war der Uptake-Index im Vergleich zum altersentsprechenden Normalkollektiv signifikant erniedrigt und wies eine hohe Trennschärfe gegenüber dem Normalbereich auf. Als Alternative zum NCA-95-Antigranulozyten-Antikörper untersuchten wir die Immunszintigraphie mit dem NCA-90-Antigranulozyten-Antikörper-Fab'-Fragment in der Knochenmarkdiagnostik. Das Verfahren gestattet jedoch nur eine qualitative, unvollständige Darstellung einiger Areale hämopoetisch aktiven Knochenmarks, während der Fab'-Knochenmark-Uptake-Index für die klinische Anwendung nicht brauchbar ist. / The present habilitation thesis summarises the author´s own published results on the thematic focus of immunoscintigraphy using antigranulocyte antibodies or antibody fragments for diagnosing infection in problematic indications and for bone marrow scintigraphy. In diagnosing subacute infective endocarditis and prosthetic valve endocarditis the combined application of both immunoscintigraphy using the NCA-95-antigranulocyte antibodies and transesophageal echocardiography reliably proves infection even in patients with negative results in one of the methods applied. In patients with fever of unknown origin immunoscintigraphy is superior to both sonography and CT in the early detection of abdominal abscesses. In patients suffering from autoimmune diseases the scintigraphic exclusion of infection is an important step towards verifying a serologically negative autoimmune disease. Finally, immunoscintigraphy with differentiated analysis of photopenic lesions in the haemopoietically active bone marrow allows an early detection of malignant marrow involvement in patients with metastasising neoplastic disease. Immunoscintigraphy with either NCA-95-antigranulocyte antibodies or NCA-90-antigranulocyte antibody Fab´-fragments is not suitable for diagnosing inflammatory bowel disease because of nonspecific bowel activity encountered in either method and because of falsely negative results observed occasionally. In patients with low-grade bone-and-joint infection and previous joint surgery immunoscintigraphy using the NCA-90-antigranulocyte antibody Fab´-fragment is highly sensitive but lacks specificity. The clinical benefit of this method might consist of proving or excluding low-grade infection in the investigated joint in patients suffering from rheumatoid arthritis or other, contemporaneous inflammation outside of the joint under investigation. In investigating bone marrow diseases with the help of immunoscintigraphy using NCA-95-antigranulocyte-antibodies a highly significant inverse correlation of the uptake index with patient age was observed. In patients with pancytopenia the uptake index was significantly lower than in an age-matched normal group and displayed a clear-cut differentiation from the normal uptake range. The NCA-90-antigranulocyte antibody Fab´-fragment was investigated as an alternative to the NCA-95-antigranulocyte-antibody in diagnosing bone marrow disease. However, this method allows just a qualitative, incomplete evaluation of certain bone marrow regions, while the Fab´ uptake index is not suitable for clinical use.

Bei der Wundheilung und fibrosierenden Prozessen sowie bei der Urtikaria ist eine Mastzellvermehrung bekannt. Mastzellen (MZ) üben bei der Urtikaria eine Schlüsselfunktion aus und scheinen auch zum Bindegewebsumbau beizutragen. In humanem Narbengewebe (5-369 Tage alt) wurden MZ-Zahlen und MZ-Subpopulationen mittels Enzym- und Immunhistochemie im Vergleich zu normaler Haut untersucht. Außerdem wurden in Gewebsextrakten Aktivität und mRNA-Expression der MZ-Proteasen und in vitro ihre mitogene Wirkung auf Fibroblasten und Keratinozyten bestimmt. Zur Klärung von Mechanismen, die zur MZ-Vermehrung beitragen könnten, analysierten wir die Expression von MZ-Chemoattraktoren und MZ-Wachstumsfaktoren sowie ihrer Rezeptoren in humanem Narbengewebe (a), läsionaler und nicht-läsionaler Urtikariahaut (b) und in normaler Haut (c): SCF, c-Kit, NGF-R TrkA, NGF-R p75, GM-CSF, GM-CSF-R (a, b, c); NGF, TGF-(, TGF-(-R I, TGF-(-R II (a,c) mittels Immunhistochemie (a, b, c) und RT-PCR (a, c). Zusätzlich wurde die Expression der proentzündlichen Zytokine IL-3, -8, TNF-( untersucht (b, c). Tryptase und Chymase enthaltende MZ waren in Narben gegenüber normaler Haut signifikant vermindert ebenso wie Chymaseaktivität und -mRNA-Expression in Narbengewebsextrakten. Die Anzahl Tryptase-haltiger MZ war unverändert, obwohl Tryptaseaktivität und -mRNA in Narben vermehrt waren. Beide Proteasen erhöhten in vitro die mitogene Antwort von Fibroblasten, jedoch nicht von Keratinozyten. c-Kit+-MZ fanden sich in der mittleren und tiefen Dermis von Narben signifikant vermehrt. SCF, TGF-(, TGF-(-R I und II, NGF-R p75 und TrkA zeigten sich sowohl immunhistochemisch als auch in der RT-PCR in Narbengewebe hochreguliert im Vergleich zu normaler Haut, wohingegen NGF, GM-CSF und GM-CSF-R nur schwach exprimiert waren ohne Unterschied zwischen beiden Geweben. Mittels FACS-Analyse wurde erstmalig die Expression von TGF-(-R I und II auf isolierten Haut-MZ nachgewiesen. Im Gegensatz zu diesen Befunden waren in Urtikariagewebe SCF- und NGF-R p75-exprimierende Zellen vermindert im Vergleich zu normaler Haut. Die Zahl von c-Kit+-, NGF-R TrkA+-, GM-CSF+- und GM-CSF-R+ -Zellen zeigte sich unverändert. Hingegen war die Expression von IL-3 und TNF-( auf Endothelzellen in läsionaler und nicht-läsionaler Urtikariahaut signifikant hochreguliert. Die dargestellten Ergebnisse mit signifikanter Verminderung von Chymase- und Tryptase-haltigen MZ in humanem kutanen Narbengewebe sprechen für MZ-Degranulation nach Trauma. Nachfolgend findet sich in Narbengewebe eine Chymase--, Avidin--, Tryptase+-, c-Kit+-MZ-Subpopulation, am ehesten Folge einer Einwanderung und Proliferation von unreifen MZ oder MZ-Vorläufern, die von den vermehrt exprimierten Wachstumsfaktoren SCF und TGF-(, eventuell auch von NGF über seine vermehrt exprimierten Rezeptoren, induziert werden könnten. Neben NGF und TGF-( scheint auch SCF eine Rolle bei der Wundheilung zu spielen. Bei entzündlichen Hautkrankheiten unterschiedlicher Prägung wie Wundheilung und Urtikaria liegen offenbar verschiedenartige Regulationsmuster der MZ-Proliferation und -Differenzierung vor. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass bei Trauma Feedbackmechanismen über Wachstumsfaktoren wie SCF, TGF-( und NGF und ihre Rezeptoren auf MZ ablaufen, bei der Urtikaria unter Mitberücksichtigung bereits bekannter Daten aus der Literatur vorzugsweise über eine Interaktion von Mast- und Endothelzellen. / In wound healing and fibrosing processes as well as in urticaria an increase of mast cells (MC) has been observed. MC are key-players in urticaria, and might also contribute to tissue repair. In human cutaneous scar tissue (5-369 days old) and normal skin MC dynamics and MC subtypes were analysed by enzyme- and immunohistochemistry. Moreover, the activity of the MC proteases in extracts of both tissues and their in vitro effect on the mitogenesis of fibroblasts and keratinocytes were assessed. To elucidate mechanisms involved in mast cell accumulation, expression of MC chemotaxins, MC growth factors and their receptors was evaluated comparing cutaneous scar tissue (a), lesional and non-lesional skin of urticaria (b) and normal skin (c): SCF, c-Kit, NGF-R TrkA, NGF-R p75, GM-CSF, GM-CSF-R (a, b, c); NGF, TGF-(, TGF-(-R I, TGF-(-R II (a,c) by immunohistochemistry (a, b, c) and by RT-PCR (a, c). Additionally, expression of proinflammatory cytokines (IL-3, -8, TNF-() was studied (b, c). Tryptase and chymase containing MC were markedly decreased in scars as well as chymase activity and mRNA expression, whereas overall numbers of tryptase containing MC did not differ from those in normal skin, although tryptase activity and mRNA expression were increased in scar extracts. Both proteases induced a dose-dependent mitogenic response in 3T3-fibroblasts, but not in HaCaT-keratinocytes. Numbers of c-Kit+ MC were significantly increased in the mid and lower dermis of scars. Furthermore, SCF, TGF-(, its receptors I and II, the NGF-R p75 and TrkA were shown to be upregulated in scars both by immunohistochemistry and by RT-PCR, while NGF, GM-CSF and the GM-CSF-R were only weakly expressed without differences between scar and normal tissue. In addition, expression of TGF-(-R I and II could be shown on isolated human skin MC by FACS-analysis. In contrast to these findings, SCF- and NGF-R p75-expressing cells in urticaria tissue were downregulated compared to normal skin. Numbers of c-Kit+, NGF-R TrkA+, GM-CSF+ and GM-CSF-R+ cells remained unchanged. However, IL-3 and TNF-( expression was upregulated on endothelial cells in lesional and non-lesional skin of urticaria. These data show that numbers of resident MCTC are very low in human cutaneous scars suggesting massive mediator release from these cells after wounding. Instead, scar tissue is populated by a chymase-, avidin-, tryptase+, c-Kit+ MC subpopulation that is reflecting most probably an immigration and / or proliferation of immature MC and their precursors which might be promoted by SCF and TGF-beta, possibly also NGF via its receptors. Next to TGF-( and NGF, also SCF seems to play a role in wound healing. Our findings suggest different regulation patterns of MC increase in inflammatory conditions of the skin. After wounding, feedback mechanisms via growth factors (SCF, TGF-(, possibly NGF) and their receptors on MC could be operative, while in urticaria in accordance with data from the literature interactions between MC and endothelial cells appear to be essential.

Zusätzlich zu seiner Funktion innerhalb des Gerinnungssystems vermittelt Thrombin inflammatorische Reaktionen. Mastzellen (MZ) sind durch die Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren wie Maus-Mastzell Proteasen (MCPTs mouse mast cell proteases auch als mMCPs bekannt), Zytokinen und Chemokinen. charakterisiert. Da Thrombinrezeptoren, auch als Proteinase-aktivierbare Rezeptoren (PAR) bekannt, von MZ exprimiert werden, wurde untersucht ob eine MZ-Aktivierung über die Thrombin/PAR Interaktion bei einer dermalen Entzündung eine Rolle spielt. Die intrakutane Injektion von Thrombin in die Ohren von C57BL/6 Kit+/+ Mäusen löste eine sofortige kutane Entzündung, einhergehend mit einer starken Ohrschwellung, aus. Im Vergleich dazu war diese Schwellung in MZ-defizienten C57BL/6 KitW-sh/W-sh Mäusen deutlich stärker, was darauf hindeutet, dass MZ anti-inflammatorisch wirken. Die lokale Rekonstitution von C57BL/6 KitW-sh/W-sh Mäusen mit knochenmarksgenerierten MZ normalisierte diesen Effekt. Die quantitative histomorphometrische Untersuchung der MZ bestätigte zusätzlich eine starke Degranulation der MZ nach Thrombininjektion nach. PCR-Analysen der MZ wiesen die Expression aller bekannten Thrombin-Rezeptoren. Die Stimulation mit verschiedenen Konzentrationen von Thrombin oder PAR-agonistischen Peptiden führte zu einer dosis-abhängigen Degranulation der MZ, was nahe legt, dass die Degranulation der MZ für die Limitierung der thrombin-induzierten Entzündung nötig ist. Gestützt wird die Hypothese durch die Tatsache, dass Zellkulturüberstand von degranulierten MZ zu einer Inaktivierung der Thrombinaktivität führt. Des Weiteren führte die Injektion von Thrombin in die Ohren von MCTP4-defizienten Mäusen zu einer deutlich erhöhten Ohrschwellung im Vergleich zur korrespondierenden Wildtyp-Maus. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass die sofortige thrombin-induzierte Entzündungsreaktion durch kutane MZ kontrolliert wird. Dieser Mechanismus wird teilweise durch MCPT4 vermittelt. / In addition to its function in the coagulation system, thrombin mediates inflammatory reactions. Mast cells (MCs) are characterized by releasing inflammatory mediators like mouse mast cell proteases (MCPTs, also designated mMCPs), cytokines, and chemokines, upon activation. Since thrombin-receptors, also known as Proteinase-activated receptors (PAR), are expressed by MCs, it was questioned whether MC activation via the thrombin/PAR axis plays a role in skin inflammation. Intracutaneous injection of thrombin in ears of C57BL/6 Kit+/+ mice induced immediate inflammatory skin reactions associated with a distinct ear swelling. This swelling was more pronounced in MC-deficient C57BL/6 KitW-sh/W-sh mice, indicating that MCs are anti-inflammatory, local reconstitution of C57BL/6 KitW-sh/W-sh mice with C57BL/6 Kit+/+ bone marrow-derived MCs normalized this effect. Additionally thrombin injection resulted in a strong degranulation of MCs assessed by quantitative histomorphometry. PCR analysis of MCs displayed expression of all known thrombin receptors. Stimulation with thrombin or PAR agonistic peptides resulted in a dose-dependent degranulation of MC, suggesting MC degranulation could be necessary for the limitation of thrombin-induced inflammatory responses. Supporting this hypothesis, supernatant from degranulated MCs inactivated thrombin activity. Furthermore, injection of thrombin in ears of C57BL/6 MCPT4-deficient mice, resulted in markedly increased ear swelling compared to the corresponding wild type mice. Together our results suggest that thrombin-induced immediate inflammatory skin reactions are controlled by cutaneous MCs, a mechanism partly mediated via MCPT4.

Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits bestehender Vaskulatur, ist ein Prozeß, der sowohl unter physiologischen Bedingungen abläuft, wie bei der Embryonalentwicklung und der Wundheilung, als auch unter pathologischen Bedingungen, wie der diabetischen Retinopathie und dem Wachstum und der Metastasierung solider Tumoren. Chronische Entzündungen wie die Atherosklerose und die Rheumatoide Arthritis gehen ebenfalls mit angiogenetischen Prozessen einher. Die Angiogenese ist ein stark regulierter Vorgang, der Migration, Proliferation und Differenzierung der Endothelzellen erfordert. Die Fähigkeit zur Migration ist eine wichtige biologische Funktion der Endothelzellen. Das Ziel dieser Arbeit bestand daher in der Untersuchung der Einflüsse verschiedener Zytokine auf die Endothelzellmigration und in der Charakterisierung daran beteiligter Mechanismen der Signaltransduktion. Dabei erwies sch Leptin als ein potenter Stimulus der Endothelzellmigration. Die Migration endothelialer Zellen nach Stimulation mit chemotaktischen Faktoren wie Leptin und VEGF wird durch die Aktivierung der Proteinkinasen ERK-MAPK und Akt vermittelt, deren pharmakologische Inhibition eine signifikante Hemmung der Migration bewirkte. Die antidiabetischen Thiazolidinedione Troglitazone und Ciglitazone hemmten die Leptin-induzierte Endothelzellmigration durch die Inhibition der Proteinkinase Akt, hatten aber keinen Einfluß auf die Aktivierung der ERK-MAP-Kinase. Dieses Ergebnis zeigt, dass die ERK-MAP-Kinase und die Proteinkinase Akt zwei voneinander unabängige Wege der Signaltransduktion darstellen, deren jeweilige Aktivierung für die Migration von Endothelzellen erforderlich, aber nicht ausreichend ist. Die proinflammatorischen Mediatoren TNF alpha und CD40L hemmten die VEGF-induzierte Migration humaner Endothelzellen bei Inkubation der untersuchten Zellen über 24 h signifikant. Auch bei kurzzeitiger Stimulation über 5 h steigerte TNF alpha die Rate migrierter Endothelzellen nicht. Diese Beobachtung steht im Widerspruch zur angenommen Assoziation entzündlicher und angiogenetischer Prozesse. In der vorliegenden Arbeit wird zum ersten Mal gezeigt, dass Antidiabetika aus der Gruppe der PPAR gamma-Liganden die Endothelzellmigration direkt hemmen. Dies weist auf eine mögliche Erweiterung des therapeutischen Einsatzes der Thiazilodinedione bei Patienten mit NIDDM und sekundären Symptomen wie der diabetischen Retinopathie hin. / Angiogenesis, the formation of new blood vessels from the preexisting vasculature, is a process involved in physiologic conditions, such as embryonic development and woundhealing, as well as in pathologic conditions, such as diabetic retinopathy and growth and spreading of solid tumors. Chronic inflammation such as atherosclerosis and rheumatoid arthritis is also associated with angiogenic processes. Angiogenesis is a tightly regulated process that requires migration, proliferation and differentiation of endothelial cells. Cell migration is a very important biologic function of the endothelial cell. The aim of this study was therefore to investigate the impact of various cytokines on endothelial cell migration and to characterize the chemotactic signal transduction pathways involved in this process. Leptin, the product of the ob-gene, proved to be a potent stimulus of endothelial cell migration. The actvation of the protein kinases ERK-MAPK and Akt is critical for endothelial cell migration, and their pharmacological inhibition caused a significant down-regulation of the migratory response towards migration factors such as Leptin and VEGF. The antidiabetic thiazolidinediones Troglitazone and Ciglitazone inhibited the leptin-induced endothelial cell migration by interfering with the cytosolic protein kinase Akt. They did not exert any influence on the activation of the ERK-MAPK. These findings prove the existence of two different, independent ways of signal transduction involved in endothelial cell migration: The ERK-MAPK and the protein kinase Akt. The activation of either kinase is necessary, but not sufficient to induce a migratory response in human endothelial cells. The proinflammatory mediators TNF alpha and CD40L caused a significant inhibition of endothelial cell migration in response to VEGF, when they were added to the culture medium for 24 h. TNF alpha did not stimulate the migration of endothelial cells, even when administered during a comparable short period of 5 h. This observation is in contrast with the postulated association of inflammatory and angiogenic proceses. In conclusion, the results of this study show for the first time a direct inhibition of leptin-induced endothelial cell migration by antidiabetic drugs belonging to the PPAR gamma-ligand-family through their inhibitory effect on Akt. This possibly broadens the spectrum of therapeutic applications of the antidiabetic thiazolidinediones in patients suffering from NIDDM and secondary complications such as diabetic retinopathy.

5-Oxo-ETE ist ein chemotaktischer Faktor für Granulozyten, der von der NADP+-abhängigen Dehydrogenase 5h-dh aus dem 5-Lipoxygenaseprodukt 5-HETE gebildet wird. Ziel dieser dreiteiligen Studie war es, die der 5-oxo-ETE-Produktion zugrunde liegenden Regulationsmechanismen aufzuklären. I. Einfluß von myeloider Zelldifferenzierung auf die Expression von 5h-dh in HL-60 und U-937 Zellen. Undifferenzierte HL-60 und U-937 Zellen produzieren vergleichbare Mengen von 5-oxo-ETE wie Monozyten oder Granulozyten. Differenzierung von U-937 Zellen mit PMA verdreifacht die Enzymaktivtät von 5h-dh, während die Behandlung von HL-60 Zellen mit dh-VitD3 diese verdoppelte. Der Einfluß von PMA auf 5h-dh wurde darüber hinaus in Mikrosomen von U-937 Zellen untersucht. Die Behandlung PMA verdreifachte Vmax, liess aber KM unbeeinflußt. II. Regulation der 5-oxo-ETE-Produktion durch oxidativen Stress und Glukose. Da der GSH-Redoxzyklus die Produktion von NADP+ zur Folge hat, stimulierten die Hydroperoxide H2O2 und tBOOH die Synthese von 5-oxo-ETE in U-937 Zellen. Aufgrund seiner Verarbeitung durch den Pentosephosphat Zyklus, der NAD+ in NADPH umwandelt, inhibierte Glucose diesen Effekt von H2O2. Die Synthese von 5-oxo-ETE wurde durch H2O2 auch in humanem Monozyten, Lymphocyten und Thrombozyten, aber nicht in Neutrophilen angeregt. Im Gegensatz zu Monozyten zeigten sich Thrombozyten und Lymphozyten allerdings glukose-resistent. T-BOOH ehöhte auch die Produktion von 5-oxo-ETE nach Zugabe von Ionophore und Arachidonsäure zu mononukleären Blutzellen. III. 5h-dh-Expression in human Strukturzellen. Zunächst rasterten wir mehrere sekundäre Epithelzelllinien und fanden 5h-dh in allen Zellen. Drei Indizien lassen vermuten, daß die epithele 5h-dh der myeloiden entspricht: (i) die enzymatische Aktivtät liegt vor allem in der mikrosomalen Fraktion vor, (ii) bei dem Kofaktor handelt es sich um NADP+ und nicht um NAD+, und (iii) 5S-HETE ist das bevorzugte Substrat. Weitere Studien zeigten, daß auch primäre humane Aorta-Endothelzellen 5h-dh expremieren. Vergleichbar zu Entzündungszellen wird die Produktion von 5-oxo-ETE auch in Endothel- und in Epithelzellen durch oxidativen Stress angeregt. / 5-Oxo-ETE is a highly potent granulocyte chemoattractant that is formed by the NADP+-dependent dehydrogenase 5h-dh by oxidation of the 5-lipoxygenase product 5-HETE. The objective of this study was to investigate underlying regulatory mechanisms of 5-oxo-ETE production in human cells. This matter was addressed from three directions. I. Expression of 5h-dh in HL-60 and U-937 cells and its activity changes during myeloid cell differentiation. Undifferentiated U-937 and HL-60 cells produce similar amounts of 5-oxo-ETE compared to monocytes or neutrophils. Differentiation of U-937 cells with PMA resulted in a 3-fold increase in 5-oxo-ETE production. Similarly, incubation of HL-60 cells with dh-VitD3 induced a 2-fold increase in 5-oxo-ETE production. The impact of PMA on 5h-dh was also investigated in the microsomal fraction of U-937 cells and compared to neutrophil microsomes. PMA treatment leads to a increase of Vmax but does not affect KM. II. Regulation of 5-oxo-ETE by oxidative stress and glucose levels. We found that H2O2 and t-butyl hydroperoxide strongly stimulate 5-oxo-ETE formation by U-937 cells through the GSH redox cycle by providing NADP+. Glucose inhibited the response to H2O2 through its metabolism by the pentose phosphate pathway, which converts NADP+ back to NADPH. 5-Oxo-ETE synthesis was also strongly stimulated by hydroperoxides in blood monocytes, lymphocytes, and platelets, but not neutrophils. Unlike monocytic cells, lymphocytes and platelets were resistant to the inhibitory effects of glucose. 5-Oxo-ETE synthesis following incubation of peripheral blood mononuclear cells with arachidonic acid and calcium ionophore was also strongly enhanced by t-BOOH. III. Expression of 5h-dh in human structural cells. We screened several secondary epithelial cell lines and detected 5h-dh in all cell lines. Epithelial 5h-dh and the inflammatory cell 5h-dh are identical: (i) the enzymatic activity is localized in microsomes, (ii) the cofactor is NADP+, and (iii) 5S-HETE is the preferred substrate. We also found that primary human aortic endothelial cells express 5h-dh. 5-oxo-ETE production by both endothelial and epithelial cells is regulated by oxidative stress in a manner similar to inflammatory cells.

Peptiderge Mediatoren sind neben ihrer Funktion bei der Aufrechterhaltung der körpereigenen Homöostase unter physiologischen Bedingungen auch bei der Regulation pathopysiologischer und pathobiochemischer Prozesse chronisch-entzündlicher Erkrankungen maßgeblich beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde diese Rolle durch Untersuchung des Expressionsprofils peptiderger Mediatoren und ihrer Rezeptoren unter normalen Bedingungen charakterisiert und auf dieser Grundlage Veränderungen des Mediatorstoffwechsels bei entzündlichen Erkrankungen erfasst. Aufgrund der geringen Kenntnisse bezüglich der Rolle anti-inflammatorischer Mediatoren wurde dabei insbesondere die Expression und Genregulation des Mediators VIP und seiner Rezeptoren untersucht. Dabei wurden molekularbiologische Methoden verwandt, um definierte Rezeptoren für VIP und verwandte Mediatoren in den Atemwegen und der Haut zu identifizieren. Im Anschluss daran wurde anhand verschiedener entzündlicher Erkrankungen der oberen Atemwege nachgewiesen, dass sich das peptiderge Mediatorprofil krankheitsspezifisch ändert und diese Subgruppen-spezifischen Änderungen nicht als ein universelles Epiphänomen der Entzündungsreaktion zu sehen sind. Ebenso konnte die Veränderung der Genexpression von Rezeptoren für peptiderge Mediatoren untersucht werden, wobei am Beispiel der Hypoxie die Induktion eines in den Atemwegen exprimierten Rezeptors nachgewiesen wurde. Am Beispiel der atopischen Dermatitis konnte darüber hinaus bewiesen werden, dass die Expression von VIP-Rezeptoren im Rahmen einer allergischen Erkrankung vermindert sein kann. Letztlich wurden ebenfalls mit VIP interferierende Transduktionsmechanismen untersucht, wobei die genauen Interaktionen peptiderger Mediatoren mit diesen intrazellulären Molekülen im Rahmen entzündlicher Erkrankungen noch aufzuschlüsseln sind. Die Ergebnisse der vorliegenden kumulativen Arbeit weisen in ihrer Gesamtheit auf eine wesentliche Bedeutung neurogener Mediatoren für pathophysiologische Mechanismen allergisch-entzündlicher Erkrankungen der Atemwege und Haut hin und lassen zukünftige therapeutische Ansätze auf Basis neuro-immunmodulierender Mechanismen sinnvoll erscheinen. / Peptidergic mediators participate next to their physiological role for numerous aspects of systemic and local homeostasis also in the regulation of pathophysiological and pathobiochemical processes in chronic inflammatory diseases. In the present study this role was investigated by assessing the expression profiles of peptidergic mediators and their receptors under physiological conditions. Basing on these findings differences of the mediator expression in inflammatory diseases were examined. Due to the relatively little knowledge on the role of potentially anti-inflammatory mediators the expression and gene regulation of the mediator VIP und its receptors were analysed. In this respect molecular techniques were used to assess distinct receptors for VIP and related mediators in the airways and skin. IN a next Step inflammatory diseases of the upper respiratory tract were examined and it was shown that the peptidergic mediators profile changes in relation to the disease entity and that this disease subtype-specific change is not a universal epiphenomenon of the ongoing inflammation. Also, alterations in the gene expression of peptidergic mediator receptors were analysed. Using hypoxia as an example the gene induction of airway-expressed receptors was demonstrated in relation to this stimulus. In further studies involving atopic dermatitis tissues a down-regulation of VIP receptor expression was demonstrated for allergic inflammatory conditions. In a last step VIP interfering signal transduction mechanisms were examined and future studies need to be carried out to fully assess the regulation of these interactions in relation to chronic inflammatory processes. The present results demonstrate an important role of neurogenic mediators in the pathophysiology of allergic inflammatory diseases of the airways and the skin and point to a potential use of neuro-immunomodulation in the future therapy of these diseases.