Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

XerC et XerD, deux recombinases impliquées dans la recombinaison site spécifique, résolvent les multimères d’ADN en monomères. Cette réaction se produit au niveau du site dif du chromosome, et nécessite le domaine C-terminale de la protéine de division cellulaire FtsK. Caulobacter crescentus est une bactérie aquatique de type Gram-négative qui se retrouve dans plusieurs environnements. Elle présente un cycle cellulaire asymétrique avec deux types de cellules distinctes. Cette propriété peut être utilisée pour synchroniser la croissance d’une population bactérienne pour permettre l’étude de l’expression de gènes à travers le temps et les liens entre le cycle cellulaire et le développement de la bactérie. La liaison à l’ADN et la capacité de former des complexes covalents (phosphotyrosyl) avec le site dif de C. crescentus (ccdif) ont été testé pour les recombinases de C. crescentus (ccXerC et ccXerD). Les deux recombinases ont eu une meilleure liaison au demi-site gauche de ccdif et sont incapable d’effectuer une liaison coopérative, contrairement à ce qui se produit au niveau du site dif de E. coli. La formation de complexes covalents a été testé en utilisant des «substrats suicides avec bris» marqués à la fluorescence ainsi que des protéines de fusion (marquées ou non à la fluorescence). Des complexes ADN-protéines résistants à la chaleur et au SDS ont été observé lors de la réaction de ccXerC et ccXerD de type sauvage avec ccdif, mais pas lors de la réaction de mutants avec le même ADN. Des complexes covalents phosphotyrosine sont formés de façon plus efficace sur les substrats suicides avec un bris au niveau du brin supérieur que ceux ayant un bris au niveau du brin inférieur. Dans les deux cas, c’est ccXerC qui est resté lié de façon covalente à l’ADN de ccdif. / In most bacteria, the chromosomal dimer resolution process is mediated by two tyrosine recombinases, XerC and XerD, which bind cooperatively and perform the recombination reaction at the dif site near the terminus of replication. This reaction also requires the C-terminal domain of the cell division protein FtsK. Caulobacter crescentus is an aquatic Gram-negative bacterium found in various environments. This bacterium has an asymmetric cell cycle which can be used to synchronize cell growth in order to study the temporal expression of a gene and the interconnection between the cell cycle and development. The binding activity and the formation of phosphotyrosyl complex of the C. crescentus recombinases, ccXerC and ccXerD, were tested on the C. crescentus dif (ccdif) site. Both ccXerC and ccXerD bound preferentially to the left half-site of ccdif and showed reduced cooperative binding, unlike what was found with the E. coli dif site. Covalent complex formation activity was tested by using fluorescently labelled linear “nicked suicide substrates” and labelled proteins. Heat and SDS-resistant protein-DNA complexes were formed when both wild-type ccXerC and ccXerD reacted with ccdif but not in the presence of active-site tyrosine mutant proteins. Phosphotyrosine complexes formed on the top-nicked suicide substrate were found to be more efficient than on the bottom-nicked suicide substrates and surprisingly ccXerC remained bound to both top and bottom-nicked ccdif suicide substrates.

XerC et XerD, deux recombinases impliquées dans la recombinaison site spécifique, résolvent les multimères d’ADN en monomères. Cette réaction se produit au niveau du site dif du chromosome, et nécessite le domaine C-terminale de la protéine de division cellulaire FtsK. Caulobacter crescentus est une bactérie aquatique de type Gram-négative qui se retrouve dans plusieurs environnements. Elle présente un cycle cellulaire asymétrique avec deux types de cellules distinctes. Cette propriété peut être utilisée pour synchroniser la croissance d’une population bactérienne pour permettre l’étude de l’expression de gènes à travers le temps et les liens entre le cycle cellulaire et le développement de la bactérie. La liaison à l’ADN et la capacité de former des complexes covalents (phosphotyrosyl) avec le site dif de C. crescentus (ccdif) ont été testé pour les recombinases de C. crescentus (ccXerC et ccXerD). Les deux recombinases ont eu une meilleure liaison au demi-site gauche de ccdif et sont incapable d’effectuer une liaison coopérative, contrairement à ce qui se produit au niveau du site dif de E. coli. La formation de complexes covalents a été testé en utilisant des «substrats suicides avec bris» marqués à la fluorescence ainsi que des protéines de fusion (marquées ou non à la fluorescence). Des complexes ADN-protéines résistants à la chaleur et au SDS ont été observé lors de la réaction de ccXerC et ccXerD de type sauvage avec ccdif, mais pas lors de la réaction de mutants avec le même ADN. Des complexes covalents phosphotyrosine sont formés de façon plus efficace sur les substrats suicides avec un bris au niveau du brin supérieur que ceux ayant un bris au niveau du brin inférieur. Dans les deux cas, c’est ccXerC qui est resté lié de façon covalente à l’ADN de ccdif. / In most bacteria, the chromosomal dimer resolution process is mediated by two tyrosine recombinases, XerC and XerD, which bind cooperatively and perform the recombination reaction at the dif site near the terminus of replication. This reaction also requires the C-terminal domain of the cell division protein FtsK. Caulobacter crescentus is an aquatic Gram-negative bacterium found in various environments. This bacterium has an asymmetric cell cycle which can be used to synchronize cell growth in order to study the temporal expression of a gene and the interconnection between the cell cycle and development. The binding activity and the formation of phosphotyrosyl complex of the C. crescentus recombinases, ccXerC and ccXerD, were tested on the C. crescentus dif (ccdif) site. Both ccXerC and ccXerD bound preferentially to the left half-site of ccdif and showed reduced cooperative binding, unlike what was found with the E. coli dif site. Covalent complex formation activity was tested by using fluorescently labelled linear “nicked suicide substrates” and labelled proteins. Heat and SDS-resistant protein-DNA complexes were formed when both wild-type ccXerC and ccXerD reacted with ccdif but not in the presence of active-site tyrosine mutant proteins. Phosphotyrosine complexes formed on the top-nicked suicide substrate were found to be more efficient than on the bottom-nicked suicide substrates and surprisingly ccXerC remained bound to both top and bottom-nicked ccdif suicide substrates.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Chez les procaryotes, la réplication du chromosome peut entraîner la dimérisation des deux nouveaux chromosomes par recombinaison homologue. La fréquence de ce phénomène est particulièrement élevée dans la région du terminus de réplication du chromosome de E. coli, notamment aux sites Hot et TTiZ. Si le dimère chromosomique n'est pas résolu avant la partition dans les cellules-filles, il y aura filamentation cellulaire et aberration chromosomique. Pour contrer ce phénomène, E. coli a mis en place un système de résolution de dimères, soit le système de recombinaison spécifique de site Xer. Chez E. coli, ce système comprend les recombinases XerC et XerD et le site chromosomique dif situé dans la région du terminus de réplication. Les recombinases s'arriment d'abord aux sites dif des chromosomes formant le dimère, puis il y a coupure et échange des brins libérant ainsi les chromosomes à leurs formes monomères. La répartition de ce système de résolution de dimères est assez bien documentée parmi les bactéries Gram négatives. Cependant, peu d'études se sont penchées sur les bactéries Gram positives. Le but de notre étude est de détecter la présence de ce système chez treize espèces de bactéries Gram positives du groupe des bactéries lactiques, certaines étant très importantes dans l'industrie alimentaire. Plusieurs techniques ont été employées, dont l'hybridation Southern, l'amplification génique avec amorces dégénérées issues des séquences des recombinases déjà connues, l'amplification génique dite "inverse", ainsi que le séquençage. Nous avons également utilisé un programme informatique afin de dégager la phylogénie et les ressemblances entre les recombinases de Gram positives et entre celles-ci et les recombinases déjà connues des bactéries Gram négatives. Par hybridation Southern, nous avons réussi à démontrer la présence d'un site analogue au site dif de E. coli chez Lactobacillus casei. De plus, l'amplification génique avec amorces dégénérées a montré que cette dernière espèce ainsi que les espèces Lactobacillus plantarum souche 8014, Lactobacillus plantarum souche 14917 et Lactobacillus bulgaricus 737 possèdent toutes au moins une recombinase de type Xer. Nous n'avons pas obtenu de séquences pour les autres espèces de bactéries, peut-être à cause d'un manque d'homologie entre les amorces et l'ADN ciblé. Les régions amplifiées de ces quatre souches, correspondant à environ 430 pb du bout C-terminal de la recombinase, ont été séquencées, puis des amorces ont été fabriquées à partir de la séquence de L. casei. Ces amorces devaient amplifier les régions flanquant la séquence connue (amplification "inverse"), permettant ainsi d'obtenir une séquence complète du gène. Nous n'avons pas obtenu de résultats avec cette technique, peut-être à cause de la formation de boucles C-G dans l'ADN simple-brin lors de certains cycles de l'amplification. Les quatre séquences ont ensuite été comparées et une phylogénie a été établie. Nous avons trouvé que ces séquences formaient un groupe phylogénique fortement apparenté et qu'elles ressemblaient le plus aux séquences XerD des bactéries Gram négatives, ces dernières ressemblances surpassant même celles avec la recombinase XerD de la bactérie Gram positive B. subtilis. Ces derniers résultats suggèrent la possibilité d'une évolution différente des recombinases XerD à l'intérieur du groupe des Gram positives que nous avons examiné.

Chez les bactéries à chromosomes circulaires, le crossing-over introduit par la recombinaison homologue peut conduire à des échanges de chromatides soeurs. Des nombres impairs de ces échanges aboutissent à la dimérisation des deux chromatides nouvellement répliquées compromettant ainsi leur ségrégation. Par conséquent, la plupart des bactéries utilisent le système de recombinaison spécifique de site Xer pour convertir les dimères de chromosomes et de plasmides en monomères stables. Ce système comporte deux recombinases de la famille Tyrosine recombinase, XerC et XerD, agissant sur le site dif. Cependant, quelques ε-protéobactéries n’ont besoin que d'une seule recombinase XerH agissant sur un site difH. Il parait intéressant d’étudier le système de recombinaison XerH de Campylobacter jejuni, surtout que l'augmentation spectaculaire de l'incidence de campylobactériose est alarmante. Cette étude vise à mieux comprendre comment la protéine XerH catalyse la réaction de recombinaison au niveau du site difH en mettant en évidence les séquences indispensables pour la liaison et le clivage. Grâce à ces expériences, nous avons pu confirmer que XerH est capable de se lier à la séquence entière difH; XerH est capable de cliver les deux brins supérieurs et inférieurs de difH avec une réaction plus efficace au niveau du brin inférieur; les nucléotides conservés du site de liaison sont indispensables pour la réaction de liaison; la modification de la longueur de l’espaceur améliore la réaction de liaison et de clivage et les modifications apportées au site de clivage prédit ont aboli la réaction de liaison et affecté la réaction de clivage au niveau du brin supérieur et inférieur du site difH. Ces expériences aideront à comprendre comment la recombinase XerH/difH contrôle la résolution des dimères chromosomiques chez Campylobacter jejuni en identifiant les séquences et les facteurs indispensables pour qu’un certain système soit fiable. Notre étude représente un pas vers l’avant pour comprendre un mécanisme important chez un agent pathogène ayant un grand impact sur la santé publique. / In bacteria with circular chromosomes, cross-over induced by homologous recombination can lead to sister chromatid exchanges, odd numbers of these exchanges result in dimerization of the two newly replicated chromatids compromising their segregation. Therefore, most bacteria use the Xer site-specific recombination system to convert chromosomal and plasmid dimers into stable monomers. This system involves two recombinases of the Tyrosine recombinase family, XerC and XerD, acting at the dif site. However, some ε-proteobacteria require only one XerH recombinase acting on a difH site. It seems interesting to study the XerH recombination system of Campylobacter jejuni, especially since the dramatic increase in the incidence of campylobacteriosis is alarming. This study aims to better understand how the XerH protein catalyzes the recombination reaction at the difH site by identifying the sequences required for binding as well as the factors regulating this reaction. As a result of these experiments, we were able to confirm that XerH is able to bind to the entire difH sequence; it is able to cleave both the top and bottom strands of difH with a more efficient reaction at the bottom strand; The conserved nucleotides in the binding site are essential for the binding reaction, modification of the spacer length improves the binding and cleavage reaction, and modifications in the predicted cleavage site abolished the binding reaction and affected the cleavage reaction at both the top and bottom strands of the difH site.. These experiments will help to understand how the XerH/difH recombinase controls the resolution of chromosomal dimers in Campylobacter jejuni by identifying the essential sequences and factors required for a certain system to be reliable. Our study represents a step forward in understanding an important mechanism in a pathogen with great impact on public health.

L'état circulaire du chromosome bactérien pose un problème particulier lors de la réplication. Un nombre impair d'événements de recombinaison homologue donne des chromosomes dimères concaténés qui ne peuvent pas être divisés en cellules filles. Pour résoudre ce problème, les bactéries ont mis au point un mécanisme de résolution des dimères basé sur un système de recombinaison spécifique au site. Ceci est effectué par le système Xer/dif. Dans ce système, les protéines Xer effectuent une réaction de recombinaison dans le site dif au niveau du septum cellulaire immédiatement avant la division cellulaire. Dans la plupart des bactéries, cette réaction est effectuée par deux recombinases, XerC et XerD. Cependant, Streptococcus suis, un agent pathogène zoonotique important utilise un système de recombinaison différent, constitué d'une seule enzyme recombinase appelée XerS, qui catalyse la réaction de recombinaison dans un site dif non conventionnel. Pour caractériser le mode de clivage de XerS, des expériences EMSA ont été réalisées en utilisant des fragments de PCR marqués par HEX et des "suicide substrates". Nos données suggèrent que 1.) XerS est capable de lier la séquence entière de difSL; 2.) XerS lie plus efficacement le côté gauche des mutants difSL incomplets que le côté droit; 3.) XerS coupe les brins supérieur et inférieur du site difSL, avec une réaction plus efficace au bas. 4.) Modifications des nucléotides de la région la plus externe ou de la région centrale changent les préférences de clivage. 5.) XerS n'a montré aucune activité spécifique sur un autre site dif non conventionnel des Firmicutes, 6.) XerS interagit avec la sous-unité FtsK-y. L'ensemble des résultats présentés permet de mieux comprendre le fonctionnement de la recombinaison XerS dans le système de recombinase unique de Streptococcus et comment cette recombinaison est régulée par des facteurs de l'hôte. / The circular state of the bacterial chromosome presents a specific problem during replication. An odd number of homologous recombination events results in concatenated dimer chromosomes that cannot be partitioned into daughter cells. To solve this problem, bacteria have developed a mechanism of dimer resolution based on site-specific recombination system. This is performed by the Xer/dif system. In this system, the Xer proteins perform a recombination reaction in the dif site at the cell septum immediately prior to cell division. In most bacteria this reaction is performed by two recombinases, XerC and XerD. However, an important zoonotic pathogen; Streptococcus suis harbors a different recombination system, composed by a single recombinase enzyme called XerS, that catalyzes the recombination reaction in an unconventional dif site; difSL. A region characterized by two imperfect inverted repeat regions that flank a central region of 11 bp.To characterize the mode of cleavage of XerS, EMSA experiments were performed by using HEX-labelled PCR fragments and “nicked suicide substrates”. Our data suggests that; 1.) XerS is able to bind the entire difSL sequence; 2.) XerS binds more efficiently the left half side on incomplete difSL mutants than the right half side; 3.) XerS cleaves both the top and bottom strands of the difSL site, with a more efficient reaction at the bottom strand; 4.) Nucleotides at the outermost region of a T rich region seem to be determinant for binding selectivity and modifications of the extra spacing between the inverted repeat arms as well as length modifications of the central region change cleavage preference. 5.) XerS did not show any specific activity on another unconventional dif site in Firmicutes, as tested on difH. 6.) XerS interacts with FtsK-y subunit. This research aims to understand how XerS recombination works in the single recombinase system of Streptococcus and how this recombination is regulated by host factors. Exploration of these recombinases will provide a better understanding of the mechanisms of DNA exchange and genome stability in bacteria. It can also increase our knowledge of the evolution and speciation of recombinogenic bacteria.