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Thesis--Auburn University, 2009. / Abstract. Vita. Includes bibliographic references (p.64-77).

Fazemos parte de um cenário mundial em que o esgotamento das fontes de energias fósseis atrelado à poluição gerada por esse uso, preocupam os diferentes setores do comércio, da indústria, do governo e das instituições em defesa do meio ambiente. Nesse sentido, a busca por novas fontes energéticas renováveis tem dirigido diversas pesquisas, além de drenar bilhões de dólares em investimentos. Uma das linhas de pesquisa mais importantes é a da produção do etanol de segunda geração (2G), um etanol produzido a partir dos resíduos gerados na produção do etanol de primeira geração. No caso do Brasil, esses resíduos compreendem principalmente a palha e o bagaço de cana-de-açúcar; essa biomassa é formada majoritariamente por celulose (∼45%), hemicelulose (∼25%) e lignina (∼20), e sua hidrólise envolve pré-tratamentos adequados e uso de enzimas que agem especificamente em seus alvos. Dessa forma, a produtividade de etanol aumenta, sem necessariamente ampliar áreas de cultivo. Essa vertente é muito promissora, porém os custos ainda são relativamente altos e a aplicabilidade depende bastante de adaptações do setor industrial e aprimoramentos na produção em si (atividade específica das enzimas e sua ação sinérgica). O objetivo principal deste projeto é reconhecer e mapear as bases moleculares que comandam a atividade da enzima xilose isomerase (XI), que converte xilose (presença majoritária na hemicelulose) em xilulose, possibilitando a utilização desta por Saccharomyces cerevisiae (já que a xilose não é fermentescível), para obtenção do etanol de segunda geração como produto final. Para isso, foi realizada uma busca extensiva de genes de diversos microrganismos, que codifiquem para XI, e que essas ainda não possuam estruturas resolvidas publicadas. A maioria das ORFs (Open Reading Frame, do inglês), ou regiões codificadoras, foram amplificadas, clonadas em vetores específicos e transformadas em bactérias Escherichia coli Rosetta (DE3). Parte dessas cepas transformadas resultaram na produção da XI de interesse. Com isso, foi possível obter cristais e iniciar a resolução de estruturas cristalográficas. Esses resultados foram cruzados e correlacionados com os de atividade enzimática, cinética química e estabilidade térmica, fornecendo boa perspectiva para o entendimento das bases moleculares que regem a atividade xilose isomerásica. / We are part of a world scenario in which the depletion of fossil energy sources linked to the pollution generated by this use, concern the different sectors of commerce, industry, government and institutions in defense of the environment. In this regard, the search for new renewable energy sources has headed many researches, besides generating billions of dollars in investments. One of the most important research lines is the production of second generation ethanol (2G), an ethanol produced from the waste generated in the production of the first generation one. In the case of Brazil, these residues mainly include sugar cane straw and bagasse. This biomass is mostly composed of cellulose (∼45%), hemicellulose (∼25%) and lignin (∼20), and its hydrolysis involves adequate pre-treatments and the use of enzymes that specifically act on their targets. In this way, ethanol productivity increases without necessarily expanding growing areas. This aspect is very promising, but the costs are still relatively high and the applicability badly depends on adaptations of the industrial sector and improvements in the production itself (specific activity of the enzymes and their synergistic action with others). The main goal of this project is to recognize and map the molecular bases that control the activity of the enzyme xylose isomerase (XI), which converts xylose (the mostly present carbohydrate in hemicellulose) into xylulose, allowing its use by Saccharomyces cerevisiae (since xylose is not fermentable), to obtain the second generation ethanol as final product. To reach this, an extensive search of genes of several microorganisms, that code for XI, and still do not have solved high resolution structures published are carried out. Most ORFs (Open Reading Frames) were amplified, cloned into specific vectors and transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) bacteria. Some of these transformed strains leaded to the production of XI of interest. Furthermore, it was possible to obtain protein crystals and to start trying to solve crystallographic structures. These results were cross - checked and correlated with those of enzymatic activity, chemical kinetics and thermal stability, providing a good perspective for understanding the molecular bases which govern isomerase activity.

Le furfural est un intermédiaire chimique biosourcé produit à l'échelle industrielle par déshydratation des pentoses issus de la biomasse lignocellulosique. Le procédé industriel utilise une catalyse homogène à base d’acide sulfurique. L'objectif de ces travaux de thèse vise à rechercher une voie catalytique durable, faisant appel à une catalyse hétérogène solide acide en phase aqueuse. L’utilisation de réacteurs fermé et à flux continu a été comparée, tout en évitant le recours aux solvants organiques d’extraction. Pour ce faire, une large gamme de catalyseurs acides hétérogènes a été caractérisée et évaluée en réacteur fermé afin de rechercher des corrélations entre performances catalytiques et propriétés physico-chimiques. Ces études ont permis de montrer que l'utilisation de solutions aqueuses d'acide acétique, en synergie avec certains catalyseurs hétérogènes, conduit aux meilleurs résultats, à savoir un rendement en furfural de 60%. Elles ont également permis de sélectionner les familles de catalyseurs acides, potentiellement stables et sélectifs, pour des études plus approfondies en réacteur continu. Deux familles de catalyseurs ont ainsi été étudiées afin d'augmenter leur sélectivité en furfural et leur stabilité. Des catalyseurs à base de charbons fonctionnalisés avec de l'acide citrique ont montré des résultats très satisfaisants, et une excellente stabilité. La modification de catalyseurs à base de niobium par des phosphates a permis d'améliorer la sélectivité en furfural et de mettre en évidence l'importance de la nature des sites acides à la surface du solide / Furfural is a chemical intermediate produced in industry by dehydration of pentoses issued from the lignocellulosic biomass. Sulfuric acid is currently used in the industrial process. The aim of this thesis is the search for a sustainable catalytic way based on solid acid catalysts in aqueous phase. Both batch and fixed-bed reactors have been compared, taking care to avoid the use of extractive organic solvents. Thus, a large range of heterogeneous acid catalysts was characterized and evaluated in batch reactor in order to obtain correlations between catalytic performances and physico-chemical properties. These studies have shown that the use of aqueous acetic acid solutions, in synergy with selected heterogeneous catalysts, leads to the best results, furfural yield of 60%. It was also possible to select families of acid catalysts, potentially stable and selective for deeper studies in continuous reactor. Two catalyst types have been optimized in order to increase their furfural selectivity and their stability. Carbon-based catalysts, functionalized with citric acid, have shown good furfural yield as well as an excellent stability. Niobium-based catalysts modified with phosphates led to increased furfural selectivity and also highlighted the importance of the nature of acid sites on the solid surface

Fazemos parte de um cenário mundial em que o esgotamento das fontes de energias fósseis atrelado à poluição gerada por esse uso, preocupam os diferentes setores do comércio, da indústria, do governo e das instituições em defesa do meio ambiente. Nesse sentido, a busca por novas fontes energéticas renováveis tem dirigido diversas pesquisas, além de drenar bilhões de dólares em investimentos. Uma das linhas de pesquisa mais importantes é a da produção do etanol de segunda geração (2G), um etanol produzido a partir dos resíduos gerados na produção do etanol de primeira geração. No caso do Brasil, esses resíduos compreendem principalmente a palha e o bagaço de cana-de-açúcar; essa biomassa é formada majoritariamente por celulose (∼45%), hemicelulose (∼25%) e lignina (∼20), e sua hidrólise envolve pré-tratamentos adequados e uso de enzimas que agem especificamente em seus alvos. Dessa forma, a produtividade de etanol aumenta, sem necessariamente ampliar áreas de cultivo. Essa vertente é muito promissora, porém os custos ainda são relativamente altos e a aplicabilidade depende bastante de adaptações do setor industrial e aprimoramentos na produção em si (atividade específica das enzimas e sua ação sinérgica). O objetivo principal deste projeto é reconhecer e mapear as bases moleculares que comandam a atividade da enzima xilose isomerase (XI), que converte xilose (presença majoritária na hemicelulose) em xilulose, possibilitando a utilização desta por Saccharomyces cerevisiae (já que a xilose não é fermentescível), para obtenção do etanol de segunda geração como produto final. Para isso, foi realizada uma busca extensiva de genes de diversos microrganismos, que codifiquem para XI, e que essas ainda não possuam estruturas resolvidas publicadas. A maioria das ORFs (Open Reading Frame, do inglês), ou regiões codificadoras, foram amplificadas, clonadas em vetores específicos e transformadas em bactérias Escherichia coli Rosetta (DE3). Parte dessas cepas transformadas resultaram na produção da XI de interesse. Com isso, foi possível obter cristais e iniciar a resolução de estruturas cristalográficas. Esses resultados foram cruzados e correlacionados com os de atividade enzimática, cinética química e estabilidade térmica, fornecendo boa perspectiva para o entendimento das bases moleculares que regem a atividade xilose isomerásica. / We are part of a world scenario in which the depletion of fossil energy sources linked to the pollution generated by this use, concern the different sectors of commerce, industry, government and institutions in defense of the environment. In this regard, the search for new renewable energy sources has headed many researches, besides generating billions of dollars in investments. One of the most important research lines is the production of second generation ethanol (2G), an ethanol produced from the waste generated in the production of the first generation one. In the case of Brazil, these residues mainly include sugar cane straw and bagasse. This biomass is mostly composed of cellulose (∼45%), hemicellulose (∼25%) and lignin (∼20), and its hydrolysis involves adequate pre-treatments and the use of enzymes that specifically act on their targets. In this way, ethanol productivity increases without necessarily expanding growing areas. This aspect is very promising, but the costs are still relatively high and the applicability badly depends on adaptations of the industrial sector and improvements in the production itself (specific activity of the enzymes and their synergistic action with others). The main goal of this project is to recognize and map the molecular bases that control the activity of the enzyme xylose isomerase (XI), which converts xylose (the mostly present carbohydrate in hemicellulose) into xylulose, allowing its use by Saccharomyces cerevisiae (since xylose is not fermentable), to obtain the second generation ethanol as final product. To reach this, an extensive search of genes of several microorganisms, that code for XI, and still do not have solved high resolution structures published are carried out. Most ORFs (Open Reading Frames) were amplified, cloned into specific vectors and transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) bacteria. Some of these transformed strains leaded to the production of XI of interest. Furthermore, it was possible to obtain protein crystals and to start trying to solve crystallographic structures. These results were cross - checked and correlated with those of enzymatic activity, chemical kinetics and thermal stability, providing a good perspective for understanding the molecular bases which govern isomerase activity.

Face à une demande sans cesse croissante en ressources fossiles et une prise de conscience sociétale des enjeux environnementaux, un intérêt de plus en plus important est porté à la valorisation de la biomasse lignocellulosique comme source pour l'énergie et la chimie fine.Parmi les molécules d'intérêt pouvant provenir de la lignocellulose, le xylose un sucre en C5 est obtenu par hydrolyse de la fraction hémicellulosique. Ce dernier peut être hydrogéné en xylitol, un édulcorant. Les catalyseurs utilisés pour réaliser cette réaction ne sont pas stables ou sont à base de métaux nobles. Un des objectifs de ce travail est le développement d'un catalyseur actif, sélectif, stable et à base de métaux non nobles pour cette réaction. Des catalyseurs à base de cobalt se sont avérés actifs et sélectifs pour cette réaction d'hydrogénation du xylose en xylitol. La déshydratation du xylose conduit au furfural qui peut être hydrogéné en alcool furfurylique ou hydrogénolysé en 2-méthylfurane. Un catalyseur à base de cobalt supporté sur un support SBA-15 s'est avéré très actif et sélectif pour d'hydrogénation du furfural en alcool furfurylique. Une étude systématique des conditions expérimentales a été réalisée et le catalyseur a été recyclé. L'identification des sites actifs a été réalisée grâce à une corrélation entre les caractérisations physico-chimiques du catalyseur et sa réactivité lors de l'hydrogénation du furfural en alcool furfurylique. L'hydrogénolyse du furfural en 2-méthylfurane a elle été réalisée en présence d'un catalyseur à base de cuivre supporté et a permis l'obtention de 45 % du produit désiré. / With the increase in the fossil resources demand and a societal awareness of environmental issues, a high interest has been devoted to the use of lignocellulosic biomass as a source for energy and fine chemicals.Among the molecules of interest which come from lignocellulose, xylose, a C5 sugar is obtained by hydrolysis of the hemicellulosic fraction. Xylose can be hydrogenated to xylitol, a sweetener. Today the catalysts used for this reaction are not stable or are based on noble metals. One objective of this work is the development of an active, selective, stable catalyst and based on non-noble metals for this hydrogenation reaction. Cobalt based catalysts have proved to be active and selective for the hydrogenation reaction of xylose to xylitol.The dehydration of xylose affords furfural than can be further converted to furfuryl alcohol by hydrogenation or to 2-methylfuran by hydrogenolysis reaction. A cobalt based catalyst supported on SBA-15 was active and selective in the hydrogenation of furfural to furfuryl alcohol. The study of the experimental conditions was performed and the catalyst was recyclable. The nature of the active site in the hydrogenation of furfural to furfuryl alcohol was determined by a correlation between the physic-chemical properties of the catalyst and its reactivity. The hydrogenolysis of furfural to 2-methylfuran was carried out in the presence of a copper based catalyst and 45 % yield was obtained in liquid phase.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-10-16Bitstream added on 2014-06-13T19:35:27Z : No. of bitstreams: 1 kiiper_pg_me_rcla.pdf: 773936 bytes, checksum: 1b480acb49acd45ba8d3f3f9a6e99ca8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A utilização de solvente Organosolv em condições de acidez e temperaturas elevadas para a realização da deslignificação de bagaço de cana e hidrólise da fração de hemicelulose tem sido muito estudada e existem muitos parâmetros experimentais já descritos na literatura. Tem sido obtidos bons resultados de deslignificação e hidrólise parcial do bagaço a partir do prétratamento ácido com solvente Organosolv utilizando misturas de etanol e água, normalmente em proporções iguais de volume de cada. Este estudo descreve um método de deslignificação e hidrólise da hemicelulose do bagaço da cana combinando a utilização da mistura dos solventes orgânicos, acetona e álcool, com água e solução ácida diluída. A mistura do solvente organosolv (acetona+álcool/água – 1:1 v/v), concentração ácida de 0,5 - 2,0% de H2SO4, e tempo de reação de 30 a 120 minutos e 5,0% de bagaço (p/v) foi realizado para o pré-tratamento. O efeito do ácido, solvente e temperatura no rendimento e extensão da deslignificação e hidrólise da oram estudados. Os resultados obtidos indicam importantes diferenças no pré-tratamento ácido com solvente Organosolv, devido ao uso da acetona e concentração ácida empregados nos experimentos deste estudo. Os melhores resultados foram obtidos com 1,0% de H2SO4 e 120 °C. Sob estas condições o rendimento de açúcares obtidos da hidrólise ácida da porção de hemicelulose do bagaço de cana foi de 7.53%. Estes resultados demonstram um rendimento de açúcares fermentescíveis que podem ser utilizados como fonte de carbono para a fermentação alcoólica por Pachysolen tannophilus. A conversão de Xilose em etanol por Pachysolen tannophilus é relativamente ineficiente nas condições de fermentação estudada. Esta ineficiência é atribuída em partes, ao consumo de etanol pela levedura concorrente à sua produção, baixa eficiência... / The utilization of Organosolv solvents under acid and high temperature conditions in the delignification and hemicelulose and cellulose hydrolysis of wood and bagasse has already been reported in the literature for several experimental parameters. Organosolv treatment of sugarcane bagasse has also been reported and has shown good results with ethanol–water mixtures, normally at volume ratios close to unit. This study describes a method of the delignification hemicelulose hydrolysis of sugarcane bagasse combining the use of ethanol+acetone/water mixtures and diluted acid solutions. Ethanol+acetone/water mixture (1:1 v/v), acid concentration of 0,5 - 2,0% of H2SO4, reaction times from 30 to 120 min, and 5,0% of sugarcane bagasse (w/v) was carried out for bagasse pre-treatment. The effect of acid, solvent and temperature on the yield and extent of delignification and hemicelulose hydrolysis was studied. The obtained results indicate important differences from the Organosolv process, which may be due to the presence of acetone and acid concentration employed in this work. The best results were obtained at 1,0% of H2SO4 and 120 °C. Under these conditions the sugar yield obtained from hemicelulose hydrolysis from sugarcane bagasse 7.53%. These results shows that the sugar yield obtained can be used as carbon source for Pachysolen tannophilus fermentation to produce ethanol. The conversion of D-xylose to ethanol by the yeast Pachysolen tannophilus is relatively inefficient in batch culture. The inefficiency has been attributed in part to concurrent utilization of ethanol, slow fermentation metabolism of the yeast and to the formation of xylitol and other by-products. The xylose concentration in the must was 2,0% during 120 hours of fermentation. The best ethanol yield was obtained in the first 24 hours, as the ethanol began to be consumed and the sugar concentration became low... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Pedro de Oliva Neto / Banca: Dejanira de Franceschi de Angelis / Banca: Sandra Regina Ceccato-Antonini / Resumo: A utilização de solvente Organosolv em condições de acidez e temperaturas elevadas para a realização da deslignificação de bagaço de cana e hidrólise da fração de hemicelulose tem sido muito estudada e existem muitos parâmetros experimentais já descritos na literatura. Tem sido obtidos bons resultados de deslignificação e hidrólise parcial do bagaço a partir do prétratamento ácido com solvente Organosolv utilizando misturas de etanol e água, normalmente em proporções iguais de volume de cada. Este estudo descreve um método de deslignificação e hidrólise da hemicelulose do bagaço da cana combinando a utilização da mistura dos solventes orgânicos, acetona e álcool, com água e solução ácida diluída. A mistura do solvente organosolv (acetona+álcool/água - 1:1 v/v), concentração ácida de 0,5 - 2,0% de H2SO4, e tempo de reação de 30 a 120 minutos e 5,0% de bagaço (p/v) foi realizado para o pré-tratamento. O efeito do ácido, solvente e temperatura no rendimento e extensão da deslignificação e hidrólise da oram estudados. Os resultados obtidos indicam importantes diferenças no pré-tratamento ácido com solvente Organosolv, devido ao uso da acetona e concentração ácida empregados nos experimentos deste estudo. Os melhores resultados foram obtidos com 1,0% de H2SO4 e 120 °C. Sob estas condições o rendimento de açúcares obtidos da hidrólise ácida da porção de hemicelulose do bagaço de cana foi de 7.53%. Estes resultados demonstram um rendimento de açúcares fermentescíveis que podem ser utilizados como fonte de carbono para a fermentação alcoólica por Pachysolen tannophilus. A conversão de Xilose em etanol por Pachysolen tannophilus é relativamente ineficiente nas condições de fermentação estudada. Esta ineficiência é atribuída em partes, ao consumo de etanol pela levedura concorrente à sua produção, baixa eficiência... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The utilization of Organosolv solvents under acid and high temperature conditions in the delignification and hemicelulose and cellulose hydrolysis of wood and bagasse has already been reported in the literature for several experimental parameters. Organosolv treatment of sugarcane bagasse has also been reported and has shown good results with ethanol-water mixtures, normally at volume ratios close to unit. This study describes a method of the delignification hemicelulose hydrolysis of sugarcane bagasse combining the use of ethanol+acetone/water mixtures and diluted acid solutions. Ethanol+acetone/water mixture (1:1 v/v), acid concentration of 0,5 - 2,0% of H2SO4, reaction times from 30 to 120 min, and 5,0% of sugarcane bagasse (w/v) was carried out for bagasse pre-treatment. The effect of acid, solvent and temperature on the yield and extent of delignification and hemicelulose hydrolysis was studied. The obtained results indicate important differences from the Organosolv process, which may be due to the presence of acetone and acid concentration employed in this work. The best results were obtained at 1,0% of H2SO4 and 120 °C. Under these conditions the sugar yield obtained from hemicelulose hydrolysis from sugarcane bagasse 7.53%. These results shows that the sugar yield obtained can be used as carbon source for Pachysolen tannophilus fermentation to produce ethanol. The conversion of D-xylose to ethanol by the yeast Pachysolen tannophilus is relatively inefficient in batch culture. The inefficiency has been attributed in part to concurrent utilization of ethanol, slow fermentation metabolism of the yeast and to the formation of xylitol and other by-products. The xylose concentration in the must was 2,0% during 120 hours of fermentation. The best ethanol yield was obtained in the first 24 hours, as the ethanol began to be consumed and the sugar concentration became low... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientadores: Gustavo Henrique Goldman, Juliana Velasco de Castro Oliveira / Texto em português e inglês / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T07:09:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Borges_ThuannyAndrade_M.pdf: 7098529 bytes, checksum: 5b56fca196314bf7920ad2d7b03aefc7 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A completa utilização da biomassa lignocelulósica é um dos pré-requisitos para tornar o processo do etanol de segunda geração economicamente competitivo. Entretanto, a fermentação dos açúcares disponíveis na biomassa celulósica apresenta um desafio único em decorrência da presença de outros açúcares, além da glicose, tais como xilose e arabinose, os quais não são fermentáveis por Saccharomyces cerevisiae, a principal levedura utilizada na indústria. Em leveduras, a conversão de D-xilose a D-xilulose ocorre em duas etapas: inicialmente D-xilose é reduzida a D-xilitol pela enzima xilose redutase (XR); em seguida, D-xilitol é oxidado a D-xilulose pela enzima xilitol desidrogenase (XDH). Em S. cerevisiae, essas duas enzimas possuem cofatores distintos, provocando assim um desequilíbrio redox na célula, impedindo a utilização anaeróbica de pentoses. Uma alternativa para que S. cerevisiae possa produzir etanol através destes açúcares é modificá-la geneticamente com genes provenientes de micro-organismos que naturalmente realizem esta conversão. Dessa forma, este projeto isolou e caracterizou as leveduras Rhodotorula dairenensis TAB01 e Pseudozyma brasiliensis sp.nov. GHG001, a partir do intestino de insetos parasitas da cana-de-açúcar, através da análise de expressão dos genes xyl1 e xyl2 que codificam, respectivamente, as enzimas XR e XDH. Adicionalmente, foi avaliada a hiper-expressão destes na cepa industrial de S. cerevisiae PE-2 e na cepa PE-2 super-expressando o gene XKS1 de S. cerevisiae (PE-XKS), o qual codifica a enzima xilulose quinase (XK). P. brasiliensis GHG001 e R. dairenensis TAB01 mostraram-se promissoras para o estudo. Estas duas espécies são ótimas assimiladoras de xilose e seus genes de XR e XDH foram expressos heterologamente em S. cerevisiae, gerando as cepas PE Rd, PE Pb, PE-XKS Rd e PE-XKS Pb, que foram testadas quanto a capacidade de utilizar xilose para crescimento. Porém, essas cepas recombinantes não conseguiram utilizar xilose como única fonte de carbono, o que evidencia o quão importante é o desbalanço de cofatores das enzimas no metabolismo de xilose. Além disso, devido a uma notável importância biotecnológica, também foi caracterizada uma enzima xilanolítica produzida por P. brasiliensis GHG001 a qual apresentou uma alta atividade xilanolítica. Essa xilanase, pertencente à família GH11, apresentou pH e temperatura ótimos iguais a 4 e 55°C, respectivamente, sendo sua estrutura secundária constituída de folhas beta. A sua atividade enzimática é influenciada por alguns íons como Ca2+ e os resultados de sua cinética indicaram um comportamento sigmoidal característico de enzimas alostéricas. Usando xilano como substrato, esta xilanase produz xilooligossacarídeos que podem ser usados industrialmente como prébióticos, que junto a outras aplicabilidades desta enzima na indústria, demonstram seu alto potencial biotecnológico / Abstract: Full utilization of lignocellulosic biomass is one of the prerequisites to make the process of second generation ethanol economically competitive. However, the fermentation of sugars available in cellulosic biomass presents a unique challenge due to the presence of other sugars besides glucose, such as xylose and arabinose, which are not fermentable by Saccharomyces cerevisiae, the main yeast used in the industry. In yeasts, the conversion of D-xylose to D-xylulose occurs in two steps: first D-xylose is reduced to xylitol by the enzyme D-xylose reductase (XR), and then D-xylitol is oxidized to D-xylulose by the enzyme xylitol dehydrogenase (XDH). In S. cerevisiae, these two enzymes have different cofactors, thereby causing a redox imbalance in the cell, preventing the use of pentoses anaerobically. An alternative to S. cerevisiae can produce ethanol by these sugars is genetically modifying it with genes derived from microorganisms that naturally carry out this conversion. Thus, this project characterized the yeasts Rhodotorula dairenensis TAB01 and Pseudozyma brasiliensis GHG001, isolated from the gut of insects pests of sugarcane, through the analysis of genes expression of xyl1 and xyl2 which encoding respectively, the XR and XDH enzymes and measured the enzymatic activity of the same. Additionally, was evaluated the overexpression of these in S. cerevisiae industrial strains PE-2 and PE-2 XKS1 overexpressing xks1 gene of S. cerevisiae, which encodes the enzyme xylulokinase (XK). P. brasiliensis GHG001 and R. dairenensis TAB01 shown promise for this study as they are great xylose assimilators and their assimilating xylose genes are expressed in the presence of this sugar. XR and XDH were heterologously expressed in S. cerevisiae, generating strains Rd PE, PE Pb, PE-XKS Rd and PE-XKS Pb, which were tested for the ability to utilize xylose for growth. However, these recombinant strains were unable to utilize xylose as sole carbon source, which shows how important is the imbalance of cofactors of the metabolize xylose enzymes. Moreover, due to a remarkable biotechnological importance, has also been characterized a xylanolytic enzyme produced by P. brasiliensis GHG001 which showed a high activity, yet unreported by other eukaryotic microorganism. This xylanase belonging to family GH11, showed pH and temperature optima equal to 4 and 55°C, respectively, and its secondary structure consists of ?-sheets. This enzyme has influence of some ions such as Ca2+ and showed a sigmoidal kinetic behavior, characteristic of allosteric enzymes. From xylan, the xylanase produces xylooligosacharides which can be used industrially as prebiotics, which together with other applicability of this enzyme in the industry, demonstrate their high biotechnological potential / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Lucia Regina Durrant / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-14T14:31:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rossi_RaquelAndradede_M.pdf: 2252972 bytes, checksum: c504b3299931a04c688b6e1100f129fb (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O bagaço da cana-de-açúcar é considerado uma biomassa lignocelulósica promissora para a produção de etanol, devido a sua composição em açúcares, grande disponibilidade e baixo custo. A levedura Saccharomyces cerevisiae, embora apresente atributos ideais para o uso industrial, não é capaz de fermentar alguns açúcares presentes nesta biomassa, como xilose e arabinose (açúcares não convencionais). Assim, é interessante a busca por leveduras em nichos ecológicos onde esses açúcares estão presentes. O Brasil apresenta uma rica biodiversidade, qualificada pela diversidade em: ecossistemas, espécies biológicas e endemismos. Utilizar ecossistemas característicos do território brasileiro como fonte de coleta oferece a oportunidade não só de obter novas espécies, mas também de isolar aquelas capazes de fermentar diferentes substratos. De acordo com o exposto, o objetivo deste trabalho foi de isolar, a partir de amostras de biomas brasileiros, leveduras que apresentassem a habilidade em fermentar alguns açúcares, além da glicose e frutose, especialmente os que compõem o hidrolisado do bagaço da cana-de-açúcar (açúcares não convencionais). Os resultados demonstraram que as linhagens isoladas não apresentaram habilidade em fermentar as principais pentoses (xilose e arabinose) presentes no bagaço da cana-de- açúcar. Contudo, 19 foram capazes de assimilar a xilose, e 12 linhagens, a arabinose. Desta forma, como sugestão, o hidrolisado do bagaço da cana-de-açúcar pode ser utilizado para a produção de biomassa protéica (single cell protein) pelas linhagens que assimilaram xilose e arabinose / Abstract: Sugarcane bagasse is considered a promising lignocellulosic biomass for ethanol production, due to its sugar composition, high availability and low price. Although, Saccharomyces cerevisiae has the ideal attributes for industrial use, it is not able to ferment some sugars present in this biomass such as xylose and arabinose (non-convencional sugars). Thus, it is interesting to search for yeasts in ecological niches where these sugars are present. Brazil has a rich biodiversity, qualified for its diversity in: ecosystems, biological species and endemisms. To use the ecosystems characteristics of the Brazilian territory as a source for sample collection offers the opportunity not only to obtain new species, but also to isolate those capable of fermenting diverse substrates. Therefore, the aim of this study was to isolate from samples of Brazilian biomes, yeasts that have the ability to ferment some sugars, besides glucose and fructose, especially those components of the sugarcane bagasse hydrolizate (non-convencional sugars). The results demonstrated that the isolated strains had no ability to ferment the main pentoses (xylose and arabinose) present in sugarcane bagasse. However, 19 strains were able to assimilate xylose, and 12 strains, arabinose. Thus, as suggestion, the sugarcane bagasse hydrolyzate can be used for the production of single cell protein by the strains that assimilate xylose and arabinose / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos