Die Homöostase wird maßgeblich durch die Niere, bestehend aus Millionen funktioneller Untereinheiten, den Nephronen, aufrechtherhalten. Chronisch geschädigte Nephrone führen zur Entwicklung einer terminalen Nierenerkrankung (TNE). Die Erzeugung renaler Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) stellt eine vielversprechende Strategie zur regenerativen Therapie und Behandlung von TNE dar. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Protokoll zur Differenzierung von renalen Vorläufern (RV) aus hPSCs entwickelt, welches nephronale Zelltypen und Strukturen in vitro und ex vivo erzeugte. Eine selektierte Kombination von Faktoren wurde in diesem 8-Tage-Protokoll genutzt, um die schrittweise Differenzierung der hPSCs zu lenken, indem die embryonale Organogenese der Niere abgebildet wurde. Am Tag 6 der Differenzierung konnten SIX2+/CITED1+ Zellen des metanephrischen Mesenchyms und HOXB7+/GRHL2+ Zellen, welche auf Vorläufer der Ureterknospe hindeuten, nachgewiesen werden. Diese entwickelten sich am Tag 8 weiter zu LGR5+/JAG1+/WT1+ renalen Vesikelzellen. Weiterführende Kultivierung in drei verschiedenen induktiven Medien führte zu WT1+/PODXL+/SYNPO+ Podozytenvorläufern, PDGFRß+/DESMIN+/αSMA+ Mesangialzellen und epithelialen Zellen des proximalen und distalen Tubulus sowie des Sammelrohrs. Außerdem bildeten die Tag-8-Vorläuferzellen spontan 3D renale Organoide aus. Die RV induzierten tubuläre Strukturen an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und integrierten sich in embryonale Nierenaggregate. Zusammenfassend konnte demnach ein Protokoll entwickelt werden, welches entstehenden Nephronen ähnliche RV generierte, die innerhalb von 14 Tagen in spezialisierte nephronale Zelltypen differenzierten. Diese einfache Methode, um renale Zellen aus einem gemeinsamen Vorläuferpool in einer 2D -Kultur zu erzeugen, schafft die Grundlage für eine Produktion im größeren Maßstab, sowie für Modellsysteme in toxikologischen Untersuchungen oder Zelltherapien. / Kidneys are the central organ for homeostasis for our body systems and composed of around a million functional units, the nephrons. Chronically damaged nephrons deteriorate progressively towards end stage renal disease (ESRD), owing to the limited regenerative capacity of adult mammalian kidneys. The generation of renal cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) is a promising strategy to develop regenerative therapies for ESRD. In this study, we established a protocol to differentiate hPSCs to renal progenitors (RP), capable of producing nephronal cell types and structures in vitro and ex vivo. An effective combination of factors obtained after intensive screening, was used to create an 8-day-protocol that steered hPSCs to the renal lineage by a step-wise process outlining the embryonic milestones in kidney organogenesis. Six days after growth factor treatment, a mixture of SIX2+/CITED1+ cells representing metanephric mesenchyme and an HOXB7+/GRHL2+ population indicative of ureteric bud progenitors was obtained that developed into LGR5+/JAG1+/WT1+ renal vesicle cells by the day 8. Prolonged cultivation of these day 8 cells in three inductive media resulted in generation of WT1+/PODXL+/SYNPO+ podocyte-precursors, PDGFRß+/DESMIN+/αSMA+-mesangial cells and fractions of proximal, distal and collecting duct tubular epithelial cells in vitro. Moreover, day 8 cells differentiate spontaneously into renal organoids in culture. The hPSC-derived RP gave rise to tubular structures upon culture as a pellet in air-liquid interface and integrated into embryonic kidney re-aggregations. Thus, we demonstrate that our protocol generates RP reminiscent of nascent nephrons, which can be coaxed into specialized nephronal cell types in vitro after 14 days from hPSCs. This simple and rapid method to produce renal cells from a common precursor pool in 2D culture provides the basis for scaled-up production of tailored renal cell types, applicable for drug testing or cell therapies.

Chronisches Nierenversagen kann zu einem endgültigen Funktionsverlust der Nieren führen. Nierenersatztherapien bleiben dabei die einzigen lebensrettenden Behandlungsmaßnahmen. Der globale Bedarf an Nierenorganen übersteigt jedoch bei weitem die Anzahl verfügbarer Spenderorgane. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC) stellen eine vielversprechende Quelle für die Generierung funktioneller Nierenzellen dar. Die hiPSC-abgeleiteten Nierenzellen könnten zukünftig für zelluläre Ersatztherapien verwendet werden. Innerhalb dieser Arbeit sollten die aus hiPSC-abgeleiteten Nierenzellen auf ihre Immunogenität überprüft werden. Dafür wurden hiPSC-Linien, reprogrammiert aus primären Urinzellen gesunder Spender, generiert. Die hiPSC wurden daraufhin in renale Vorläuferzellen (IM-Zellen) und proximale Tubuluszellen (PT-Zellen) differenziert. Die immunphänotypische Analyse ergab eine generell verminderte Expression immun-relevanter Gene verglichen zu adulten Urinzellen. Für die Immunigenitätsbestimmung wurden die Nierenzellen jeweils mit autologen oder allogenen Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) kokultiviert. Die IM- sowie PT-Zell-Kokulturen mit PBMC gesunder Spender sowie von Patienten mit diabetischer Nephropathie ergaben keine Proliferation autoreaktiver sowie allogener T-Zellen, im Vergleich zu primäre Urinzellen mit gleichen HLA-Merkmalen. Des Weiteren wiesen IM- und PT-Zellen aktive immunsupprimierende Eigenschaften auf. Diese konnten in langzeit-kultivierten PT-Zellen nicht mehr beobachtet werden. Zusätzlich zeigten die hiPSC-abgeleiteten Nierenzellen eine Anfälligkeit gegenüber autologe sowie allogene natürliche Killerzellen (NK-Zellen). Diese Studie ergab erstmalig Einblicke in die Dynamiken der T- und NK-Zell-Antworten renal differenzierter hiPSC. Die hier gewonnenen Erkenntnisse können für die Entwicklung zukünftiger Therapien beitragen, um eine sichere Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Nierenzellen, selbst im allogenen System, zu ermöglichen. / Kidneys are essential for numerous vital processes. Chronic damage can lead to end stage renal disease with the requirement of kidney replacement therapies. Kidneys are nowadays the most frequently transplanted human organs, however, the transplant demand is far exceeding the number of available donations. Human induced pluripotent stem cells (hiPSC) represent a promising alternative approach for the generation of functional renal differentiated cells suitable for autologous cell replacement therapies (CRT). Yet, the immunogenic potential of hiPSC and their progenies are among the major concerns. This study aimed to analyze immunogenic effects of hiPSC-derived renal cells in autologous and allogeneic settings in vitro. Therefor, primary urinary cells (pUC) from healthy donors were reprogrammed into hiPSC, which were differentiated into renal progenitors (IMC) and into proximal tubular cells (PTC). Immune-phenotypic characterization revealed overall reduced expression of immune-relevant genes in hiPSC and renal derivatives compared to pUC. Co-culture experiments of IMC or PTC with either autologous or allogeneic peripheral blood mononuclear cells of healthy donors or patients with diabetic nephropathy revealed no induction of T cell proliferation in comparison to pUC cells with the same HLA-types. IMC and PTC showed immunomodulatory effects on allogeneic T cell proliferation. These immunosuppressive capacities were lost in long-term cultivated PTC. hiPSC-derived renal cells showed to elicit autologous as well as for allogeneic natural killer cells (NK cells). This study provided insights about the immunogenic properties of hiPSC-derived renal cells. In vitro experiments revealed new hints about the dynamics of T- and NK cell responses dependent on the differentiation status of hiPSC-derived renal cells. These data show translational potential for the development of future CRT strategies aiming safe transplantation of hiPSC-derived renal cells across HLA barriers.