Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-11-22Bitstream added on 2014-06-13T20:04:04Z : No. of bitstreams: 1 monnazzi_lgs_dr_arafcf.pdf: 1628105 bytes, checksum: 439e61c2131f392d13c659297a95020d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / As três espécies patogênicas do gênero Yersinia, Y. pestis, Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis, compartilham um tropismo pelos tecidos linfóides e um plasmídeo de 70-kb que é essencial para a virulência. O plasmídeo codifica um sistema de secreção do tipo III e proteínas efetoras chamadas Yops (Yersinia outer proteins). Este sistema de secreção é responsável por translocar as Yops para dentro das células do hospedeiro, onde elas interagem com alvos específicos e alteram as funções destas células. As Yops são capazes de modular a resposta imune do hospedeiro, permitindo à bactéria se replicar extracelularmente nos tecidos e órgãos linfóides. Embora haja muita informação sobre os mecanismos usados pela Yersinia para evadir do sistema imune inato de defesa, pouco se sabe sobre como ela afeta a resposta imune adaptativa in vivo. O objetivo deste trabalho foi analisar a influência das Yops E, H e M, translocadas pela Y. pseudotuberculosis, na colonização e persistência da bactéria no baço e fígado dos animais infectados, nas quantidades de LT-CD4 e LT-CD8 durante a infecção e na produção das principais citocinas Th1 e Th2 por estas subpopulações de linfócitos. Além disso, foi verificado o papel destas Yops sobre a ativação do fator nuclear κB (NF-κB) e sobre a atividade citotóxica dos LT-CD8. Para isso, camundongos BALB/c fêmeas foram infectados intravenosamente com a amostra selvagem de Y. pseudotuberculosis (WT), ou com amostras mutantes incapazes de secretar as Yops E, H e M (YopE-, YopH- e YopM-), ou ainda com a amostra curada do plasmídeo de virulência (YpIII). No 5°, 7°, 14° e 21° dia pós-infecção (pi), os animais foram sacrificados e as células esplênicas foram obtidas de camundongos infectados e de camundongos não infectados (grupo controle). Os níveis de colonização no baço e no fígado foram determinados por... / The three pathogenic species of the genus Yersinia, Y. pestis, Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis, share a tropism for lymphoid tissues and a 70-kb plasmid essential for virulence. The plasmid encodes a type III secretion system and effector proteins called Yops (Yersinia outer proteins). This secretion system is responsible for translocating the Yops into the host cells, where they interact with specific host targets and alter the functions of these cells. Yops are able to modulate the host immune defenses allowing the bacteria to replicate extracellularly in lymphoid tissues and organs. Although there is ample information on the mechanisms used by Yersinia to evade the innate immune system, very little is known about how it affects the adaptive immune response in vivo. The aim of this research was to analyze the influence of translocated Yops E, H and M of Y. pseudotuberculosis on the colonization and persistence of the bacterium in the spleen and liver of infected animals, on the quantities of CD4 and CD8 T cells during the infection and on the production of the main Th1 and Th2 cytokines by these lymphocyte subpopulations. In addition, it was verified the role of these same Yops on the activation of nuclear factor κB (NF- κB) and on the CD8 T cells cytotoxic activity. To this end, female BALB/c mice were infected intravenously with the wild type Y. pseudotuberculosis (WT), or with the mutant strains unable to secrete the Yops E, H and M (YopE-, YopH- and YopM-) or with the plasmid-cured strain (YpIII). On the 5th, 7th, 14th and 21st days post-infection (pi), the animals were sacrificed and the spleen cells were isolated from infected and uninfected mice (control group). The levels of colonization in the spleen and liver were determined by counting the number of colony-forming units. Both the phenotypic analysis of lymphocytes and the intracellular... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Beatriz Maria Machado de Medeiros / Banca: Alexandrina Sartori / Banca: Cleni Mara Marchocchi Machado / Banca: Leonilda Maria Barbosa dos Santos / Banca: Phileno Pinge Filho / Resumo: As três espécies patogênicas do gênero Yersinia, Y. pestis, Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis, compartilham um tropismo pelos tecidos linfóides e um plasmídeo de 70-kb que é essencial para a virulência. O plasmídeo codifica um sistema de secreção do tipo III e proteínas efetoras chamadas Yops (Yersinia outer proteins). Este sistema de secreção é responsável por translocar as Yops para dentro das células do hospedeiro, onde elas interagem com alvos específicos e alteram as funções destas células. As Yops são capazes de modular a resposta imune do hospedeiro, permitindo à bactéria se replicar extracelularmente nos tecidos e órgãos linfóides. Embora haja muita informação sobre os mecanismos usados pela Yersinia para evadir do sistema imune inato de defesa, pouco se sabe sobre como ela afeta a resposta imune adaptativa in vivo. O objetivo deste trabalho foi analisar a influência das Yops E, H e M, translocadas pela Y. pseudotuberculosis, na colonização e persistência da bactéria no baço e fígado dos animais infectados, nas quantidades de LT-CD4 e LT-CD8 durante a infecção e na produção das principais citocinas Th1 e Th2 por estas subpopulações de linfócitos. Além disso, foi verificado o papel destas Yops sobre a ativação do fator nuclear κB (NF-κB) e sobre a atividade citotóxica dos LT-CD8. Para isso, camundongos BALB/c fêmeas foram infectados intravenosamente com a amostra selvagem de Y. pseudotuberculosis (WT), ou com amostras mutantes incapazes de secretar as Yops E, H e M (YopE-, YopH- e YopM-), ou ainda com a amostra curada do plasmídeo de virulência (YpIII). No 5°, 7°, 14° e 21° dia pós-infecção (pi), os animais foram sacrificados e as células esplênicas foram obtidas de camundongos infectados e de camundongos não infectados (grupo controle). Os níveis de colonização no baço e no fígado foram determinados por... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The three pathogenic species of the genus Yersinia, Y. pestis, Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis, share a tropism for lymphoid tissues and a 70-kb plasmid essential for virulence. The plasmid encodes a type III secretion system and effector proteins called Yops (Yersinia outer proteins). This secretion system is responsible for translocating the Yops into the host cells, where they interact with specific host targets and alter the functions of these cells. Yops are able to modulate the host immune defenses allowing the bacteria to replicate extracellularly in lymphoid tissues and organs. Although there is ample information on the mechanisms used by Yersinia to evade the innate immune system, very little is known about how it affects the adaptive immune response in vivo. The aim of this research was to analyze the influence of translocated Yops E, H and M of Y. pseudotuberculosis on the colonization and persistence of the bacterium in the spleen and liver of infected animals, on the quantities of CD4 and CD8 T cells during the infection and on the production of the main Th1 and Th2 cytokines by these lymphocyte subpopulations. In addition, it was verified the role of these same Yops on the activation of nuclear factor κB (NF- κB) and on the CD8 T cells cytotoxic activity. To this end, female BALB/c mice were infected intravenously with the wild type Y. pseudotuberculosis (WT), or with the mutant strains unable to secrete the Yops E, H and M (YopE-, YopH- and YopM-) or with the plasmid-cured strain (YpIII). On the 5th, 7th, 14th and 21st days post-infection (pi), the animals were sacrificed and the spleen cells were isolated from infected and uninfected mice (control group). The levels of colonization in the spleen and liver were determined by counting the number of colony-forming units. Both the phenotypic analysis of lymphocytes and the intracellular... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Die humane Yersiniose wird durch Lebensmittel tierischen Ursprungs übertragen und stellt aufgrund der jährlich gleichbleibend hohen Zahl übermittelter Krankheitsfälle sowie der wahrscheinlich weitaus höheren Dunkelziffer ein Problem des gesundheitlichen Verbraucherschutzes dar. Die intermittierende Ausscheidung des Erregers Yersinia enterocolitica beim klinisch unauffälligen Reservoirtier Schwein und die aufwändige Kultivierung erschweren den direkten Erregernachweis. Hier könnte der serologische Nachweis, in der Humanmedizin bereits seit langem etabliert, eine wertvolle diagnostische Hilfe sein. Die Erkennung serologisch positiver Bestände ähnlich dem Salmonellen-Monitoring und daran anschließende Hygienemaßnahmen, vor allem vor und während der Schlachtung, können den Eintrag des Erregers in die Lebensmittelkette vermindern. So wurde im Rahmen dieser Arbeit ein hochspezifisches serologisches Nachweissystem entwickelt, das durch die Verwendung rekombinanter und ausschließlich bei pathogenen Yersinien vorkommender Antigene eine hohe Sensitivität und Spezifität garantiert. Neun ausgewählte Yersinia Outer Proteins (Yops) wurden kloniert und mit spezifisch auf jedes Protein abgestimmten Bedingungen zur optimalen Expression gebracht. Durch die Evaluierung verschiedener Aufreinigungssysteme konnten schließlich reproduzierbare hochreine Antigene auch in großen Mengen hergestellt werden. Mit Blick auf eine sichere Auswertbarkeit bei der Verwendung des Testsystems in Laboratorien wurden die Antigene nicht elektrophoretisch aufgebracht, sondern mittels Sprühverfahren auf eine Nitrozellulosemembran aufliniert. Das gebrauchsfertige Testsystem, Blotstreifen von 2,5 mm Breite mit neun auflinierten, rekombinant hergestellten und Virulenzplasmid-basierenden Yersinia-Antigenen, eignet sich zur Diagnostik serologisch positiver Schweine. Mit Hilfe dieses Testsystems wurde die isotypspezifische Antikörperantwort von Schweinen im Infektionsmodell gegen den Erreger Y. enterocolitica ausgewertet. Nach zwei Vorversuchen mit jeweils zwei Schweinen wurden im Hauptversuch neun Ferkel experimentell mit einer Infektionsdosis von 5x1011 KBE per Magenschlundsonde infiziert, wobei die Tiere nach leichtem und kurzfristigem Durchfallgeschehen den Erreger symptomlos mit dem Kot ausschieden. Weitere neun Ferkel stellten eine Kontrollgruppe nicht infizierter Tiere dar. Vom Tag der Infektion bis zum Tag der Tötung (Tag 33) wurde regelmäßig bei den achtzehn Schweinen Blut, Speichel und Tränenflüssigkeit gewonnen, am letzten Tag zusätzlich Gelenkflüssigkeit und Darmsekrete. Die Auswertung der Seren im zeitlichen Verlauf zeigte deutlich die Immunogenität der Yops. Bei dominierenden Yops wie YopO, YopH, LcrV, YopD und YopE ließ sich das Einsetzen der Antikörperbildung (IgG und IgA) mit nachfolgendem Anstieg bei allen infizierten Tieren feststellen. Die früheste Bildung von Immunglobulin G konnte am Tag 10 gegen YopD verzeichnet werden, Immunglobulin A wurde gegen YopD bereits am Tag 7 gebildet. Die nicht infizierten Kontrolltiere waren im Immunoblot durchgehend negativ. In den Darmsekreten, der Gelenk- und Tränenflüssigkeit und vor allem im Speichel liessen sich mit dem entwickelten Test ebenfalls spezifische Yop- Antikörper detektieren. Der Test kann somit zur Diagnostik von Beständen mit Yersinia-Problematik herangezogen werden; er eignet sich als kompletter Kit sowohl für Labore als auch für veterinärmedizinische Praxen.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-19Bitstream added on 2014-06-13T19:18:55Z : No. of bitstreams: 1 maia_jml_me_arafcf.pdf: 491989 bytes, checksum: 76c75c0de1431ea6c8ce3ff67f4446d3 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / As proteínas Yops. formam uma família de proteínas secretadas por Yersinia spp que incluem efetores intracelulares (seis efetores foram identificados: YopE, YopH, YopM, YpkA/YopO, YopJ/YopP e YopT) e vários componentes do aparato de secreção-translocação que são liberado pela bactéria sob quelação de Ca2+. As .Yops. efetoras têm sido relacionadas a uma série de propriedades de virulência, incluindo resistência à fagocitose, citotoxicidade e desfosforilação de proteínas do hospedeiro. Porém, a interação das .Yops. de Yersinia com a resposta imune específica do hospedeiro não está bem esclarecida. O objetivo deste estudo foi investigar o papel imunomodulador das Yops secretadas por amostras de Yersinia pseudotuberculosis sobre a produção de anticorpos e autoanticorpos por linfócitos B. Para tanto camundongos foram infectados com uma amostra selvagem de Y. pseudotuberculosis (YpIII) e com amostras mutantes, defectivas na secreção de determinadas .Yops. efetoras (YopH, YopE, YopM, YpkA e YopJ). Foram obtidas células esplênicas destes animais, e as células secretoras de imunoglobulinas inespecíficas e específicas (anti-Yersinia e anti-.Yops.) foram quantificadas através do teste ELISPOT. A presença de anticorpos específicos anti-Yersinia e anti-.Yops. no soro dos animais infectados foi analisada através do teste ELISA. A presença de auto-anticorpos séricos foi analisada através do teste DOT-BLOT. Não se observou nenhuma diferença entre o número de células secretoras de imunoglobulinas (Igs) inespecíficas dos animais inoculados com a amostra selvagem, YpIIIpIB102 (wt), em relação aos controles. Já a amostra YpIII pIB522, embora defectiva na secreção de YopE, provocou uma redução dos linfócitos B secretores de IgG2a, IgM e IgA. A única ativação observada ocorreu para o isotipo IgG2a (aumento de 1,7 vezes)... / The Yops proteins form a protein family secreted by Yersinia spp that includes intracellular effectors (six effectors had been identified: YopE , YopH, YopM, YpkA/YopO, YopJ/YopP and YopT) and some components of the secretion-translocation apparatus that are released by the bacteria under Ca2+ quelation. The Yops effectors have been related to a series of virulence properties, including resistance to phagocytosis, citotoxicity and desfosforilation of host proteins. However, the interaction of the Yersinia Yops with the host specific immune response is not well defined. The objective of this study was to investigate the immunomodulatory role of the Yops secreted by strains of Yersinia pseudotuberculosis on the production of antibodies and autoantibodies by splenic B lymphocytes. To this end, mice were infected with wild-type Y. pseudotuberculosis (YpIII) or with mutant strains, unable to secrete specific Yops (YopH, YopE, YopM, YpkA and YopJ). Spleen cells were obtained, and the cells secreting nonspecific and specific immunoglobulins (anti-Yersinia and anti-Yops) was quantified by the ELISPOT technique. The presence of anti-Yersinia and anti- .Yops. specific antibodies in infected mice serum was investigated by ELISA and the presence of autoantibodies by DOT-BLOT assay. It was not observed neither difference between the number of nonspecific Igs-secreting cells of the animals infected with YpIIIpIB102 (wt) in relation to the controls. The strain YpIII pIB522, although defective in YopE secretion, provoked a reduction in the B lymphocytes secreting IgG2a, IgM and IgA. The unique activation observed was that of IgG2a isotype (an increase of 1.7-fold) on the 7th day post infection. The YopH- strain, YpIII pIB29, provoked an increase in the number of IgG1-, IgG2a- and IgG3- secreting cells (between 1.4 to 2.4-fold), on the 7th and 14th days post infection... (Complete abstract, click electronic address below)

Die humane Yersiniose wird durch Lebensmittel tierischen Ursprungs übertragen und stellt aufgrund der jährlich gleichbleibend hohen Zahl übermittelter Krankheitsfälle sowie der wahrscheinlich weitaus höheren Dunkelziffer ein Problem des gesundheitlichen Verbraucherschutzes dar. Die intermittierende Ausscheidung des Erregers Yersinia enterocolitica beim klinisch unauffälligen Reservoirtier Schwein und die aufwändige Kultivierung erschweren den direkten Erregernachweis. Hier könnte der serologische Nachweis, in der Humanmedizin bereits seit langem etabliert, eine wertvolle diagnostische Hilfe sein. Die Erkennung serologisch positiver Bestände ähnlich dem Salmonellen-Monitoring und daran anschließende Hygienemaßnahmen, vor allem vor und während der Schlachtung, können den Eintrag des Erregers in die Lebensmittelkette vermindern. So wurde im Rahmen dieser Arbeit ein hochspezifisches serologisches Nachweissystem entwickelt, das durch die Verwendung rekombinanter und ausschließlich bei pathogenen Yersinien vorkommender Antigene eine hohe Sensitivität und Spezifität garantiert. Neun ausgewählte Yersinia Outer Proteins (Yops) wurden kloniert und mit spezifisch auf jedes Protein abgestimmten Bedingungen zur optimalen Expression gebracht. Durch die Evaluierung verschiedener Aufreinigungssysteme konnten schließlich reproduzierbare hochreine Antigene auch in großen Mengen hergestellt werden. Mit Blick auf eine sichere Auswertbarkeit bei der Verwendung des Testsystems in Laboratorien wurden die Antigene nicht elektrophoretisch aufgebracht, sondern mittels Sprühverfahren auf eine Nitrozellulosemembran aufliniert. Das gebrauchsfertige Testsystem, Blotstreifen von 2,5 mm Breite mit neun auflinierten, rekombinant hergestellten und Virulenzplasmid-basierenden Yersinia-Antigenen, eignet sich zur Diagnostik serologisch positiver Schweine. Mit Hilfe dieses Testsystems wurde die isotypspezifische Antikörperantwort von Schweinen im Infektionsmodell gegen den Erreger Y. enterocolitica ausgewertet. Nach zwei Vorversuchen mit jeweils zwei Schweinen wurden im Hauptversuch neun Ferkel experimentell mit einer Infektionsdosis von 5x1011 KBE per Magenschlundsonde infiziert, wobei die Tiere nach leichtem und kurzfristigem Durchfallgeschehen den Erreger symptomlos mit dem Kot ausschieden. Weitere neun Ferkel stellten eine Kontrollgruppe nicht infizierter Tiere dar. Vom Tag der Infektion bis zum Tag der Tötung (Tag 33) wurde regelmäßig bei den achtzehn Schweinen Blut, Speichel und Tränenflüssigkeit gewonnen, am letzten Tag zusätzlich Gelenkflüssigkeit und Darmsekrete. Die Auswertung der Seren im zeitlichen Verlauf zeigte deutlich die Immunogenität der Yops. Bei dominierenden Yops wie YopO, YopH, LcrV, YopD und YopE ließ sich das Einsetzen der Antikörperbildung (IgG und IgA) mit nachfolgendem Anstieg bei allen infizierten Tieren feststellen. Die früheste Bildung von Immunglobulin G konnte am Tag 10 gegen YopD verzeichnet werden, Immunglobulin A wurde gegen YopD bereits am Tag 7 gebildet. Die nicht infizierten Kontrolltiere waren im Immunoblot durchgehend negativ. In den Darmsekreten, der Gelenk- und Tränenflüssigkeit und vor allem im Speichel liessen sich mit dem entwickelten Test ebenfalls spezifische Yop- Antikörper detektieren. Der Test kann somit zur Diagnostik von Beständen mit Yersinia-Problematik herangezogen werden; er eignet sich als kompletter Kit sowohl für Labore als auch für veterinärmedizinische Praxen.