Los actuales sistemas de formulación para vacuno lechero se basan en el concepto de proteína digestible y en especial en el aporte de aminoácidos absorbibles en el intestino delgado. Una proporción importante de los aminoácidos que llegan al intestino delgado del rumiante proviene de la proteína de la ración. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en los monogástricos, antes de llegar al intestino delgado esta proteína es sometida a la acción de los microorganismos del rumen. Varios autores (Crooker y col., 1987; Susmel y col., 1989; Erasmus y col., 1994) han observado cambios en el perfil de aminoácidos de la proteína tras su paso por el rumen, aunque los efectos que produce la fermentación ruminal sobre el perfil de aminoácidos de la proteína de la ración no estan muy claros. La proteína que no ha sido degradada fluye hacia el intestino donde debe ser digerida. De forma similar a lo que ocurre con la degradación en el rumen, existe poca información acerca de cómo afecta la digestión intestinal a los diferentes aminoácidos que componen una proteína. La incorporación de valores de degradación ruminal y digestibilidad intestinal de los aminoácidos individuales de suplementos proteicos permitiría una mejora evidente en la precisión de los sistemas de formulación de raciones para vacuno lechero. La obtención de valores precisos in vivo es difícil, dada la complejidad de la fermentación ruminal y la dificultad de controlar los factores de variación inherentes al animal que pueden confundir la interpretación de los resultados, por lo que en el presente trabajo se optó por la utilización de sistemas in Vitro. El objetivo principal de esta tesis fue la estimación de la degradabilidad ruminal y la digestibilidad intestinal de los aminoácidos de algunos suplementos proteicos utilizados frecuentemente en vacuno lechero.La tesis se estructura en tres experimentos. En los dos primeros se estudia la degradabilidad ruminal de los aminoácidos de cuatro suplementos proteicos (harina de soja, harina de gluten de maíz, harina de sangre y harina de pescado) mediante un sistema de cultivo continuo de flujo doble. Este sistema in vitro simula el proceso de fermentación que ocurre en el rumen, y a la vez permite mantener controlados los diversos factores que pueden afectar a la fermentación ruminal. De esta manera se puede diferenciar el flujo de aminoácidos procedentes de la proteína de la ración que no ha sido degradada en el rumen, y estudiar las posibles variaciones en el perfil de aminoácidos de esta proteína causadas por la fermentación ruminal. Los resultados de estos dos trabajos muestran que existen diferencias en la degradabilidad ruminal de los aminoácidos individuales de un mismo suplemento proteico, así como diferencias en la degradabilidad de aminoácidos entre distintos suplementos. No obstante, y a pesar de las estrictas medidas de control aplicadas, la variabilidad obtenida en los resultados no permite establecer valores precisos de degradación.La falta de una técnica rápida y fiable para la determinación de la digestión intestinal no sólo de proteínas sino también de aminoácidos, es la motivación del tercer experimento. En la primera parte de este experimento se desarrolló una técnica capaz de estimar de manera rápida y fiable la digestibilidad intestinal de proteínas y aminoácidos procedentes de suplementos proteicos. Para ello se modificó la técnica desarrollada por Calsamiglia y Stern (1995) adaptándola a un incubador in Vitro, con tal de agilizar la técnica y adaptarla al estudio de aminoácidos. Una vez puesta a punto la técnica, se estimó la digestibilidad intestinal de los aminoácidos procedentes de 11 suplementos proteicos de uso frecuente en vacuno lechero. Los resultados de este experimento muestran diferencias en la digestibilidad intestinal de los aminoácidos dentro de un mismo suplemento. En general, los aminoácidos esenciales se muestran más digestibles en el intestino que los no esenciales. Asimismo, los resultados reflejan diferencias en la digestión intestinal de aminoácidos entre suplementos proteicos, lo que no permite establecer valores generales de digestibilidad para cada aminoácido, ya que estos pueden diferir en función del suplemento proteico estudiado. La técnica DaisyII desarrollada en este trabajo puede ser un buen método para la obtención de valores de digestibilidad específicos para cada aminoácido de los distintos suplementos proteicos. / Current feeding systems for dairy cows include the prediction of amino acids requirements and supply to the small intestine. Supply of absorbable amino acids of dietary origin depends of the amount of dietary protein escaping ruminal degradation, intestinal digestibility of the amino acids that escape ruminal degradation, and the amino acid composition of rumen undegraded intestinally digested protein. Some authors (Crooker et al., 1987; Susmel et al., 1989; Erasmus et al., 1994) observed changes in the amino acid profile after ruminal incubation of proteins, although effects of ruminal fermentation on the amino acid profile of dietary proteins remain unclear. Rumen undegraded dietary protein flows to the small intestine to be digested. However, its digestibility in the small intestine and its amino acid profile is highly variable depending on type of feed and processing. Little information is available concerning the digestion of individual amino acids in the small intestine, which will become increasingly critical as systems that incorporate amino acid requirements are introduced. In vivo estimates of amino acid ruminal degradation and intestinal digestion are labor intensive, time consuming and subject to considerable sources of variation. The use of in vitro simulation systems offers an alternative that allows the study of the effects of microbial fermentation and intestinal digestion on amino acid composition of protein supplements under controlled conditions, and considering the potential interactions that occur on rumen fermentation. The objective of this study was to estimate rumen microbial degradation and small intestine digestion of amino acids from protein supplements of common use in dairy cow feeding.Eight dual flow continuous culture fermenters were used in three replicated periods in first and second experiment to study the effects of diets containing increasing levels of heat-treated soybean meal, corn gluten meal, fish meal or blood meal on microbial fermentation, nutrient flow and relative ruminal escape of dietary amino acids. Results from these studies suggest that the individual amino acid of a protein supplement differ in their resistance to ruminal fermentation and microbial attack, although the establishment of accurate values of ruminal degradation for individual amino acids is difficult.The lack of a fast and reliable method to estimate intestinal digestion of proteins and amino acids justified a third experiment. A three-step in vitro procedure was developed by Calsamiglia and Stern (1995) to estimate intestinal digestion of proteins in ruminants in a fast and cost-effective manner. However, this method does not allow to estimate the intestinal digestion of individual amino acids. The objective of this third study was to modify the procedure of Calsamiglia and Stern (1995), by adapting it to a Daisy II incubator, to further reduce the cost and labor involved in the determination of intestinal digestion of proteins, and to be able to estimate the intestinal digestion of individual amino acids. The intestinal digestion of 11 protein supplements and its amino acids was determined using the proposed technique. Results from the Daisy II technique show differences within and between feedstuffs in the proportion of their individual amino acids that are digested in the small intestine, and suggest a preferential digestion of essential amino acids. The use of the Daisy II technique results in a substantial reduction in cost and labor, is sensitive to differences between feedstuffs for individual amino acid digestibilities, and allows the selection of proteins with high digestibilities of those amino acids that are most likely to limit production.

La leche es un alimento de un alto valor nutricional pero su perfil de ácidos grasos (AG) no es el más adecuado desde un punto de vista de salud humana. Esta tesis estudia cómo modificar el perfil de AG de la leche a través de la nutrición animal así como diferentes factores que pueden influir en el proceso de biohidrogenación a nivel rumimal modificando el flujo de AG a la glándula mamaria.En el primer experimento se utilizaron 356 vacas en un diseño de bloques al azar y se estudió cómo la suplementación de las dietas de vacas lecheras al inicio de la lactación con semilla de lino extrusionada afectaba a la producción y la composición de la leche, y a la reproducción. Las dietas utilizadas tenían una relación forraje:concentrado de 40:60 (17,9% PB, 27,7% FND y 6,0% EE), se administraron ad libitum y eran similares en su composición entre tratamientos, excepto en el suplemento proteico donde la dieta control (CTR) tenía un 4,9% de semilla de soja extrusionada, mientras que la dieta lino (LIN) tenía un 5,5% de semilla de lino extrusionada. La suplementación con semilla de lino extrusionada redujo el porcentaje de grasa láctea y la producción de leche corregida por grasa e incrementó el porcentaje de proteína láctea, así como también mejoró el perfil de AG de la leche hacia uno más saludable, todo ello sin modificar la ingestión de MS, la producción de leche y el rendimiento reproductivo de los animales.En el segundo estudio se utilizaron 8 fermentadores (1320 mL) de doble flujo continuo en dos periodos de 7 d (4 d adaptación y 3 d muestro) y se estudiaron, en un diseño factorial 2 × 2, los efectos del pH (Alto = 6,4 vs. Bajo = 5,6) y de la dieta (Soja (SOY) vs. Lino (LIN)) sobre la fermentación microbiana ruminal, la lipólisis y la biohidrogenación ruminal, el flujo de AG del efluyente y la concentración de DNA de bacterias implicadas en los procesos de lipólisis y biohidrogenación ruminal. Los resultados de este estudio indicaron que el pH inhibió la lipólisis y la biohidrogenación ruminal y que la grasa de la soja extrusionada parecía estar más protegida contra la lipólisis que la del lino extrusionado. Se realizó un tercer estudio donde se evaluó el efecto del pH (6,4 vs. 5,6) y de dos niveles de forraje:concentrado en las dietas (70:30 F:C (HF) vs. 30:70 F:C (LF)) sobre la fermentación microbiana ruminal, el perfil de AG del efluyente y la concentración de DNA de bacterias involucradas en los procesos de lipólisis y biohidrogenación ruminal. El sistema de cultivo continuo consistió en dos periodos de 8 d (5 d adaptación y 3 d muestreo), con un diseño factorial 2 × 2 de los tratamientos. Las dietas utilizadas tuvieron un perfil similar de AG (44,0% C18:2, 9,77% C18:3). Los resultados indican que el pH bajo es la principal causa de la acumulación de trans-10 C18:1 y trans-10, cis-12 CLA a nivel ruminal, aunque un nivel alto de concentrado en las dietas también incrementa la proporción de trans-10, cis-12 CLA en el efluyente. / Milk is a food with a high nutritive value however milk fatty acid (FA) profile does not seem to be very healthy from a human health point of view. This thesis studies how to modify the milk FA profile through animal nutrition and different factors which can affect ruminal biohydrogenation processes which determine the composition of the FA flow to the mammary gland.In the first experiment, 356 early lactation multiparous Holstein cows were used in a randomised complete block design to determine the effects of feeding extruded linseed on milk production and composition, and reproductive performance. Cows were fed a 40:60 forage to concentrate ratio diet (17.9% CP, 27.7% NDF and 6.0% EE) ad libitum that was identical in composition between treatments except for the protein supplement that was control (CTR: 4.9% extruded soybean) and linseed (LIN: 5.5% extruded linseed. Extruded linseed supplementation reduced milk fat percentage and fat corrected milk yield, and increased milk protein percentage and the content of healthy FA in milk without modifying DM intake, milk yield and reproductive performance. In the second experiment, 8 dual-flow continuous culture fermenters (1,320 mL) were used in two replicated periods of 7 d (4 d of adaptation and 3 d for sampling) to study, in a 2 × 2 factorial design, the effects of pH (High = 6.4 vs. Low = 5.6) and diet (Soybean vs. Linseed) on rumen microbial fermentation, lipolysis and apparent biohydrogenation, effluent flow of fatty acid and DNA concentration of bacteria involved in lipolysis and biohydrogenation processes. Results indicated that pH inhibited lipolysis and apparent biohydrogenation. Fat of extruded soybean seemed more protected against lipolysis than that of extruded linseed. A third experiment was designed to study the effect of pH (6.4 vs. 5.6) and two different forage to concentrate ratios (F:C) in the diets (70:30 F:C (HF) vs. 30:70 F:C (LF)) on rumen microbial fermentation, effluent FA profile and DNA concentration of bacteria involved in lipolysis and biohydrogenation processes. The continuous culture study consisted of two periods of 8 d (5 d adaptation plus 3 d sampling), with a 2 × 2 factorial arrangement of treatments. Both diets had a similar FA profile (44.0% C18:2, 9.77% C18:3). Results indicate that low pH is the main cause of the accumulation of trans-10 C18:1 and trans-10, cis-12 CLA, although concentrate rich diets also increase trans-10, cis-12 CLA proportion in the effluent.

Esta tesis doctoral se planteó con el fin de profundizar en el estudio de la acidosis ruminal y evaluar nuevas estrategias de prevención.En el experimento 1, se desarrolló la PCR cuantitativa para detectar y cuantificar Streptococcus bovis y Megasphaera elsdenii, bacterias relacionadas con la producción y utilización del lactato, respectivamente. La técnica se desarrolló con unas eficiencias del 88% (S. bovis) y 99% (M. elsdenii). Posteriormente se empleó esta técnica en los experimentos siguientes, permitiendo progresar en comprender el rol que tienen estas bacterias en el proceso de la acidosis.El experimento 2 se realizó con el objetivo de determinar los efectos de administrar altos niveles de carbohidratos no fibrosos (CNF) en la dieta sobre la fermentación ruminal y el metabolismo de vacas lecheras. Para ello se utilizaron 62 vacas Holstein en un diseño cross-over 2x2. Los tratamientos fueron: una dieta tradicional de vacas de alta producción (TR, CNF = 43%) y una dieta alta en CNF (HC, CNF = 47%). El grupo HC incrementó la producción de leche y su contenido en proteína, pero afectando negativamente a la salud de los animales (síndrome de baja grasa, mayor riesgo de cojeras, más horas a pH ruminal subóptimo).El experimento 3 consistió en describir los cambios fisiológicos en la fermentación ruminal durante la inducción a la acidosis en terneras de engorde y su control mediante una preparación comercial de anticuerpos policlonales (mayoritariamente contra S. bovis). Se utilizaron 12 terneras cruzadas que se distribuyeron completamente al azar en 2 grupos de 6 animales cada uno: el grupo control (CTR) y el grupo que recibía el tratamiento de anticuerpos (PAP). El 83,3% y el 50,0% de los animales entraron en acidosis en el grupo CTR y PAP, respectivamente, y tardaron de media 5,25 ± 0,17 d. Asimismo, el perfil de fermentación de los animales acidóticos fue similar entre tratamientos. El grupo PAP tuvo mayores valores de pH a las 0h post-alimentación en los días 16, 18 y 19 de experimento comparado con el grupo CTR. Estos resultados indican que PAP puede ser efectivo para controlar la acidosis en terneras durante una transición rápida a concentrado.El objetivo del experimento 4 fue evaluar los efectos de un inhibidor de la actividad α-amilasa (acarbosa) en el control de la acidosis ruminal sobre la fermentación ruminal y el metabolismo en vacas lecheras. Se usaron 8 vacas Holstein en un diseño cross-over 2x2. Los tratamientos fueron: control (sin aditivo, CTR) y acarbosa (0,75 g/animal/d, AMI). Se observó que el grupo AMI estuvo menos horas a pH ruminal subóptimo y tuvo un pH ruminal medio superior comparado con el grupo CTR. Microbiológicamente, los animales AMI tendieron a tener una menor ratio S. bovis:M. elsdenii comparado con los CTR. No se observaron diferencias en el resto de parámetros. Estos resultados indican que el suplemento de dietas con acarbosa en vacas lecheras alimentadas con raciones de alta producción puede ser efectivo en reducir la acidosis ruminal sin repercusiones en la fermentación ruminal del animal ni en su metabolismo. / This doctoral thesis was designed to increase our knowledge of ruminal acidosis and to valuate new strategiesIn experiment 1, quantitative PCR probes were developed to detect and quantify S. bovis and M. elsdenii, lactic acid-producing and lactic acid-utilizing bacteria, respectively. The two PCR probes had efficiencies of 88% (S. bovis) and 99% (M. elsdenii). In the following experiments of this thesis, these techniques were used to progress in the understanding of the role that these bacteria have in the development of acidosis.The experiment 2 was designed to study the effects of administrating high levels of NFC in the diet on ruminal fermentation and animal metabolism of lactating dairy cows. Sixty-two lactating Holstein cows were used in a cross-over 2x2. Treatments were: a traditional ration of high-producing dairy cows (TR, NFC = 43%) and a high-NFC ration (HC, NFC = 47%). Milk yield and milk protein content were greater in HC group, but had negative effects on animal health (milk fat depression, greater lameness risk, more hours at suboptimal pH).In experiment 3, physiological changes in rumen fermentation during acidosis induction and its control using a multivalent polyclonal antibody preparation against S. bovis (PAP) in heifers were studied. A completely randomized experiment was designed using 12 crossbred heifers. Treatments were control (CTR) and PAP. After the feeding challenge, acidosis was declared 5.25 ± 0.17 d after the start of transition, during which 83.3 and 50.0% of the animals entered in acidosis in CTR and PAP groups, respectively. However, the fermentation profile of animals with acidosis was similar between treatments. Heifers fed PAP had greater pH before feeding on days 16, 18 and 19 of the experiment compared with CTR. These results indicate that PAP may be effective in controlling acidosis of heifers during a rapid transition to a high-concentrate diet.The objective of experiment 4 was to evaluate the effects of an amylase inhibitor (acarbose) in dairy cows to control ruminal acidosis in a 2x2 cross-over design. Eight Holstein cows were used to study animal metabolism and ruminal fermentation. Treatments were: control (no additive, CTR) and acarbose (0.75 g/cow/d, AMI). AMI group stayed less hours below pH = 5.6 and had greater daily average pH compared with CTR group. AMI animals tended to have lower S. bovis to M. elsdenii ratio than CTR. These results indicate that supplementing diets with acarbose to dairy cattle fed high-NFC rations may be effective in reducing acidosis in lactating cows with no negative effects on ruminal fermentation and animal metabolism.

The structure of the metazoan parasite faunas and communities in Atlantic cod, Gadus morhua L., from six NE Atlantic regions [Baltic, Celtic, Irish and North seas, Icelandic waters and Trondheimsfjord (Norway) and two fish farms in Iceland and Scotland] has been studied. 1,254 fish were sampled in the NE Atlantic during 2002-2003. Altogether 57 parasite taxa were found. The predominant groups in regional parasite faunas were the trematodes (19 species) and the nematodes (13 species). Nine parasite species were found for the first time in cod (Diclidophora merlangi, Rhipidocotyle sp., Fellodistomum sp., Steringotrema sp., Schistocephalus gasterostei, Cucullanus sp., Spinitectus sp., Acanthochondria soleae and Chondracanthus ornatus). Contracaecum osculatum, Hysterothylacium aduncum and Echinorhynchus gadi were the only parasite species found to infect farmed fish. Regional parasite faunas showed lower richness with respect to the total list (c. 65%) with a notable decrease in the Baltic Sea and Trondheimsfjord (21 and 32%, respectively). Eleven species were present in all regions: Lepidapedon elongatum, Anisakis simplex, C. osculatum, H. aduncum, H. rigidum, Pseudoterranova decipiens, Ascarophis crassicollis, Capillaria gracilis, Corynosoma semerme, C. strumosum and E. gadi. Despite of the small size of the monogenean D. merlangi recovered in the present study, the Analysis of Principal Components showed that morphologically they are more similar to D. merlangi from whiting (Merlangius merlangus, type-host), than to other congeneric species from the North Atlantic, thus supporting their assignment to D. merlangi. The aspect and smaller size of the oöcytes suggested that D. merlangi on cod could not produce viable ova, although a specimen exhibited an egg with normally sized and shaped shell. The most species rich and abundant parasite communities were observed in cod from the open water regions (Celtic, North and Irish seas and Icelandic waters). Overall, parasite infracommunities exhibited lower predictability than component communities, due to the fact that only a restricted set of the species contributing to the similarity between component communities exhibited high abundance and dominated infracommunities. The multivariate techniques applied to examine similarity patterns of component communities across regions exhibited good agreement and detected distinct compositional segregation of those in cod from the two low-salinity regions. The highest homogeneity with respect to the composition and structure of parasite communities was observed Celtic, Irish and North Sea cods. Decay of similarity with geographical distance was observed in component communities but not in regional parasite faunas, the higher homogenisation of the latter being related to the migratory behaviour of cod and the domination of generalist parasites widely distributed. The spatial compositional autocorrelation exhibited by component communities and the substantially higher rates of similarity decay compared to other marine fish systems indicate that communities in cod are strongly constrained by the spatial configuration of locations and the dispersal abilities of parasites. Nested subset analyses revealed non-random patterns of faunal/community composition with poor faunas from low-salinity regions (Baltic Sea and Trondheimsfjord) nested in the richer faunas/communities from the high-salinity open water regions. The comparison of the learning behaviour of the three classification approaches, Random Forests (RF), Linear Discriminant Analysis and Artificial Neural Networks, using the same version of the parasite community data, revealed that RF appears as the best classifier. Anisakid nematodes, C. cirratus, D. varicus, H. communis, E. gadi, and C. adunca were selected as important for RF model development. The high accuracy of the predictive models developed for the Baltic and Icelandic samples indicate that the populations of these stocks can be confidently differentiated from the other stocks studied in the NE Atlantic. These results suggest that parasite community data can be used successfully to discriminate cod populations (putative stocks) of the NE Atlantic cod using RF. / La composición y estructura de la fauna de parásitos metazoos del bacalao, Gadus morhua, es el objeto del presente estudio. Se recolectaron 1.254 peces durante 2002-03 procedentes de 6 áreas de pesca del Atlántico Nororiental (mares Báltico, Celta, de Irlanda y del Norte, Islandia y el fiordo de Trondheim), así como 2 granjas marinas situadas en Islandia y Escocia. Se recolectó una fauna rica formada por 57 taxones parásitos diferentes. Siete especies, Diclidophora merlangi, Rhipidocotyle sp., Fellodistomum sp., Steringotrema sp., Cucullanus sp., Spinitectus sp. y Chondracanthus ornatus son primeras citas en este hospedador. Once especies estuvieron presentes en las parasitofaunas de las 6 regiones naturales estudiadas: Lepidapedon elongatum, Anisakis simplex, C. osculatum, H. aduncum, H. rigidum, Pseudoterranova decipiens, Ascarophis crassicollis Capillaria gracilis, Corynosoma semerme, C. strumosum y Echinorhynchus gadi. Las comunidades parásitas de bacalao de las regiones de baja salinidad (mar Báltico y fiordo de Trondheim) estuvieron caracterizadas por las más bajas riquezas, abundancias y diversidades. La sincronización espacial de la composición de las comunidades componentes y las mayores tasas de declive de similitud exhibidas en comparación otras comunidades, indican que las comunidades componentes están fuertemente comprometidas por la configuración espacial de las regiones y la facilidad de dispersión de los parásitos. La ausencia de aleatoriedad en la composición de las faunas y comunidades componentes estuvo claramente relacionada con la salinidad: las comunidades empobrecidas de las regiones de baja salinidad estaban anidadas dentro de las faunas y comunidades más ricas de las regiones de mayor salinidad en mar abierto. La comparación del comportamiento de la metodología de clasificación de grupos, "Random Forests" (RF), con otros algoritmos, Análisis Discriminante Linear y las Redes Neurales Artificiales, utilizando los mismos datos recolectados en las cinco regiones del Atlántico nororiental, reveló que RF era la mejor herramienta de clasificación. Los nematodos anisáquidos fueron identificados como "importantes" para desarrollar los modelos junto con otras especies como Cucullanus cirratus, D. varicus, Hemiurus communis, E. gadi y Clavella adunca. Los buenos resultados de discriminación obtenidos, incluso para este pez migratorio, reflejan el elevado potencial de RF para desarrollar modelos predictivos usando datos que son complejos y "ruidosos".

La reparación de los defectos osteocondrales en la rodilla del conejo ha sido realizada mediante la utilización de:1. Un injerto libre de periostio invertido (con su capa interna dirigida a la cavidad articular)2. Un biomaterial (fosfato tricalcico-hidroxiapatita), con el objetivo de reemplazar al cartílago y hueso respectivamente.Se utilizaron 25 conejos, machos, adolescentes, de raza New Zealand y se realizó un defecto cilíndrico de 3.5 x 3 mm. En el surco intercondileo. Se permitió la movilización libre inmediata en la jaula y fueron sacrificados a las seis semanas. Se cuantificaron los resultados macroscópicos y microscópicos mediante una tabla de valoración confeccionada. Los resultados histomorfométricos determinaron la variación porcentual entre la situación inicial y final. Se obtuvo un tejido de naturaleza y características cartilaginosas en el 66.3% de las rodillas y el biomaterial se reabsorbió en el 73.09%.

The Mediterranean Sea is expected to react faster to global change compared to the ocean and is already showing more pronounced warming and acidification rates. A study performed along the Italian western coast showed that porosity of the skeleton increases with temperature in the zooxanthellate (i.e. symbiotic with unicellular algae named zooxanthellae) solitary scleractinian Balanophyllia europaea while it does not vary with temperature in the solitary non-zooxanthellate Leptopsammia pruvoti. These results were confirmed by another study that indicated that the increase in porosity was accompanied by an increase of the fraction of the largest pores in the pore-space, perhaps due to an inhibition of the photosynthetic process at elevated temperatures, causing an attenuation of calcification. B. europaea, L. pruvoti and the colonial non-zooxanthellate Astroides calycularis, transplanted along a natural pH gradient, showed that high temperature exacerbated the negative effect of lowered pH on their mortality rates. The growth of the zooxanthellate species did not react to reduced pH, while the growth of the two non-zooxanthellate species was negatively affected. Reduced abundance of naturally occurring B. europaea, a mollusk, a calcifying and a non-calcifying macroalgae were observed along the gradient while no variation was seen in the abundance of a calcifying green alga. With decreasing pH, the mineralogy of the coral and mollusk did not change, while the two calcifying algae decreased the content of aragonite in favor of the less soluble calcium sulphates and whewellite (calcium oxalate), possibly as a mechanism of phenotypic plasticity. Increased values of porosity and macroporosity with CO2 were observed in B. europaea specimens, indicating reduces the resistance of its skeletons to mechanical stresses with increasing acidity. These findings, added to the negative effect of temperature on various biological parameters, generate concern on the sensitivity of this zooxanthellate species to the envisaged global climate change scenarios.

Despite extensive studies focus mainly on sexual reproductive characteristics in tropical scleractinian species, there is limited knowledge on temperate regions. The Mediterranean is a biodiversity hotspot under intense pressure from anthropogenic impacts. Climatic models further predict that the Mediterranean basin will be one of the most impacted regions by the ongoing warming trend. This makes it a potential model of more global patterns to occur in the world’s marine biota, and a natural focus of interest for research on climate. The present research contributed to increase data on reproductive modes and sexuality of temperate scleractinian corals, highlighting their developmental plasticity, showing different forms of propagation and different responses to environmental change. For the first time, sexuality and reproductive mode in Caryophyllia inornata were determined. An unusual embryogenesis without a clear seasonal pattern was observed, suggesting the possibility of an asexual origin. Sexual reproduction of Astroides calycularis was governed by annual changes in seawater temperature, as observed for other Mediterranean dendrophylliids. Defining the reproductive biology of these species is the starting point for studying their potential response to variations of environmental parameters, on a global climate change context. The results on the influence of temperature on reproductive output of the zooxanthellate (symbiosis with unicellular algae) Balanophyllia europaea and the non-zooxanthellate Leptopsammia pruvoti suggest that the latter may be quite tolerant to temperature increase, since the zooxanthellate species resulted less efficient at warm temperatures. A possible explanation could be related to their different trophic system. In B. europaea thermal tolerance is primarily governed by the symbiotic algae, making it more sensitive to temperature changes. On the contrary, the absence of symbionts in L. pruvoti might make it more resistant to temperature. In a progressively warming Mediterranean, the efficiency on scleractinian reproduction could be influenced in different ways, reflecting their extraordinary adaptability.

Los ovarios de cabras prepúberes proporcionan una población de ovocitos de pequeño diámetro con una menor competencia para el desarrollo hasta blastocisto después de la maduración, fecundación y posterior cultivo in vitro (MIV, FIV y CIV). Las condiciones del cultivo in vitro aportan los requerimientos necesarios a los ovocitos e influyen sobre su posterior desarrollo embrionario. En esta tesis hemos llevado a cabo dos estudios para evaluar los efectos de la adición de diferentes suplementos a los medios de MIV y CIV sobre el desarrollo embrionario y la calidad de los blastocistos obtenidos a partir de ovocitos de cabras prepúberes. En ovocitos de hembras prepúberes, la adición de sustancias, incluyendo las hormonas gonadotrópicas, factores de crecimiento, fuentes de proteínas y antioxidantes, como son el complejo insulina-transferrina-selenio (ITS) y el L-ácido ascórbico (AA), han demostrado producir una mejora en la maduración citoplasmática de los ovocitos y su subsiguiente desarrollo embrionario in vitro. El objetivo del primer estudio fue evaluar los efectos de la adición de AA, ITS y un bajo nivel hormonal en el medio de MIV sobre el desarrollo embrionario y la calidad de los blastocistos obtenidos. En concreto, hemos utilizado 4 medios maduración: Medio Tradicional (MT), Medio de Crecimiento (MC): MT + ITS + AA + bajo nivel hormonal, Medio Tradicional modificado (MTm): MT + bajo nivel hormonal y Medio de Crecimiento modificado (MCm): MT + ITS + AA + nivel hormonal normal. Los complejos–ovocito-cúmulus (COCs) se clasificaron en dos grupos según el diámetro ovocitario: pequeños (<125μm) y grandes (≥125μm). Los ovocitos ≥125μm fueron madurados en MT mientras que los ovocitos <125μm fueron madurados en combinaciones de MT, MC, MTm y MCm. Después de la MIV, los ovocitos fueron fecundados in vitro y posteriormente los embriones fueron CIV durante 8 días. En este estudio se observó que el desarrollo embrionario de los ovocitos <125 μm no mejoró en las diferentes combinaciones de medios de MIV estudiadas (MT, MC, MTm y MCm). El mayor desarrollo hasta blastocisto se obtuvo en el grupo de embriones procedentes de ovocitos ≥125μm. Sin embargo, cuando los ovocitos de menor diámetro se maduraron en MC, se observó una mejoría significativa en la calidad de los blastocistos obtenidos, optimizando la supervivencia de los embriones tras la descongelación comparado con el MT (53.3% vs 30.8%, respectivamente; P<0.05). En el segundo estudio se analizó el efecto de la suplementación de los medios de MIV y CIV con activina-A sobre el desarrollo embrionario. La activina-A es un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante β (TGF-β) y cumple un papel importante en la proliferación y diferenciación celular. Con el fin de determinar el efecto de la activina-A sobre los ovocitos de cabras prepúberes, se realizaron 2 experimentos, analizando la maduración nuclear de los ovocitos, su posterior desarrollo embrionario y calidad de los blastocistos obtenidos. En el primer experimento se estudió la suplementación del medio de MIV con varias concentraciones de activina-A (0, 10 y 100 ng/mL) y en el segundo experimento se evaluó la adición de 10 ng/mL de activina-A a los medios de MIV y CIV. Los resultados de este estudio demostraron que la suplementación del medio de MIV con diferentes concentraciones de activina-A proporciona similares porcentajes de maduración nuclear y de blastocistos comparado con la MIV sin activina-A. Además, la adición de 10 ng/mL de activina-A durante el CIV aumentó significativamente las tasas de desarrollo hasta blastocisto en comparación con el grupo control (19.5 ± 2.21% vs. 13.1 ± 2.37%, respectivamente; P<0.05). Sin embargo, no se observó una mejora en la calidad de los blastocistos cuando se añadió activina-A en el medio de MIV (evaluada por la tinción de Hoechst 33342) y/o en el de CIV (evaluado por la tinción diferencial). En conclusión, la maduracíon in vitro de los ovocitos de cabras prépuberes de diámetro <125 μm en medio de crecimiento sería una alternativa útil para mejorar la calidad de los blastocistos producidos in vitro, mientras que la presencia de activina-A durante el cultivo in vitro incrementa el porcentaje de embriones desarrollados hasta el estadío de blastocisto. / The prepubertal goat ovary shows a large number of small oocytes with a compromised competence to develop up to blastocyst stage following IVM, IVF and IVC. Culture conditions used to support in vitro embryo production appears to be an important factor to suit the requirements of these oocytes and to increase the blastocyst yield. In the present thesis work, we have carried out two studies to evaluate the effects of addition of different supplements to in vitro maturation and culture media on embryo development and the quality of resultant blastocyst in prepubertal goat oocytes. In oocytes from prepubertal females, different types and concentrations of substances including gonadotrophic hormones, growth factors, protein sources and antioxidants, such as insulin-transferrin-selenium (ITS) and L-ascorbic acid (AA), have been shown to improve oocyte cytoplasmic maturation and embryo development. The aim of the first study was to assess the effects of adding low level of hormones and/or ITS plus AA to IVM medium through the developmental competence and embryo quality of small oocytes from prepubertal goats. Specifically, we tested four maturation media: conventional IVM medium (CM), CM+ITS+AA and low level of hormones (named as Growth Medium; GM), CM with low level of hormones (modified CM; mCM) and CM+ITS+AA and normal level of hormones (modified GM; mGM). Cumulus-Oocyte Complexes (COCs) were classified into two categories according to oocyte diameter: small (<125 μm) and large (≥125 μm) oocytes. Large oocytes were matured in CM and small oocytes were matured in different combination of CM, GM, mCM or mGM. After IVM, oocytes were fertilized and after 24h presumptive zygotes were cultured for 8 days. Results of this study showed that using different combinations of CM, GM, mCM, and mGM for IVM of prepubertal goat small oocytes did not have a beneficial effect on the percentage of blastocysts. The high blastocyst rate was only related to oocyte diameter. However, the culture of small oocytes in GM improved the quality of blastocysts and enhanced their survival post-warming compared to CM (53.3% vs 30.8%, respectively; P<0.05). The second study examined the effect of activin-A during IVM and embryo culture on the blastocyst rate of prepubertal goat oocytes. Activin is a member of the transforming growth factor β superfamily that plays a functional role in the process of cellular proliferation and differentiation. In experiment 1, with a view to search for optimal concentration of recombinant human activin-A during IVM, three concentrations (0, 10 and 100 ng/mL) were tested on oocytes meiotic maturation and subsequent in vitro embryo development. The experiment 2 was performed to evaluate the effect of adding 10 ng/mL activin-A at the IVM and/or IVC media on embryo development and blastocyst quality. Results of this study demonstrated that the addition of activin-A to IVM yielded similar percentages of maturation and blastocyst. Moreover, the addition of 10 ng/mL of activin-A throughout the whole embryo culture significantly increased rates of development to the blastocyst stage as compared with the control group (19.5 ± 2.21% v. 13.1 ± 2.37%, respectively; P<0.05). Blastocyst quality was not improved in the presence of activin-A neither during IVM evaluated after Hoechst 33342 staining, nor during IVM and/ or IVC evaluated by differential staining. In conclusion, IVM of prepubertal goat small oocytes in GM would be useful to improve the intrinsic quality of blastocysts produced in vitro and the presence of activin-A during IVC enhances embryo development of prepubertal goat oocytes.

Orientador: Paulo da Cunha Lana / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Ciencias Biológicas - Zoologia. Defesa: Curitiba, 10/03/2006 / Inclui bibliografia / Área de concentraçao: Zoologia

Orientador: Claudio de Oliveira / Banca: Daniela Calcagnotto / Banca: Cristiano Rangel Moreira / Banca: Anderson Luís Alves / Banca: Flávio César Thadeo de Lima / Resumo: Entre os Ostariophysi, os Characiformes são peixes exclusivamente de água doce e encontram-se distribuídos nas Américas e na África, atingindo maior diversidade nas principais drenagens neotropicais. Esta ordem compreende cerca de 2000 mil espécies, dividida em 18 famílias, sendo quatro africanas e as demais neotropicais. A família Characidae é o grupo mais especioso entre os Characiformes, abrangendo cerca de 1100 espécies válidas, divididas em 14 subfamílias e com diversos gêneros considerados incertae sedis. Ao longo dos anos essa família vem sofrendo várias modificações na sua classificação, mas muito pouco se conhece sobre as relações filogenéticas de seus membros constituintes. A própria monofilia da família ainda é muito discutida. O objetivo principal do presente trabalho foi testar a hipótese segundo a qual a família Characidae é monofilética, através da análise de sequências de DNA mitocondrial (16S, Citocromo B e ATPase 8/6) e nuclear (Rag1, Rag2, Myh6, Sreb2 e Glyt) de representantes de cada uma das subfamílias de Characidae, de gêneros considerados incertae sedis em Characidae, de todas as demais famílias de Characiformes e de representantes de Cypriniformes (como grupo externo). O monofiletismo de Characiformes é confirmado no presente estudo, corroborando vários estudos anteriores. As 14 subfamílias reconhecidas em Characidae, não formam um grupo monofilético, em nenhuma das filogenias geradas (máxima verossimilhança, máxima parcimônia e análise Bayesiana), refutando a hipótese de monofilia de Characidae. Por outro lado, muitos grupos monofiléticos foram identificados em Characiformes, inclusive um grupo de caracídeos que é identificado como família Characidae, monofilética / Abstract: Among the Ostariophysi, Characiformes are exclusively freshwater fish distributed in the Americas and Africa, reaching the greatest diversity in the major drainages in the neotropics. This order comprises some 2,000 species, divided into 18 families, being four African and the remaining Neotropical. The family Characidae is the richest group among Characiformes, comprising about 1100 valid species, divided in 14 subfamilies and several genera considered incertae sedis. Over the years this family has suffering several modifications in its classification, but very little is known about the phylogenetic relationships of its members. Even the monophyly of the family is still debated. The main objective of this study was to test the hypothesis that the family Characidae is monophyletic, through of analysis of mitochondrial DNA sequences (16S, Cytochrome B, and ATPase 8/6) and nuclear sequences (RAG1, RAG2, Myh6, Sreb2, and Glyt) of representatives of all the subfamilies of Characidae, of genera considered incertae sedis in Characidae, of representatives of all remained families of Characiformes, and representatives of Cypriniformes, as outgroup. The monophyly of Characiformes is confirmed in this study, corroborating several previous studies. The 14 subfamilies recognized in Characidae do not form a monophyletic group in any the generated phylogenies (maximum likelihood-ML, maximum parsimony-MP and Bayesian analysis-B), refuting the hypothesis of monophyly of Characidae. On the other hand, many monophyletic groups were identified in Characiformes, including a group of characids which is identified as a monophyletic family Characidae / Doutor