This work investigates the death and degradation of the second polar body of the nematode C. elegans in order to improve our understanding how pluripotent undifferentiated cells deal with dying cells. With the use of fluorescence microscopy this work demonstrates that both polar bodies loose membrane integrity early. The second polar body has contact to embryonic cells and gets internalized, dependent on the Rac1-ortholog CED-10. The polar body gets degraded via LC3-associated phagocytosis. While lysosome recruitment depends on RAB-7, LC3 does not improve lysosome recruitment but still accelerates polar body degradation. This work establishes the second polar body as a genetic model to study cell death and LC3-associated phagocytosis and has revealed further aspects of phagosome maturation and degradation. / Um besser zu verstehen, wie undifferenzierte pluripotente Zellen mit abgestorbenen Zellen umgehen, wird in dieser Dissertation die Phagozytose und der Abbau des 2. Polkörpers der weiblichen Meiose im Fadenwurm C. elegans untersucht. Mithilfe von fluorenzenzmikroskopischen Aufnahmen wird in dieser Arbeit gezeigt, dass beide Polkörper schon früh ihre Membranintegrität verlieren. Der 2. Polkörper, welcher direkten Kontakt zu embryonischen Zellen hat, wird daraufhin mithilfe des Rac1-Orthologs CED-10 phagozytiert. Es wird gezeigt, dass es sich bei dem Abbauprozess um LC3-assoziierte Phagozytose handelt. Die RAB-7 GTPase ist notwendig für die Rekrutierung von Lysosomen, während LC3 darauf keinen Einfluss hat, aber trotzdem den Abbau des Polkörpers beschleunigt. Mit dieser Arbeit konnte ein genetisches Modell für die Erforschung von Zelltod und der LC3-assoziierten Phagozytose entwickelt werden und weitere Aspekte der Phagosomreifung und des -abbaus aufgedeckt werden.

Typisch für die Alzheimer' schen Erkrankung ist die Bildung unlöslicher Ablagerungen im Gehirn, sogenannter "seniler Plaques". Diese Plaques bestehen im Wesentlichen aus fibrillärem beta-Amyloid, das durch Glykierungen verändert vorliegen kann. Außerdem beinhalten die Plaques, sogenannte AGEs "Advanced Glycation Endproducts", die aus nichtenzymatisch glykierten Proteinen entstehen. Diese AGE-modifizierten Proteine sowie das fibrilläre beta-Amyloid sind in der Lage Mikrogliazellen zu aktivieren. Die sessilen Gehirnmakrophagen wirken in aktiviertem Zustand neurotoxisch, wobei es verschiedene Hypothesen gibt, wie die Mikrogliazellen zu dem neuronalen Zelltod führen. Um dieses zu untersuchen wurden murine Mikrogliazellen herangezogen, die als Merkmal ihrer Aktivierung auf die Translokation des Transkriptionsfaktors NF-kappa-B in den Zellkern überprüft wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Rahmenbedingungen näher untersucht, die zu der AGE vermittelten Mikrogliaaktivierung führen. Es wurde in vitro gezeigt, daß die Mikrogliaaktivierung zunächst durch eine hochmolekulare Hyaluronsäure, wie sie nativ in der extrazellulären Matrix vorliegt, verhindert wird. Im Gegensatz dazu konnte NF-kappa-B in Mikrogliazellen aktiviert werden, die in Gegenwart von Hyaluronsäurefragmenten mit AGE behandelt wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, daß die Mikrogliaaktivierbarkeit umgekehrt proportional zu der durchschnittlichen Hyaluronsäuremolekülgröße ist. Andere Glykosaminoglykane aus der extrazellulären Matrix, wie D-Glukuronsäure, N-Azetylglukosamin oder Chondroitin-4-sulfat reduzierten die Aktivierbarkeit der Mikrogliazellen nur geringfügig. Sowohl beta-Amyloid, als auch AGEs setzen während ihres Entstehungsprozesses reaktive Sauerstoffspezies frei, die Hyaluronsäure in kleinere Bruchstücke zerschneiden können. Die Signaltransduktion der AGE-aktivierten Mikrogliazellen wurde mittels unterschiedlicher Inhibitoren gehemmt und die Auswirkung auf die NF-kappa-B Aktivierung untersucht. Hier zeigte sich ein komplexes Netzwerk an aktivierten Signalwegen, so daß kein Rückschluß auf einen bestimmten Rezeptor möglich war. Daher wurde ein "in vitro Modell" entwickelt, um die ausschlaggebende neurotoxischen Komponenten der Mikrogliareaktion aufzufinden. Darin wurden die Signalkaskaden der aktivierten Mikroglia erneut durch pharmakologische Inhibierung unterbrochen, das zellfreie Medium das von diesen Mikrogliazellen sezerniert wurde, wurde als "konditioniertes Medium" für die Kultur muriner Neuronen eingesetzt. Diese wurden bezüglich ihrer Überlebensrate in diesem konditionierten Medium untersucht. Die Hemmung der Transkription oder der Translation in den Mikrogliazellen zeigte keine Reduktion der neurotoxischen Wirkung des konditionierten Mediums. Ebensowenig wirkten Inhibitoren der mitochondrialen Atmungskette, der Radikalquellen Xanthin Oxidase, Lipoxygenase oder Cyclooxygenase. Die Hemmung der NADPH Oxidase reduzierte die Neurotoxizität des konditionierten Mediums auf etwa 30 Prozent. Die NADPH Oxidase ist ein Enzymkomplex, der im Rahmen des "oxidativen bursts" große Mengen Superoxidanionen freisetzt. Um die Bedeutung der NADPH Oxidase Aktivierung für die neurotoxische Wirkung nachzuweisen, wurde eine Untereinheit der NADPH Oxidase, das membranständige gp91phox in den Mikrogliazellen deaktiviert. Dies führte dazu, daß diese Zellen kein Superoxid auf die Stimulation mit beta-Amyloid oder AGE hin abgaben, im Gegensatz zu den Mikrogliazellen mit funktioneller NADPH Oxidase. Das konditionierte Medium der NADPH Oxidase defizienten Zellen war nicht mehr neurotoxisch. Die freien Sauerstoffradikale die aufgrund der NADPH Oxidase Aktivierung entstehen, können zu einer NF-kappa-B Aktivierung führen. NF-kappa-B wurde erfolgreich in den Mikroglia durch exogenes Wasserstoffperoxid stimuliert, wobei aber keine neurotoxische Wirkung im Modellsystem festgestellt wurde. NF-kappa-B scheint damit nicht für die mikrogliavermittelte Neurotoxizität verantwortlich zu sein, im Gegensatz zu der NADPH Oxidase, deren Aktivität unmittelbar mit der Neurotoxizität korreliert ist. / Senile plaques are a hallmark in Alzheimer's Disease progression. These plaques consist mainly of fibrillar beta-amyloid, which can be modified by glycation. In addition these plaques contain so called AGEs "Advanced Glycation Endproducts", emerging from nonenzymatic glycated proteins. Subsequent dehydration, condensation and oxidation produces a heterogenous group of heterocyclic, coloured and fluorescent compounds. These AGE modified proteins are resistant to proteases and their formation is irreversible. AGEs and beta-amyloid are able to activate Microglia cells, resulting in a neurotoxic effect, with several hypothesis of how microglia contribute to neuronal cell death. To investigate the neurotoxic effect murine microglia cells were used. The NF-kappa-B translocation into the nucleus was taken as an indicator of microglial activation. In this work conditions were investigated, that are necessary to activate murine microglia cells by AGE stimulation. High molecular weight hyaluronic acid from extracellular matrix, in its native form, is inhibiting activation of microglia cells in vitro. In contrast NF-kappa-B was activated in AGE stimulated microglia cells in the presence of low molecular weight hyaluronic acid fragments. Here it was shown that the ability to activate microglia cells is inversly proportional to the average size of the hyaluronic acid. The ability for activation of microglia cells was reduced only in parts by other extracellular matrix glycosaminoglycans, like D-glucuronic acid, N-acetylglucosaminoglycane or chondroitine-4-sulfate. Ab and AGEs release reactive oxyen species during their develompent, which were shown to be able to cleave hyaluronic acid into small fragments. The signal transduction of AGE activated microglia cells was examined by measurement of NF-kappa-B activation reduced by different inhibitors. A complex network of signaling pathways was detected, without revealing a certain receptor. Therefore an "in vitro model" was established, to find out the main neurotoxic component in the reaction of microglia cells. Again the signaling pathways were inhibited pharmacologically, using the cell free medium produced by these microglia cells as "conditioned medium" in neuronal cell culture. The murine neuronal cells were tested for their surviving in the conditioned medium, to correlate activated signal pathways with neurotoxicity. Inhibition of translation or transcription in microglia cells led to no reduction of the neurotoxic effect of the conditioned medium, nor did the inhibition of the mitochochondrial respiratory chain or the radical sources xanthine oxidase, lipoxygenase or cyclooxygenase. Inhibition of NADPH oxidse was able to reduce the neurotoxicity of the conditioned medium down to 30 per cent. The NADPH oxidase is an enzyme complex , releasing huge numbers of superoxide anion radicals during the "oxidative burst". The neurotoxic component was released 30 min after activation of microglia cells into the conditioned medium, was bigger than 50 kDa and was removed out of the conditioned medium by EDTA chelation followed by dialysis. To proof the importance of NADPH oxidase activation for neurotoxicity, a part of the NADPH oxidase, the membranebound gp91phox was disrupted by gene targeting. As a consequence these cells did not react with superoxide release, when treated with beta-amyloid or AGE. Conditioned medium of these cells was not neurotoxic, in contrast to that of the microglia cells with a functional NADPH oxidase. The reactive oxygen species resulting from the NADPH oxidase activity are able to activate NF-kappa-B. Because of the wide range of gene activation performed by NF-kappa-B, there are various potential neurotoxic gene products to consider. For that reason NF-kappa-B was stimulated sucessfully in microglia cells with exogenous hydrogen stimulation, without a neurotoxic result in the model system. Activated NF-kappa-B seems not to be responsible for the microglia mediated neurotoxicity, whereas there is a direct correlation of NADPH oxidase activity and neurotoxicity.

Die Adipositasepidemie hat sich in den letzten Jahrzehnten, vor allem in westlichen Ländern, weiter ausgebreitet. Eine chronische Fettgewebeentzündung stellt eine pathophysiologische Schnittstelle von Übergewicht mit den zahlreichen adipositasassoziierten Krankheiten dar. Diese Entzündung ist zwar bereits ausführlich beschrieben, ihr genauer Auslöser allerdings ungeklärt. Das gehäufte Auftreten von crown-like structures (CLS, kronenartige Strukturen) gilt als guter Indikator für eine Fettgewebeentzündung. Diese Strukturen zu untersuchen, gestaltet sich aber, mangels Methoden zur Induktion von CLS, schwierig. In dieser Arbeit verwendeten wir eine transgene Mauslinie, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) in Makrophagen und über die Cre-ERT2 induzierbar das rot fluoreszierende tdTomato in Adipozyten exprimiert. Zunächst nutzten wir dieses Modell, um die Induzierbarkeit über Tamoxifen (TAM)-Applikation in unserem Organkultursystem von intaktem Fettgewebe zu verifizieren. Drei Tage nach einmaliger Zugabe von TAM ins Kulturmedium exprimierten nahezu alle Adipozyten tdTomato. Die in anderen Arbeiten beschriebene, fast vollständige Induzierbarkeit bleibt also in unserem Organkulturmodell erhalten. Auffällig war allerdings, dass vereinzelt Adipozyten bereits vor der Zugabe von TAM tdTomato exprimierten. Weitere Untersuchungen enthüllten verschieden Faktoren, die die spontane Rekombination in vivo beeinflussen. Weibliche Mäuse wiesen mehr tdTomato exprimierende Adipozyten auf als männliche und homozygote deutlich mehr als heterozygote Tiere. Exprimierten in heterozygoten Männchen ca. 9 % der Adipozyten tdTomato ohne TAM-Applikation, waren es 70% in homozygoten Weibchen. Außerdem stieg der Anteil tdTomato exprimierender Adipozyten mit dem Alter der Mäuse an. Diese nicht induzierte Rekombinaseaktivität kann zu einem hohen Hintergrundsignal in Kontrollgruppen führen und vermindert die TAM-vermittelte Induzierbarkeit vor allem in homozygoten Tieren deutlich. Bei Verwendung von induzierbaren Cre-Rekombinasen ist es daher wichtig, zunächst an Kontrolltieren mit passendem Alter, Geschlecht und Genotyp auf nicht induzierte Rekombinaseaktivität zu testen. Ziel dieser Arbeit war es, das erste Modell zu entwickeln, um gezielt die Formation von CLS in intaktem Fettgewebe zu induzieren. Die Hypothese dafür war, dass die Bildung von CLS kein Artefakt der Fettgewebeentzündung ist, sondern der natürliche Abbaumechanismus von toten Adipozyten, die zu groß für klassische Phagozytose sind. Aus diesem Grund kultivierten wir Fettgewebe von dünnen Mäusen und nutzten die Laser eines Konfokalmikroskops um Adipozyten gezielt zu depletieren. Der verwendete lichtmikroskopische Ansatz erlaubte anschließend, die Makrophagenbewegung in Echtzeit zu dokumentieren. Zwölf Stunden nach induziertem Adipozytentod kam es bereits zur Migration von Makrophagen zur Stelle des Laserschadens. Ab 24 Stunden nach Adipozytentod bildeten diese Makrophagen CLS. Die Präzision des verwendeten Laserschadens erlaubt hierbei die gezielte Depletion einzelner Adipozyten ohne größeren Gewebeschaden, um die Bildung von CLS zu induzieren. Die so induzierten CLS untersuchten wir mittels post hoc Immunfluoreszenzfärbungen auf die Expression verschiedener Marker. Makrophagen in CLS exprimierten die proinflammatorischen Marker CD11c, CD86 und CD9, während die im Gewebe verteilten Makrophagen die antiinflammatorischen Marker CD301 und CD206 exprimierten. Diese Ergebnisse verifizierten wir mit Färbungen von in vivo gebildeten CLS im Fettgewebe dünner Mäuse und beobachteten hier eine vergleichbare Expression der pro- und antiinflammatorischen Marker. Des Weiteren analysierten wir die Art des durch den Laserschaden induzierten Adipozytentods genauer. Die Membran der bestrahlten Adipozyten war gut mit Annevin V anfärbbar, was auf die Externalisierung von membranständigem Phosphatidylserin schließen lässt, während die Kerne keine DAPI-Färbung aufwiesen. Die Phosphatidylserinexternalisierung bei Erhalt der Membranintegrität ist bei apoptotischem Zelltod, in der Regel aber nicht bei nekrotischem Zelltod, zu beobachten. Die induzierte CLS-Bildung scheint also eine Reaktion auf apoptotischen Adipozytentod zu sein. Ein klassisches Modell unterscheidet zwischen proinflammatorischen (M1) und antiinflammatorischen (M2) Makrophagen. Mit fortschreitender Fettgewebeentzündung steigt der Anteil der M1-Makrophagen immer weiter an. Für diesen Anstieg wurden sowohl die Rekrutierung von Blutmonozyten, als auch ein „phenotpical switch“ von residenten Makrophagen postuliert. Da Makrophagen in unseren induzierten CLS die entsprechenden M1-Marker exprimieren und residente Makrophagen außerhalb von CLS stattdessen M2-Marker, liefert unser Modell erstmals direkte Nachweise für den „phenotypical switch“ von Makrophagen in CLS. Die Rekrutierung dagegen ist in unserem ex vivo Organkulturmodell ausgeschlossen. Um sicherzustellen, dass auch CLS in vivo durch residente Makrophagen gebildeten werden, analysierten wir das Fettgewebe von Wildtypmäusen, die sich einen Blutkreislauf mit GFP exprimierenden Parabiosepartnern teilten. So konnten wir zeigen, dass die Makrophagenpopulation im Fettgewebe zwar teilweise durch Monozytenrekrutierung erhalten wird, CLS jedoch nicht verstärkt durch rekrutierte Makrophagen gebildet werden. Auch freie Fettsäuren gelten allgemein als proinflammatorisch. Weder Stimulierung mit Palmitat noch Kontakt zu bei der Kultivierung entstehenden kleineren Fetttröpfen führte in unseren Experimenten zu einer vergleichbaren Änderung des Phänotyps der Makrophagen wie nach Adipozytentod in unserem Modell. Der beobachtete „phenotypical switch“ scheint also direkt mit der Bildung von CLS zusammenzuhängen. Im Fettgewebe von Mäusen, die eine hochkalorische Diät erhielten, konnten wir eine CLS-Bildung mit einem vergleichbaren zeitlichen Ablauf und vergleichbarer Häufigkeit induzieren. Dies ist ein weiterer Hinweis dafür, dass CLS der biologische Abbauweg für tote Adipozyten sind und kein Entzündungsartefakt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sich CD11c gut als Marker eignet, um Makrophagen in induzierten CLS von interstitiellen Makrophagen zu unterscheiden. Dieses Ergebnis nutzten wir, um die Makrophagen zu sortieren und mittels RNA-Sequenzierung den Phänotyp der CLS- bildenden Makrophagen über die verwendeten Marker hinaus zu untersuchen. Dabei zeigte sich eine erhöhte Expression vieler weiterer M1-Markerproteine in CD11c positiven Makrophagen, während M2-Gene vermindert exprimiert wurden. Außerdem zeigten die Makrophagen in CLS eine erhöhte Expression von Genen, wie sie laut Literatur durch metabolische Aktivierung (Stimulierung mit Palmitat, Insulin und Glukose) induziert wurde, sowie eine erhöhte Expression verschiedener Gene des Lipidmetabolismus. Zusätzlich zeigten sich Veränderungen in der Expression einiger Chemokine oder ihrer Rezeptoren, was ein Hinweis auf einen gezielten Mechanismus zur Rekrutierung von Makrophagen zur CLS-Bildung sein könnte. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass Adipozytentod die CLS-Bildung in gesundem Fettgewebe ohne Dysfunktion induziert. Damit einher geht der „phenotypical switch“ der Makrophagen in diesen CLS zu einem metabolisch aktivierten Phänotyp. Dieser Phänotyp ist assoziiert mit erhöhter Exozytose von lysosomalen Proteinen und beschleunigtem Lipidstoffwechsel zum Verdau des toten Adipozyten. Andere Gruppen konnten außerdem zeigen, dass metabolisch aktivierte Makrophagen verstärkt proinflammatorische Zytokine, wie TGFβ, TNFα und IL-1β, sezernieren. Der langsame Abbau von Adipozyten in CLS führt also zur Aktivierung von Signalwegen in Makrophagen, wie sie auch bei ineffektiver Phagozytose und sekundärer Nekrose anderer Zellarten zu beobachten ist. Gehemmte Phagozytose führt in anderen Geweben zu einer chronischen Entzündung, vergleichbar mit der adipositasassoziierten Entzündung in dysfunktionalem Fettgewebe. In dieser Arbeit konnten wir weiterhin zeigen, dass Alter, Genotyp und Geschlecht einen großen Einfluss auf die nicht induzierte Aktivität der untersuchten Cre-Rekombinase haben. Außerdem haben wir ein Modell etabliert, um gezielt CLS-Bildung zu induzieren. Mit Hilfe dieses Modells konnten wir zeigen, dass Adipozytentod auch im Fettgewebe von dünnen Mäusen ohne zu Grunde liegende Fettgewebeentzündung zu CLS-Bildung führt. Makrophagen in CLS weisen zudem einen anderen Phänotyp auf als im Gewebe verteilte Makrophagen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Adipozytentod im Fettgewebe dünner Mäuse lokal einen proinflammatorischen, metabolisch aktivierten Phänotyp induziert, wie er im Fettgewebe von Mäusen nach einer hochkalorischen Diät oder nach Stimulierung mit Palmitat, Insulin und Glukose beobachtet werden konnte. Diese Arbeit liefert damit Hinweise, dass vermehrter Adipozytentod und durch Fettzellhypertrophie länger bestehende CLS die treibenden Kräfte hinter der chronischen Fettgewebeentzündung sind, die verantwortlich für die diversen, mit Übergewicht vergesellschafteten Krankheiten ist.:1 Einführung 1.1 Fettgewebe 1.2 Adipositas und adipositasassoziierte Krankheiten 1.3 Die Fettgewebeentzündung 1.4 Funktionen von Makrophagen 1.5 Fettgewebemakrophagen 1.6 Crown-like structures 1.7 Efferozytose apoptotischer und nekrotischer Zellen 1.8 Das Cre-loxP-System 1.9 Zielsetzung 2 Publikationen 2.1 Unspecific DNA recombination in AdipoqCre-ERT2 – mediated knockout approaches in transgenic mice is sex-, age- and genotype-dependent 2.2 Adipocyte death triggers a pro inflammatory response and induces metabolic activation of resident macrophages 3 Zusammenfassung der Arbeit 4 Literaturverzeichnis 5 Darstellung des eigenen Beitrags des Promovierenden zu den Publikationen 5.1 Unspecific DNA recombination in AdipoqCre-ERT2 – mediated knockout approaches in transgenic mice is sex-, age- and genotype-dependent 5.2 Adipocyte death triggers a pro inflammatory response and induces metabolic activation of resident macrophages 6 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 7 Publikationen im Rahmen der Promotion 8 Danksagung

Signaling pathways of regulated necrosis, such as necroptosis and ferroptosis, contribute to acute kidney injury (AKI), but the role of pyroptosis is unclear. Pyroptosis is mediated by the pore-forming protein gasdermin D (GSDMD). Here, we report a specific pattern of GSDMD-protein expression in the peritubular compartment of mice that underwent bilateral ischemia and reperfusion injury (IRI). Along similar lines, the GSDMD-protein expression in whole kidney lysates increased during the first 84 h following cisplatin-induced AKI. Importantly, unlike whole kidney lysates, no GSDMD-protein expression was detectable in isolated kidney tubules. In IRI and cisplatin-induced AKI, GSDMD-deficient mice exhibited hypersensitivity to injury as assessed by tubular damage, elevated markers of serum urea, and serum creatinine. This hypersensitivity was reversed by a combined deficiency of GSDMD and the necroptosis mediator mixed lineage kinase domain-like (MLKL). In conclusion, we demonstrate a non-cell autonomous role for GSDMD in protecting the tubular compartment from necroptosis-mediated damage in IRI.

The cytosolic protein rubicon (RUBCN) has been implicated in the removal of necrotic debris and autoimmunity. However, the role of RUBCN in models of acute kidney injury (AKI), a condition that typically involves necrotic kidney tubules, was not investigated. Here, we demonstrate that RUBCN-deficient mice are hypersensitive to renal damage induced by ischemia-reperfusion injury (IRI) and cisplatin-induced AKI. Combined deficiency of RUBCN and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) partially reversed the sensitivity in the IRI model suggesting that the absence of RUBCN sensitizes to necroptosis in that model. Necroptosis is known to contribute to TNFα-induced severe inflammatory response syndrome (SIRS), but we detected no statistically significant difference in overall survival following injection of TNFα in RUBCN-deficient mice. We additionally generated RUBCN-deficient mice which lack gasdermin D (GSDMD), the terminal mediator of pyroptosis, but no reversal of the AKI phenotype was observed. Finally, and in contrast to the previous understanding of the role of RUBCN, we did not find a significant autoimmune phenotype in RUBCN-deficient mice, but detected chronic kidney injury (CKD) in aged RUBCN-deficient mice of both sexes. In summary, our data indicate that RUBCN-deficient mice are hypersensitive to kidney injury.

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A major challenge in designing cancer therapies is the induction of cancer cell apoptosis, although activation of intrinsic apoptotic pathways by targeting gold nanoparticles to mitochondria is promising. We report an in vitro procedure targeting mitochondria with conjugated gold nanoparticles and investigating effects on apoptosis induction in the human breast cancer cell line Jimt-1. Gold nanoparticles were conjugated to a variant of turbo green fluorescent protein (mitoTGFP) harbouring an amino-terminal mitochondrial localization signal. Au nanoparticle conjugates were further complexed with cationic maltotriose-modified poly(propylene imine) third generation dendrimers. Fluorescence and transmission electron microscopy revealed that Au nanoparticle conjugates were directed to mitochondria upon transfection, causing partial rupture of the outer mitochondrial membrane, triggering cell death. The ability to target Au nanoparticles into mitochondria of breast cancer cells and induce apoptosis reveals an alternative application of Au nanoparticles in photothermal therapy of cancer.

Regulated cell death (RCD) is indispensable for homeostasis and plays a crucial role in the pathophysiology of numerous diseases. Adrenocortical carcinomas (ACCs) represent a rare and highly malignant type of cancer. Currently, the most common therapeutic options include the complete surgical removal of the adrenal gland and/or the administration of mitotane, a derivative of the pesticide DDT. Yet patient survival remains poor and the mechanism of action of mitotane remains elusive. In this thesis it is demonstrated that the human ACC cell line NCI-H295R is sensitive to mitotane-induced cell death. In the first part, the involvement of three different RCD pathways, namely apoptosis, necroptosis and ferroptosis, in mitotane induced necrosis was investigated. To this end, different inhibitors were used, which were not able to block mitotane-induced cell death. When the medium was supplemented with insulin, transferrin, sodium selenite and linoleic acid (ITS+1) no cell death of the ACC cells was observed. This phenomenon was attributed to the presence of linoleic acid, since ITS supplementation lacking this component was not able to reverse mitotane-induced necrosis. Identification of new drug targets for alternative options of ACC treatment led to the investigation of key molecules involved in the pathways of necroptosis and ferroptosis. The receptor-interacting protein kinase 1 and 3 (RIPK1 and 3) and the mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL) were considered as interesting targets given their crucial role in the execution of necroptosis. A western blot analysis of those molecules revealed the presence only of RIPK1, suggesting that the necroptosis machinery is not present in the NCI-H295R cells. Of interest, evaluation of the expression levels of glutathione peroxidase four (GPX4), one of the main inhibitory molecules of ferroptosis, showed a much higher expression in the ACC cells compared to the standard cell line used for studying ferroptosis, the human fibrosarcoma HT1080 cells. A hypothesis that the NCI-H295R cells are susceptible to ferroptosis induction was formed based on this finding. Compounds representative of all the four classes of ferroptosis inducers (FINs) were tested. Direct inhibition of GPX4 using the small compound RSL3, a type II FIN, led to high necrotic populations. Co-treatment with the ferroptosis inhibitor ferrostatin-1 (Fer-1) completely reversed RSL3-induced ferroptosis. Type IV FIN FINO2, that causes indirect loss of the enzymatic activity of GPX4, lead also to high necrotic populations, while Fer-1 prevented FINO2-induced ferroptosis. Data from public databases concerning gene methylation or mutation status of ACC tissues and normal human adrenal tissues was used to investigate potential key players of ferroptosis that might be either mutated or silenced in ACCs. Of note, glutathione peroxidases 3 and 5 (GPX3 and 5) were highly methylated, while the enzyme cystathionine gamma-lyase (CSE) involved in the transsulfuration pathway via the break down of cystathionine into cysteine and α-ketobutyrate and ammonia was found to be highly mutated. Collectively, these data point towards a high sensitivity of ACCs to ferroptosis induction. This could provide a new chapter for the therapeutic approaches of ACCs. Additionally, these findings provide a better understanding of the biology of this type of cancer that highly mutates or silences ferroptosis-related genes. The second part of this thesis focuses on the involvement of RCD in spontaneous cell death in isolated murine tubules. Existing literature points towards an involvement of necroptosis and ferroptosis pathways in the kidney in models of acute kidney injury (AKI). Acute tubular necrosis (ATN) represents a hallmark of AKI. While the work in the Linkermann lab has shown that isolated tubules perfused with type I FIN erastin undergo cell death in a “wave-of-death” manner, no deeper insights into the propagation of tubular necrotic injury exist. A protocol for isolation of murine kidney tubules was established, providing an ex-vivo model for investigation of tubular death. The absence of potentially confounding blood cells as well as immune cells was ensured by extensive washing steps as well as the use of collagenase. Visual observation and staining of isolated tubules with the nucleic acid stain SYTOX green revealed a spontaneous cell death in a “wave-of-death” manner. This wave was running in parallel with a calcium concentration change, indicating its involvement in the spontaneous necrosis. To investigate the potential involvement of mitochondria in this process, electron microscopy images were obtained from parts of the tubules with different levels of damage which revealed highly damaged and ballooned mitochondria. These data provided with a phenotypic characterisation of the spontaneous tubular necrosis. Aiming to approach this type of death genetically, necroptosis and pyroptosis deficient mice (MLKL/GSDMDDKO) were used. Comparison of the LDH release, used as a measure of necrosis, from isolated kidney tubules of the MLKL/GSDMDDKO mice and wild type (WT) mice showed no difference. This indicated that neither necroptosis nor pyroptosis are involved in the tubular necrosis. Therefore, the next step was to investigate the effects of Fer-1 at the levels of LDH of isolated tubules from WT mice. A significantly lower LDH release was observed in tubules treated with Fer-1 compared to the ones treated with vehicle. However, this reduction in the LDH release was not complete, suggesting that ferroptosis is only partially responsible for the spontaneous death of isolated tubules. The difference of male and female mice towards AKI sensitivity has been noted in the literature in that female mice are less susceptible compared to the male mice. Therefore, the next step was to investigate whether this protection of females can be observed at the level of isolated tubules. Indeed, the LDH release from tubules isolated from female mice was significantly less compared to the LDH release of tubules isolated from male mice. Based on the data obtained from isolated tubules from WT male mice treated with Fer-1, a similar experiment was performed with tubules isolated from WT female mice. No difference in the LDH release was observed between the Fer-1-treated tubules and the vehicle-treated ones, indicating that another cell death pathway might be involved. The most obvious difference between male and female organisms is the sex hormones. Whether testosterone or β-estradiol are responsible for the higher susceptibility or protection against cell death has been a debate over the last years. To test this hypothesis, three different cell lines were utilised. A pre-treatment of 16 h with either testosterone or β-estradiol was performed. Treatment with either type I FIN erastin or type II FIN RSL3 followed, and cells were analysed via flow cytometry. Data revealed protective effects of β-estradiol against ferroptosis induction. Next, the effects of β-estradiol in a simultaneous treatment with RSL3 were investigated. Interestingly the protective effects of the hormone were still observed. Among the metabolites of β-estradiol, 2-hydroxyestradiol (2-OHE2) has been reported to exert antioxidant effects. Therefore, 2-OHE2 was used in a simultaneous treatment with RSL3, and the obtained data showed that it was a much more potent inhibitor of necrotic cell death than β-estradiol even at lower concentrations. Collectively these data indicate that the lower susceptibility of female organisms towards cell death might be explained by the presence of β-estradiol and its more potent antioxidant metabolites. Such findings could change the way the two sexes are approached scientifically, while providing new insights on different therapeutic strategies between male and female organisms.

Pilocytic astrocytoma (PA) is the most common brain tumor in children. This tumor is usually benign and has a good prognosis. Total resection is the treatment of choice and will cure the majority of patients. However, often only partial resection is possible due to the location of the tumor. In that case, spontaneous regression, regrowth, or progression to a more aggressive form have been observed. The dependency between the residual tumor size and spontaneous regression is not understood yet. Therefore, the prognosis is largely unpredictable and there is controversy regarding the management of patients for whom complete resection cannot be achieved. Strategies span from pure observation (wait and see) to combinations of surgery, adjuvant chemotherapy, and radiotherapy. Here, we introduce a mathematical model to investigate the growth and progression behavior of PA. In particular, we propose a Markov chain model incorporating cell proliferation and death as well as mutations. Our model analysis shows that the tumor behavior after partial resection is essentially determined by a risk coefficient γ, which can be deduced from epidemiological data about PA. Our results quantitatively predict the regression probability of a partially resected benign PA given the residual tumor size and lead to the hypothesis that this dependency is linear, implying that removing any amount of tumor mass will improve prognosis. This finding stands in contrast to diffuse malignant glioma where an extent of resection threshold has been experimentally shown, below which no benefit for survival is expected. These results have important implications for future therapeutic studies in PA that should include residual tumor volume as a prognostic factor.

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