O ácido lactobiônico e seus sais (lactobionatos), compostos que apresentam aplicações na área farmacêutica, foram obtidos via ação do complexo enzimático glicose-frutose oxidorredutase (GFOR)/gliconolactonase (GL) - presente no periplasma de células da bactéria Zymomonas mobilis - imobilizado em alginato de cálcio. Nas reações catalisadas por este sistema enzimático, o pH do meio deve ser controlado em valores ligeiramente ácidos. Para este fim, foram empregados NaOH, KOH ou Ca(OH)2 e, como consequência, os respectivos sais foram formados. O estudo da cinética de formação dos lactobionatos de sódio, potássio e cálcio e do próprio ácido lactobiônico foi seguido das etapas de purificação, caracterização e avaliação da estabilidade físico-química, visando à potencial utilização destes compostos na área farmacêutica. Em ensaios de bioprodução dos lactobionatos de sódio, potássio e cálcio, foram obtidos rendimentos de 74, 77 e 84%, respectivamente. Em bateladas sucessivas de bioconversão, totalizando 96 h de uso do biocatalisador, rendimentos de 80 e 56 % em lactobionatos de cálcio e de potássio foram atingidos. Na etapa de purificação dos sais, foram alcançados teores de pureza de aproximadamente 95%, sendo então procedida a caracterização dos compostos por cromatografia líquida de alta eficiência, espectrometria de massas e RMN de 13C. Nos estudos de estabilidade acelerada, de longa duração e degradação forçada, os lactobionatos de sódio, potássio e cálcio obtidos nos ensaios de bioconversão conduzidos em maior volume reacional, foram inicialmente purificados e, então, comparados frente ao ácido lactobiônico, obtido por troca iônica a partir do lactobionato de sódio, e com o ácido lactobiônico comercial (Sigma-Aldrich). Nos testes de estabilidade acelerada e de longa duração, foi constatada a estabilidade de todos os compostos por até seis meses quando expostos a 30 e 40oC e 75% de umidade relativa. Por outro lado, a presença da lactobionolactona foi identificada nas amostras dos compostos na forma ácida. Com relação aos testes de degradação forçada, os lactobionatos de sódio, potássio, e cálcio e o ácido lactobiônico se mostraram estáveis frente à exposição a soluções ácidas e alcalinas e às temperaturas avaliadas. Contudo, observou-se degradação no tratamento com solução oxidativa, com cinética de degradação de ordem zero para os sais e de segunda ordem para o ácido lactobiônico. Elevadas concentrações de produtos - lactobionatos de sódio, potássio e cálcio - foram atingidas com a utilização do sistema GFOR/GL imobilizado em alginato de cálcio. Considerando o conjunto de informações obtido, quanto à caracterização físico-química dos compostos produzidos, foi demonstrada a estabilidade frente aos diferentes parâmetros avaliados atendendo aos requisitos mínimos legais para sua aplicação na área farmacêutica. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2017-03-09T14:08:07Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Maria Gabriele Delagustin.pdf: 3945297 bytes, checksum: e76bd0d7370a803326a4ebd56fb7e6b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-09T14:08:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Maria Gabriele Delagustin.pdf: 3945297 bytes, checksum: e76bd0d7370a803326a4ebd56fb7e6b1 (MD5) Previous issue date: 2017-03-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES. / Lactobionic acid and its salts (lactobionate) are substances that have several applications in pharmaceutical area. These products were obtained by enzymatic complex glucose-fructose-oxidoreductase (GFOR)/gluconolactonase (GL) present in the periplasm of Zymomonas mobilis cells that were immobilized in calcium alginate. In the reactions catalyzed by this enzyme system, the medium pH must be controlled at slightly acid values. For this purpose, NaOH, KOH, or Ca(OH)2 were used and as a result the respective salts were formed. The kinetic study on the formation of sodium, potassium and calcium lactobionate and lactobionic acid itself was followed by the steps of purification, characterization and evaluation of the physicochemical stability, aiming the potential use of these compounds in the pharmaceutical area. In the assays for the bioproduction of sodium, potassium or calcium lactobionates, yields of 74, 77 and 84% were obtained, respectively. In repeated bioconversion batches, totalizing 96 hours of use of the biocatalyst, yields of 80 and 56% were attained for calcium and potassium lactobionate. In the salts purification step, purity levels of approximately 95% were achieved, and subsequently these compounds were characterized by high performance liquid chromatography, mass spectrometry, and C13 NMR. In the studies of accelerated, long term and forced degradation stability, the production of sodium, potassium and calcium lactobionate was carried out at higher reaction volume. The products were purified and then evaluated together with lactobionic acid that was obtained by ion-exchange from sodium lactobionate, and with a commercial lactobionic acid (Sigma-Aldrich). In the accelerated and long term stability tests, it was demonstrated the stability of all compounds when exposed to 30 and 40oC and of 75%of relative humidity for up to six months. On the other hand, the presence of lactobionolactone was identified in samples of compounds in the acid form. With respect to the forced degradation tests, sodium, potassium and calcium lactobionates and lactobionic acid have shown to be stable after exposing to both acidic and alkaline solutions and the temperatures evaluated. However, degradation was observed in the treatment with oxidative solution, with a zero-order degradation kinetics for the salts forms and second-order for lactobionic acid. High concentrations of products - sodium, potassium and calcium lactobionate - were achieved by using the Ca-alginate immobilized GFOR/GL complex. Considering the set of information obtained in regarding to physicochemical characterization, it was demonstrated the high stability of these compounds in front of different parameters evaluated, endorsing the legal minimum requirements for their application in the pharmaceutical area.

Orientador: Crispin Humberto Garcia Cruz / Banca: Mário Antonio Alves da Cunha / Banca: Pedro Oliva Neto / Banca: Ozair Souza / Banca: Vanildo Luiz Del Bianchi / Resumo: A bactéria Zymomonas mobilis é considerada um microrganismo com alto potencial biotecnológico para a produção de etanol e levana, por apresentar baixa produção de biomassa e alta tolerância a elevadas concentrações de etanol. Apesar disso, sua eficiência pode ser prejudicada, devido a exposição das células livres a condições desfavoráveis durante os processos fermentativos convencionais. A utilização de células imobilizadas é uma alternativa para solucionar tais problemas, pois oferece inúmeras vantagens como maior concentração celular, maior estabilidade e conseqüentemente maior produção. Diante disso, o objetivo deste trabalho, foi selecionar um suporte adequado para a imobilização de Zymomonas mobilis visando aumentar a produção de etanol e levana empregando sacarose como fonte de carbono. Os suportes avaliados foram: alginato, quitosana, bucha vegetal e bagaço de cana. Os melhores parâmetros para a produção de etanol e levana, foram determinados utilizando a metodologia de superfície de resposta (MSR). O primeiro experimento realizado foi 2(5-2) com as variáveis independentes: concentração de sacarose; pH; tempo de incubação; temperatura e agitação do meio de cultura. Com base nas melhores condições observadas no experimento 2(5-2) foi avaliada a capacidade de reutilização dos suportes em fermentações subseqüentes durante 12 dias. A produção de etanol foi determinada pelo método de microdifusão e a levana foi determinada indiretamente em unidades de frutose após hidrólise ácida. A biomassa foi determinada por densidade ótica a 570 nm e a fixação do microrganismo no suporte foi confirmada por microscopia eletrônica de varredura. No experimento 2(5-2), verificou-se que o melhor suporte de imobilização foi a bucha vegetal, a qual apresentou os maiores valores de biomassa imobilizada (2,95 g/L); produção de levana (24,9 g/L) e etanol (50,95 g/L). Para os experimentos com ... / Abstract: Zymomonas mobilis is considered to have high biotechnological potential for ethanol and levan production, because it produces little biomass and shows good tolerance to ethanol concentrations. However, this efficiency can be decreased if the free cells are exposed to unfavorable conditions during conventional fermentations. Cell immobilization is an alternative to solve this problem and offers numerous advantages such as higher cell concentrations, greater stability and improved production. Thus the aim of this work was to select a suitable support for the immobilization of Zymomonas mobilis in order to increase the production of ethanol and levan from sucrose as the carbon source. The optimum values for ethanol and levan production were determined using response surface methodology (RSM). The first experiment was a 2(5-2) design with the following independent variables: sucrose concentration, pH, incubation time, temperature and agitation of the culture medium. Based on the best conditions observed in the 2(5-2) experiment, reuse of the support was evaluated during 12 days of fermentation. Ethanol production was determined by microdiffusion and the levan production on fructose units after acid hydrolysis. The biomass was determined by optical density at 570 nm and microbial growth on the support was verified by scanning electron microscopy. In the 2(5-2) experiment the loofa sponge was the best support for immobilization with the highest values for immobilized biomass (2.95 g/L); levan production (24.9 g/L) and ethanol production (50.95 g/L). In the immobilization support reuse experiments in batch fermentations, all the supports evaluated could be reused for 12 cycles, with the exception of chitosan beads. Sugarcane bagasse was shown to be the best substrate for microbial adhesion (3.23 g/L) and for levan (32.13 g/L) and ethanol production (36.50 g/L). Thus the loofa sponge and sugarcane bagasse represented the most promising support ... / Doutor

Sorbitol e ácido glucônico são obtidos equimolarmente em reação catalisada por glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glucono-δ-lactonase (GL), enzimas periplasmáticas de Zymomonas mobilis. Visto que a demanda comercial do sorbitol é muito superior à do ácido glucônico, este trabalho objetivou aprofundar o conhecimento sobre a capacidade do complexo GFOR/GL de oxidar outras aldoses a seus respectivos ácidos orgânicos. O cultivo de Z. mobilis foi analisado visando a obtenção de biomassa, GFOR/GL e etanol. Em cultivo descontínuo em meio com 7,5 a 10,0 g/L de extrato de levedura bruto, obtiveramse cerca de 24 unidades de GFOR/GL por grama de células secas (U/g). Em regime descontínuo alimentado, atividade de 27 U/g e rendimento em etanol de 95% foram atingidos. A ação de GFOR/GL sobre diferentes pares frutose/aldoses foi avaliada com células permeabilizadas livres ou imobilizadas em alginato de cálcio. Com 0,7 mol/L de frutose/glicose, em sistema imobilizado, as mais altas atividades foram medidas entre 47 e 50°C com pH de 7,8 a 8,2, constatando-se que um valor de pH mais alto no meio permite a ocorrência de um pH próximo ao ideal (6,4) no interior das esferas de alginato. Conforme os substratos são consumidos, com conseqüente redução da velocidade reacional, pHs mais baixos no meio externo são exigidos. Entre as aldoses testadas, a maior afinidade enzima / substrato foi observada com maltose e a menor com lactose. Devido às aplicações comerciais do seu produto de oxidação - ácido lactobiônico - lactose foi estudada em detalhes. Com 0,7 mol/L de lactose/frutose, a máxima velocidade específica de formação de ácido lactobiônico foi, em média, de 4,0 mmol/g/h, com células livres, a 39°C e pH 6,4, e de 2,0 mmol/g/h, com o sistema imobilizado, a 47ºC e pH 6,4. Os resultados indicam a viabilidade da produção de ácido lactobiônico por este processo, já que conversões superiores a 85 % são obtidas. / Sorbitol and gluconic acid can be obtained, in equimolar basis, by reaction catalysed by the periplasmic enzymes glucose-fructose oxidoreductase (GFOR) and glucono-δ-lactonase (GL) of Zymomonas mobilis. Since the commercial demand for sorbitol is much larger than that for gluconic acid, the aim of this work was to achieve a deeper knowledge on the capacity of GFOR/GL complex in oxidising other aldoses to their respective organic acids. Z. mobilis cultivation was analysed with respect to growth and GFOR/GL and ethanol production. In batch cultivation in medium with 7.5 and 10.0 g/L of non-purified yeast extract, ca. of 24 GFOR/GL units per gram of dry cells (U/g) were obtained. In fed-batch mode, an activity of 27 U/g and an ethanol yield over 95% were achieved. The action of GFOR/GL on different fructose/aldose pairs was assessed with permeabilised cells, either free or immobilised in calcium alginate. With 0.7 mol/L of fructose/aldose, in immobilised system, the highest activities were measured between 47 and 50°C at pH 7.8-8.2, observing that higher pH values in the reaction medium led to the occurrence of pH values close to the optimum (6.4) in the inner space of alginate beads. As substrates were consumed, and as a consequence the reaction rate decreased, lower pH values in the external medium were needed. Among the aldoses tested, the highest enzyme - substrate affinity was observed for maltose and the lowest for lactose. Due to the commercial uses of its oxidation product - lactobionic acid - lactose was studied in details. With 0.7 mol/L of lactose/fructose, the maximum lactobionic acid specific production rate was in average 4.0 mmol/g/h with free cells, at 39ºC and pH 6.4, and 2.0 mmol/g/h with immobilised system, at 47ºC and pH 6.4. The results indicate the feasibility of producing lactobionic acid by this process, since conversion over 85% are obtained.

Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-12T17:49:09Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Clarissa_Sá_março2012.pdf: 2457471 bytes, checksum: 83e5e0cdf6065d4d7f5b24fcac0cdd26 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T17:49:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Clarissa_Sá_março2012.pdf: 2457471 bytes, checksum: 83e5e0cdf6065d4d7f5b24fcac0cdd26 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CAPES; CNPQ. / O objetivo deste trabalho foi selecionar e caracterizar microrganismos etanologênicos eficientes e robustos para aplicação industrial. Inicialmente, foi comparada a produção de etanol entre 10 linhagens industriais de S. cerevisiae e entre 10 linhagens de Z. mobilis, pertencentes à Coleção de Culturas de Microrganismos do Departamento de Antibióticos da UFPE. Os experimentos foram realizados em tubos de ensaio (50 mL), em meios a base de glicose, com e sem hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. O hidrolisado foi obtido por tratamento hidrotérmico (195° C, 16 min.) em reator descontínuo de 20 L (Regmed AU/E-20). Por análise estatística, duas linhagens, uma de cada grupo (S. cerevisiae IA1238 e Z. mobilis ZAP), foram selecionadas para caracterização cinética em biorreator de bancada (New Brunswick Scientific, Bioflo 110). Foram avaliados, também, os efeitos individuais e sinérgicos de inibidores (furfural, HMF, ácido acético, ácido fórmico e ácido gálico) sobre as duas linhagens selecionadas. Na caracterização cinética em biorreator, na ausência de hidrolisado, o rendimento de etanol de S. cerevisiae IA1238 (0,36 g g-1) foi um pouco inferior ao de Z. mobilis ZAP (0,42 g g-1). No entanto, S. cerevisiae IA1238 foi capaz de fermentar na presença do hidrolisado, embora com inibição do crescimento, enquanto Z. mobilis ZAP foi totalmente inibida. Na análise individual de inibidores, o ácido acético e o ácido fórmico, em concentrações presentes no hidrolisado, apresentaram maior poder de inibição, tanto sobre S. cerevisiae IA1238 (53% e 26%, respectivamente) como sobre Z. mobilis ZAP (93% e 73% , respectivamente). Embora Z. mobilis apresente vantagem metabólica em meio de glicose (i.e. maior rendimento de etanol), S. cerevisiae se mostrou, em geral, mais robusta para aplicação industrial. Em particular, a linhagem IA1238, utilizada atualmente em processos industriais de primeira geração, mostrou ser uma boa plataforma para modificações genéticas futuras, para aplicação em processos de segunda geração.

O ácido lactobiônico e seus sais (lactobionatos), compostos que apresentam aplicações na área farmacêutica, foram obtidos via ação do complexo enzimático glicose-frutose oxidorredutase (GFOR)/gliconolactonase (GL) - presente no periplasma de células da bactéria Zymomonas mobilis - imobilizado em alginato de cálcio. Nas reações catalisadas por este sistema enzimático, o pH do meio deve ser controlado em valores ligeiramente ácidos. Para este fim, foram empregados NaOH, KOH ou Ca(OH)2 e, como consequência, os respectivos sais foram formados. O estudo da cinética de formação dos lactobionatos de sódio, potássio e cálcio e do próprio ácido lactobiônico foi seguido das etapas de purificação, caracterização e avaliação da estabilidade físico-química, visando à potencial utilização destes compostos na área farmacêutica. Em ensaios de bioprodução dos lactobionatos de sódio, potássio e cálcio, foram obtidos rendimentos de 74, 77 e 84%, respectivamente. Em bateladas sucessivas de bioconversão, totalizando 96 h de uso do biocatalisador, rendimentos de 80 e 56 % em lactobionatos de cálcio e de potássio foram atingidos. Na etapa de purificação dos sais, foram alcançados teores de pureza de aproximadamente 95%, sendo então procedida a caracterização dos compostos por cromatografia líquida de alta eficiência, espectrometria de massas e RMN de 13C. Nos estudos de estabilidade acelerada, de longa duração e degradação forçada, os lactobionatos de sódio, potássio e cálcio obtidos nos ensaios de bioconversão conduzidos em maior volume reacional, foram inicialmente purificados e, então, comparados frente ao ácido lactobiônico, obtido por troca iônica a partir do lactobionato de sódio, e com o ácido lactobiônico comercial (Sigma-Aldrich). Nos testes de estabilidade acelerada e de longa duração, foi constatada a estabilidade de todos os compostos por até seis meses quando expostos a 30 e 40oC e 75% de umidade relativa. Por outro lado, a presença da lactobionolactona foi identificada nas amostras dos compostos na forma ácida. Com relação aos testes de degradação forçada, os lactobionatos de sódio, potássio, e cálcio e o ácido lactobiônico se mostraram estáveis frente à exposição a soluções ácidas e alcalinas e às temperaturas avaliadas. Contudo, observou-se degradação no tratamento com solução oxidativa, com cinética de degradação de ordem zero para os sais e de segunda ordem para o ácido lactobiônico. Elevadas concentrações de produtos - lactobionatos de sódio, potássio e cálcio - foram atingidas com a utilização do sistema GFOR/GL imobilizado em alginato de cálcio. Considerando o conjunto de informações obtido, quanto à caracterização físico-química dos compostos produzidos, foi demonstrada a estabilidade frente aos diferentes parâmetros avaliados atendendo aos requisitos mínimos legais para sua aplicação na área farmacêutica. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES. / Lactobionic acid and its salts (lactobionate) are substances that have several applications in pharmaceutical area. These products were obtained by enzymatic complex glucose-fructose-oxidoreductase (GFOR)/gluconolactonase (GL) present in the periplasm of Zymomonas mobilis cells that were immobilized in calcium alginate. In the reactions catalyzed by this enzyme system, the medium pH must be controlled at slightly acid values. For this purpose, NaOH, KOH, or Ca(OH)2 were used and as a result the respective salts were formed. The kinetic study on the formation of sodium, potassium and calcium lactobionate and lactobionic acid itself was followed by the steps of purification, characterization and evaluation of the physicochemical stability, aiming the potential use of these compounds in the pharmaceutical area. In the assays for the bioproduction of sodium, potassium or calcium lactobionates, yields of 74, 77 and 84% were obtained, respectively. In repeated bioconversion batches, totalizing 96 hours of use of the biocatalyst, yields of 80 and 56% were attained for calcium and potassium lactobionate. In the salts purification step, purity levels of approximately 95% were achieved, and subsequently these compounds were characterized by high performance liquid chromatography, mass spectrometry, and C13 NMR. In the studies of accelerated, long term and forced degradation stability, the production of sodium, potassium and calcium lactobionate was carried out at higher reaction volume. The products were purified and then evaluated together with lactobionic acid that was obtained by ion-exchange from sodium lactobionate, and with a commercial lactobionic acid (Sigma-Aldrich). In the accelerated and long term stability tests, it was demonstrated the stability of all compounds when exposed to 30 and 40oC and of 75%of relative humidity for up to six months. On the other hand, the presence of lactobionolactone was identified in samples of compounds in the acid form. With respect to the forced degradation tests, sodium, potassium and calcium lactobionates and lactobionic acid have shown to be stable after exposing to both acidic and alkaline solutions and the temperatures evaluated. However, degradation was observed in the treatment with oxidative solution, with a zero-order degradation kinetics for the salts forms and second-order for lactobionic acid. High concentrations of products - sodium, potassium and calcium lactobionate - were achieved by using the Ca-alginate immobilized GFOR/GL complex. Considering the set of information obtained in regarding to physicochemical characterization, it was demonstrated the high stability of these compounds in front of different parameters evaluated, endorsing the legal minimum requirements for their application in the pharmaceutical area.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:06:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo7850_1.pdf: 1593178 bytes, checksum: 172bd7605b4bf03e4bc6093bb00e9632 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Neste trabalho, foi realizado um estudo teórico do comportamento dinâmico de fermentações, utilizando um modelo desenvolvido para representar o cultivo contínuo de Zymomonas mobilis em um biorreator perfeitamente agitado. O modelo foi estudado através de simulações dinâmicas e da construção de diagramas de bifurcação. Esta última ferramenta permite avaliar a influência dos parâmetros do modelo no surgimento de comportamentos dinâmicos complexos como oscilação e multiplicidade de estados estacionários. Os estudos foram norteados pelos dados experimentais de literatura que indicam oscilação quando a concentração de glicose na alimentação é elevada, em torno de 200 g/L, e a taxa de diluição está em torno de 0,07 h-1. Os diagramas de bifurcação e as simulações dinâmicas mostram que o modelo é capaz de prever a coexistência de um estado estacionário estável e uma oscilação sustentada em um mesmo conjunto de condições de operação, conforme já observado experimentalmente em trabalhos anteriores

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:01:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4249_1.pdf: 5387784 bytes, checksum: 0eec9d7103a89fa3e1f2d914ffc4a077 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Este trabalho teve como objetivo selecionar e caracterizar uma linhagem de Zymomonas mobilis como potencial probiótico para isso a pesquisa foi dividida em três etapas. Numa primeira etapa foi avaliada a atividade de dez linhagens de Z. mobilis frente a 49 microrganismos patogênicos pertencentes a cinco gêneros bacterianos e um fúngico. Após seleção da linhagem com atividade antagônica e com crescimento satisfatório no meio SSDL foi avaliada sua tolerância ao ácido clorídrico (meio SSDL com pH ajustado para 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 e 4,0) e bile bovina nas concentrações de 0,125; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 e 4,0 p/v. Posteriormente foi avaliada a susceptibilidade desta linhagem a dez diferentes antimicrobianos utilizados em clínica médica. Este ensaio foi realizado pela técnica de difusão em meio sólido preconizado pelo CLSI. A segunda etapa deste trabalho constou da determinação do antagonismo quantitativo da cultura de Z. mobilis selecionada em co-cultura com Escherichia coli O157:H7 ou com Escherichia coli ATCC 8739 e do acompanhamento do pH destas culturas. Nesta etapa também foi estudada a influência do inóculo de Z. mobilis em diferentes concentrações (107, 108, 109 UFC/mL) sobre a sua atividade antagônica ao longo de 24 horas. Na terceira etapa, foi avaliada a possibilidade de translocação de Z. mobilis para a corrente sangüínea e para os órgãos vitais em camundongos, após inoculação através de gavagem oral da cultura (109 UFC/mL) três vezes ao dia. As linhagens de Z. mobilis foram capazes de inibir o crescimento de 10 amostras de Pseudomonas aeruginosa, 4 de Escherichia coli, 7 de Staphylococcus aureus e 5 de Salmonella enterica e 1 Salmonella choleraesuis , mas não inibiu 10 amostras de Enterococcus faecalis nem as 11 de Candida albicans. Das dez linhagens, Z. mobilis UFPEDA 355 apresentou velocidade máxima de crescimento em meio SSDL, superior as demais, e atividade antagônica sendo selecionada para as etapas posteriores. A linhagem UFPEDA 355 apresentou-se tolerante ao meio SSDL em pH superior a 2,5 e a todas as concentrações de bile ensaiadas. Esta linhagem mostrou um perfil de sensibilidade a cefoxitina, azitromicina, sulfazotrim, imipenem, cloranfenicol, amoxicilina/ácido clavulânico e de resistência a ofloxacina, amicacina e ampicilina. A atividade antagônica de Z. mobilis UFPEDA 355 foi dependente da concentração do inóculo, cuja redução das células viáveis, em relação ao controle, foi da ordem de 1,60 ± 0,06 log10 UFC/mL para E. coli O157:H7 e de 1,67 ± 0,07 log10 UFC/mL para E. coli ATCC 8739. Não houve diferença significativa dos valores do pH da cultura de Z. mobilis e de suas co-culturas nos diferentes inóculos (p<0,05). Z. mobilis UFPEDA 355 não foi capaz de penetrar na corrente sangüínea, nem de causar alterações morfológicas nos rins, fígado, baço e intestinos de camundongos

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:03:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8609_1.pdf: 805317 bytes, checksum: abc0e57e92f79e1f040be2cc422ef714 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / A fim de reduzir o impacto dos gases que provocam o efeito estufa torna-se necessária a utilização de derivados de biomassa como combustíveis alternativos a partir de substratos renováveis. A Algaroba [Prosopis juliflora (Sw.) D.C.] é uma leguminosa arbórea tropical comum no semi-árido brasileiro e que se desenvolve em lugares secos. Este trabalho teve por objetivo produzir etanol a partir do extrato aquoso obtido da farinha da algaroba fermentado por Saccharomyces cerevisiae e Zymomonas mobilis. Foram realizadas as seguintes etapas: caracterização da farinha da algaroba quanto à composição química e microbiológica; determinação da concentração ideal de farinha da algaroba para elaboração do substrato fermentativo; curvas de crescimento dos microrganismos; fermentações segundo o planejamento fatorial 23. Foi realizado o processo fermentativo até 72h com o ensaio do planejamento fatorial que obteve a máxima produção de etanol (g/L), analisada através da análise de regressão linear e dos cálculos dos parâmetros de fermentação. Verificou-se que a farinha de algaroba apresenta elevados níveis de nutrientes, principalmente em açúcares, e minerais como fósforo cálcio, além de ser considerada própria quanto à qualidade higiênico-sanitária. Foi escolhida a concentração de 30% de farinha da algaroba para elaboração do substrato por apresentar estabilidade quanto à solubilização de glicose e de proteínas totais no meio. Zymomonas mobilis apresentou maior crescimento em meio padrão sob condição estática e Saccharomyces cerevisiae no substrato sob agitação. De acordo com o planejamento fatorial, a maior produção de etanol foi obtida utilizando extrato aquoso da algaroba fermentado por Z. mobilis sob condição estática. A análise de regressão linear apresentou um bom ajuste dos dados aos modelos quanto ao crescimento da bactéria de 0 a 36 horas e produção de etanol de 2 a 36 horas. A maior produtividade de etanol, maior conversão do substrato em etanol, e, portanto, maior eficiência de fermentação foi observada até 30h. Conclui-se, que a algaroba apresenta-se como matéria-prima viável em processos biotecnológicos, visando seu aproveitamento e conferindo maior valor agregado ao produto

Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2011. / ENGLISH ABSTRACT: Fermentation in Zymomonas mobilis has been described as a catabolic highway, with 50 % of soluble protein comprising glycolytic and fermentative enzymes. In conjunction with one of the fastest observed fermentations, the conversion of glucose to ethanol forms one of the least efficient energy extractions found in nature. The low energy yield of fermentation in Z. mobilis is a result of the usage of the Entner-Doudoroff glycolytic pathway, which has half the energy yield per mol substrate compared to the well known Embden-Meyerhof-Parnas glycolytic pathway. The work presented in this thesis forms part of a larger project to compare glycolytic regulation in different micro-organisms (i.e., Z. mobilis, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae and Lactococcus lactis). These organisms were chosen based on their usage of different glycolytic mechanisms. By using supply-demand analysis for quantifying glycolytic regulation as well as similar experimental conditions (e.g. using non-growing cell cultures), we can compare the regulatory behaviour of mechanistically distinct freeenergy supplies. The aim of this thesis was to quantify the importance of anaerobic free-energy generation for the regulation of the Entner-Doudoroff glycolytic pathway in Z. mobilis. We used metabolic control analysis (MCA) and supply-demand analysis to realize this goal. The central message of MCA is that when a metabolic parameter (e.g., a conserved metabolic moiety) is deemed important for affecting a particular steady-state variable (i.e., fermentation flux), its effect on the steady state variable should be tested. An extension to MCA, supply-demand analysis, provides a quantitative framework for analyzing the regulatory importance of cellular commodities such as anaerobic free-energy. This is done through comparing the elasticities of anaerobic free-energy supply and demand, which yields the degree to which the respective reaction blocks control the flux through anaerobic free-energy metabolism, as well as determine the cellular free-energy state (ATP/ADP ratio). The regulation of anaerobic free-energy metabolism in Z. mobilis was investigated with an experimental approach. The key features of our experimental setup were the use of NMR spectroscopy for detecting metabolites, as well as employing non-growing conditions for supply-demand experiments. With NMR spectroscopy metabolites could be detected in real time without using invasive sampling techniques; the use of nongrowing conditions further simplified the analysis by enabling us to correlate fermentative behaviour exclusively with the anaerobic free-energy state. Fermentation of glucose was investigated in the wild type Z. mobilis, a recombinant containing a non-expressing plasmid, or expressing plasmids for over-expressing the glucose facilitator (TCDB 2.A.1.1.4) or glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49). In addition, ATP demand in the non-expressing recombinant and wild type was perturbed by titrating with the uncoupler acetic acid. Our results show that the anaerobic free-energy demand, the glucose facilitator and glucose-6-phospate dehydrogenase all control the flux of ethanol production in Z. mobilis. The Entner-Doudoroff glycolytic supply activity was found to be sensitive to changes in the ratios of ATP/ADP (elasticity varied between –0.31 and –0.49) and NTP/NDP (elasticity varied between –0.31 and – 0.50). / AFRIKAANSE OPSOMMING: Fermentasie in Zymomonas mobilis word beskryf as ‘n kataboliese snelweg, waar glikolitiese en fermentatiewe ensieme 50% van totale oplosbare proteïene in die sel uitmaak. Hoewel dié fermentasie een van die vinnigstes is wat tot op hede waargeneem is, is die omskakeling van glukose na etanol een van die mees ondoeltreffende energieekstraksies in die natuur. Dié lae energie-opbrengs, soos waarneembaar in fermentasie in Zymomonas mobilis, kan toegeskryf word aan die Entner-Doudoroff metaboliese pad. Hierdie metaboliese pad lewer slegs die helfte van die energie-opbrengs per mol substraat vergeleke met die meer bekende Embden-Meyerhof-Parnas glikolitiese pad. Die navorsing in hierdie tesis is deel van ‘n omvattende projek wat poog om die regulering van glikolise in verskillende mikro-organismes (Z. mobilis, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae en Lactococcus lactis) te vergelyk. Dié organismes is gekies op grond van die uiteenlopende glikolitiese meganismes waarvan hulle gebruik maak. Ten einde die reguleringsgedrag van meganisties verskillende vry-energie produksieweë m.b.v. vraag-aanbod analise te vergelyk, moet glikolitiese regulering eers onder eenderse eksperimentele kondisies (b.v. nie-groeiende selkulture) gekwantifiseer kan word. Die hoofdoel van hierdie tesis was om die belang van anaerobiese vry-energie produksie vir die regulering van die Entner-Doudoroff glikolitiese pad in Z. mobilis te kwantifiseer. Hiervoor is van Metaboliese kontrole-analise (MKA) en vraag-aanbodanalise (‘n uitbreiding van MKA) gebruik gemaak. MKA is ‘n tegniek waarmee die effek wat ‘n metaboliese parameter (soos metaboliese deel-konservering) op ‘n spesifieke bestendige toestand-veranderlike (soos fermentasiefluksie) het, gekwantifiseer kan word. Vraagaanbodanalise daarenteen, bied ‘n kwantitatiewe raamwerk waardeur die regulatoriese belang van sellulêre kommoditeite (byvoorbeeld anaerobiese vry-energie) geanaliseer kan word. Tydens laasgenoemde proses word die elastisiteit van die anaerobiese vry-energie aanbod en die elastisiteit van die vraag vergelyk. Op hierdie manier kan die mate van beheer wat die onderskeie reaksieblokkie oor die fluksie deur anaerobiese vry-energie metaboliese paaie, sowel as oor die sellulêre vry-energie toestand (ATP/ADP verhouding), bepaal word. In hierdie werk is die regulering van anaerobiese vry-energie metabolisme in Z. mobilis ondersoek deur van ‘n eksperimentele benadering gebruik te maak. Die sleuteleienskappe van dié benadering was om kernmagnetiese-resonansiespektroskopie (KMR spektroskopie) te gebruik om metabolietkonsentrasies te meet, en om van niegroeiende kondisies gebruik te maak vir die vraag-aanbod eksperimente. Metabolietkonsenstrasies kon aaneenlopend bepaal word sonder die gebruik van monsternemingstegnieke wat die reaksie sou kon beïnvloed. Eksterne invloede op die fermentasiegedrag kon ook uitgesluit word deur van nie-groeiende kondisies gebruik te maak, sodat die waargenome fermentasiegedrag uitsluitelik aan die anaerobiese vryenergie toestand toegeskryf kan word. Glukose fermentasie was ondersoek in wilde tipe Z. mobilis, en in drie rekombinante wat onderskeidelik ‘n glukose fasiliteerder ooruitdrukkingsplasmied (TCDB 2.A.1.1.4), ‘n glukose-6-fosfaat dehidrogenase ooruitdrukkingsplasmied (EC 1.1.1.49), en ‘n nieuitdrukkingsplasmied bevat het. Die ATP vraag in die wilde tipe en die nieuitdrukkingsrekombinant is geperturbeer deur titrasies met asynsuur as ontkoppelaar. Die resultate toon dan die anaerobiese vry-energievraag, sowel as die glukose fasiliteerder en glukose-6-fosfaat dehidrogenase, die fluksie van etanolproduksie in Z. mobilis beheer. Die Entner-Doudoroff glikolitiese produksie-aktiwiteit was sensitief vir veranderinge in die ATP/ADP verhouding (elastisiteite was tussen -0.31 en -0.49) en die NTP/NDP verhouding (elastisiteite was tussen -0.31 en -0.50).

Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2014. / ENGLISH ABSTRACT: Metabolic networks of cellular systems are complex, in that there are numerous components with multiple non-linear interactions. To understand how these networks work they are often split into manageable pieces and studied individually. However, an individual part is unable to account for the complex properties of systems. In order to study these interactions the eld of systems biology has developed. Systems biology makes use of computers to construct models as a method to describe aspects of living systems. Using cellular pathways, kinetic models of metabolic pathways can be constructed and used as a tool to study the biological systems and provide a quantitative description. This thesis describes the quantitative analysis of a bacterium using a systems biology approach. Zymomonas mobilis is a rod shaped, Gram-negative, non-mobile facultative anaerobe and has one of the fastest observed fermentations, yet least energy e cient extractions found in nature. Furthermore it is the only known micro-organism to use the Entner-Doudoro (2-keto-3-deoxy-6- phosphogluconate) pathway anaerobically. The low energy yield of fermentation in Z. mobilis is a result of the usage of the Entner-Doudoro glycolytic pathway, which has half the energy yield per mol substrate compared to the well known Embden-Meyerhof-Parnas glycolytic pathway. The work presented in this thesis forms part of a larger project to compare glycolytic regulation in di erent micro-organisms Z. mobilis, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae and Lactococcus lactis. These organisms were chosen based on their usage of di erent glycolytic mechanisms. Kinetic models are suitable tools to draw a comparison between these organisms. The emphasis here is on the construction of a kinetic model of the Entner-Doudoroff glycolytic pathway as it occurs in Z. mobilis. The aim of this thesis was to characterise as many of the Entner-Doudoro pathway enzymes as possible, under standard conditions. This was done using enzyme assays, to obtain the kinetic parameters of each of the enzymes. Microtitre plate assays were used to characterise most of the enzymes of the Entner-Doudoro pathway. However, not all characterisations could be done using plate assay methods, as some intermediates were not commercially available to perform coupled assays. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy was used to characterise these enzymes. These experimentally obtained parameters were then incorporated in a mathematical framework. Time simulations on the initial model were unable to reach a steady-state, with a build up of metabolic intermediates. A secondary model was constructed (using calculated maximal activities) which allowed us to identify discrepancies in the initial model. This showed that the experimentally determined maximal activities of three enzymes in lower glycolysis were unrealistically low, which might be due to protein denaturation by sonication. A nal model was constructed which incorporated a correction factor for these three enzymes. The models' predicted output (steady-state concentrations and ux) was compared to that of either literature or experimentally determined values, as a method to validate the model. The model output compared well to literature values. The constructed and partially validated kinetic model was then used as an analytical tool to identify points of control and regulation of glycolysis in Z. mobilis. The model presented in this work was also compared to published models. Our model relies much less on literature obtained values, and uses kinetic parameters experimentally determined under the same conditions. The parameters of the published models were obtained from the literature and in many instances, the assay conditions for these parameters were set-up to yield the maximum activity under non-physiological conditions. Furthermore, the number of excluded or assumed parameters is much less in our model. However, introduction of a milder, more predictable extraction technique for preparing cell lysates, should be considered for future work, to obtain the parameters that was not determined during this study. The published models do include reactions not included in our model (e.g ATP metabolism), which should be considered for inclusion, as we strive to construct a detailed kinetic model of glycolysis in Z. mobilis in the future. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Sellul^ere metaboliese netwerke is komplekse stelsels, omdat hulle bestaan uit talle komponente met verskeie nie-lineêre interaksies. Om die funksionering van hierdie netwerke te verstaan, word hulle dikwels in hanteerbare stukke verdeel en individueel bestudeer. 'n Enkele komponent is egter nie in staat om die komplekse eienskappe van sulke stelsels te verklaar nie. Die veld van sisteembiologie het ontwikkel met die doel om sulke stelsels te bestudeer. Sisteembiologie maak gebruik van rekenaarmodelle as 'n metode om aspekte van lewende sisteme te beskryf. Kinetiese modelle van metaboliese paaie word gebou en gebruik as gereedskap om die biologiese stelsels te bestudeer en 'n kwantitatiewe beskrywing te bekom. Hierdie tesis beskryf die kwantitatiewe ontleding van 'n bakterie deur middel van 'n sisteembiologiese benadering. Zymomonas Mobilis is 'n staafvormige, Gram-negatiewe, nie-mobiele fakultatiewe ana erobe, en het een van die vinnigste waargenome fermentasies, maar met die minste energie-doeltre ende ekstraksie wat in die natuur aangetref word. Verder is dit die enigste bekende mikro-organisme wat die Entner-Doudoro (2-keto-3-dioksi-6-fosfoglukonaat) pad ana erobies gebruik. Die lae-energieopbrengs van fermentasie in Z. mobilis is 'n gevolg van die gebruik van die Entner-Doudoro metaboliese pad, wat die helfte van die energie-opbrengs per mol substraat lewer, in vergelyking met die bekende Embden-Meyerhof-Parnas pad. Die werk wat in hierdie tesis aangebied word, vorm deel van 'n groter projek om glikolitiese regulering in verskillende mikro-organismes te vergelyk, naamlik Z. mobilis, Escherichia coli, Sac- charomyces en Lactococcus lactis. Hierdie organismes is gekies op grond van hul gebruik van verskillende glikolitiese meganismes. Kinetiese modellering is 'n handige metode om 'n vergelyking tussen hierdie organismes te trek. Hierdie werk fokus op die bou van 'n kinetiese model van die Entner-Doudoro glikolitiese metaboliese pad soos dit in Z. mobilis voorkom. Die doel van hierdie tesis was om so veel moontlik van die Entner-Doudoro ensieme onder standaard-toestande te karakteriseer. Die kinetiese parameters van elk van die ensieme is met behulp van ensimatiese essai's bepaal. Vir die meeste essai's is 96-put mikrotiterplate gebruik, maar nie al die karakteriserings kon met behulp van hierdie metode gedoen word nie, omdat sommige intermediate nie kommersieel beskikbaar was om gekoppelde essai's mee uit te voer nie. Kernmagnetiese resonansie (KMR) spektroskopie is gebruik om hierdie ensieme te karakteriseer. Die eksperimenteel bepaalde parameters is opgeneem in 'n wiskundige raamwerk. Tydsimulasies op die aanvanklike model was nie in staat om 'n bestendige toestand te bereik nie, omdat metaboliete opgebou het. 'n Sekond^ere model is gebou (met behulp van berekende maksimale aktiwiteite) wat ons toegelaat om teenstrydighede in die aanvanklike model te identi seer. Dit het getoon dat die eksperimenteel bepaalde maksimale aktiwiteite van drie ensieme in die laer gedeelte van glikolise te laag was, waarskynlik as gevolg van prote en denaturering tydens die ultrasoniese disintegrasieproses. 'n Finale model is gebou waarin 'n korreksiefaktor vir hierdie drie ensieme opgeneem is. Die modelle se voorspelde uitset (bestendige toestand konsentrasies en uksie) is vergelyk met waardes uit die literatuur of wat ons self bepaal het, as 'n metode om die model te valideer. Die model uitset was in goeie ooreenstemming met hierdie waardes. Die gedeeltelik gevalideerde kinetiese model is voorts gebruik as 'n analitiese instrument om beheer en regulering van glikolise in Z. mobilis te ondersoek. Die model wat in hierdie werk ontwikkel is, is ook vergelyk met die vorige gepubliseerde modelle. Ons model berus baie minder op waardes uit die wetenskaplike literatuur, en maak gebruik van parameters wat eksperimenteel bepaal is, onder identiese toestande. Die parameters van die gepubliseerde modelle is meesal verkry uit die literatuur, en in baie gevalle was die eksperimentele kondisies vir hierdie analises opgestel om die maksimale aktiwiteit te lewer onder nie- siologiese toestande. Verder bevat ons model minder parameters wat of uitgesluit is of wie se waardes aangeneem moes word. In toekomstige werk sal daar egter klem gel^e moet word op 'n minder wisselvallige ekstraksietegniek vir die verkryging van selekstrakte, om sodoende parameters te identi seer wat nie in hierdie werk bepaal kon word nie. Die gepubliseerde modelle sluit ook reaksies in wat nie ingesluit is in ons model nie (bv. ATP metabolisme). Hierdie sou in ag geneem moet word vir insluiting in 'n toekomstige uitgebreide model, om daarna te streef om 'n gedetailleerde kinetiese model van glikolise in Z. mobilis te bou.