Ácido lactobiônico e sorbitol têm importantes aplicações na indústria cosmética e farmacêutica. Esses produtos podem ser obtidos de forma equimolar em reações catalisadas por glicosefrutose oxidorredutase (GFOR) e glicono-δ-lactonase (GL), enzimas presentes no periplasma de Zymomonas mobilis. As reações são geralmente conduzidas com células bacterianas imobilizadas, sendo que a técnica de preparo deste biocatalisador demanda tempo, além de ser onerosa. Alternativas para a simplificação do preparo do biocatalisador imobilizado em alginato de cálcio e sua aplicação em diferentes regimes de operação e reatores foram estudadas neste trabalho, com o objetivo de aumentar o potencial de transferência dessa tecnologia para o setor industrial. Modificações na técnica de imobilização de Z. mobilis foram avaliadas quanto às concentrações do polímero e da solução de CaCl2 e do tempo de gelificação, buscando melhorar as propriedades mecânicas do gel e possibilitar sua utilização em reações repetidas. No caso, não foram observadas alterações significativas na resistência do suporte e nos parâmetros de avaliação da reação em qualquer das condições avaliadas. Assim, a técnica foi mantida na forma previamente definida: alginato de sódio, 2% (m/v); CaCl2, 0,3 mol/L; tempo de gelificação, 10 a 240 minutos. A reutilização do biocatalisador imobilizado por sete bateladas repetidas, num total de 176 horas, possibilitou a obtenção de cerca de 500 mmol/L de produtos (ácido lactobiônico e sorbitol) por ciclo, com valores médios de rendimento e de produtividade específica de 80% e 1,12 mmol/g/h. A possibilidade de supressão da permeabilização celular com brometo de cetil trimetil amônio (condição CTAB) foi demonstrada, uma vez que se constatou que a reticulação de células de Z. mobilis com glutaraldeído (condição Glu), além de inibir o metabolismo fermentativo de carboidratos como glicose ou frutose, permitiu o acúmulo dos produtos de bioconversão, sem afetar a atividade catalítica das enzimas. A atividade enzimática para a condição Glu (35 U/g de células) foi semelhante à da condição de referência CTAB (31 U/g). Adicionalmente, com o sistema imobilizado, constatou-se que o tratamento das células com glutaraldeído, normalmente feito antes da imobilização (condição Glu Imb), também pode ser suprimido, uma vez que o tratamento único das esferas do suporte (condição Branco Imb) com o agente de reticulação é suficiente para inativar o metabolismo de Z. mobilis. Os rendimentos em ácido lactobiônico e sorbitol, independentemente da condição (Glu Imb ou Branco Imb), foram da ordem de 80%, com concentrações de produto de cerca de 500 mmol/L. A estabilidade das enzimas nas reações de bioconversão manteve-se próxima à inicial após 150 dias de armazenagem. Reações de bioconversão foram conduzidas em regime descontínuo, em reator de agitação mecânica, com 20 e 30 g/L do biocatalisador imobilizado, resultando em 530 mmol/L de produtos em 24 horas. O processo foi testado, ainda, em regime descontínuo alimentado a fim de possibilitar o uso de maior massa de lactose, que não poderia ser empregada em descontínuo devido à baixa solubilidade deste carboidrato em água. Com 20 g/L de biomassa imobilizada, concentrações de produtos de 745 mmol/L foram obtidas em 42 horas, enquanto com 30 g/L foram necessárias 32 horas para atingir-se 776 mmol/L. Os resultados para as reações conduzidas em biorreator tubular com agitação pneumática, com 20 g/L de células, em regimes descontínuo e descontínuo alimentado foram muito próximos aos encontrados no sistema com agitação mecânica, demonstrando a flexibilidade do processo sob esse aspecto. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES. / Lactobionic acid and sorbitol have important applications in cosmetic and pharmaceutical industries. These products can be obtained in equimolar basis in reactions catalysed by glucose-fructose oxidoreductase (GFOR) and glucono-δ-lactonase (GL), enzymes that are present in the periplasm of Zymomonas mobilis. The reactions are usually conducted with immobilized bacterial cells, the preparation technique of this biocatalyst being time demanding and expensive. Some alternatives for the simplification of the preparation of calcium alginate-immobilized biocatalyst and its application in different operation modes and types of bioreactors were studied in this work, with the aim of increasing the potential of this technology to be transferred to the industrial sector. Modifications in the technique of Z. mobilis immobilization were evaluated regarding the concentrations of sodium alginate and CaCl2 solution and the time of gelification, as an attempt to improve the mechanical properties of the gel and to allow its use in repeated reactions. In this case, no significant changes in both the support resistance and the reaction evaluation parameters were observed for any condition assessed. As such, the technique remained as previously defined: sodium alginate, 2% (w/v); CaCl2, 0.3 mol/L; gelification time, from 10 to 240 minutes. The reuse of the immobilized biocatalyst for seven consecutive batches, totalling 176 hours of reaction, allowed the attainment of products (lactobionic acid and sorbitol) concentrations of about 500 mmol/L, with approximately 80% of yield and 1.12 mmol/g/h of specific productivity. The possibility of suppression of the cell permeabilization with cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB condition) was demonstrated, since the crosslink of Z. mobilis with glutaraldehyde (Glu condition), besides inhibiting the fermentative metabolism of carbohydrates such as glucose or fructose, allowed the bioconversion products accumulation, without affecting the catalytic activity of the enzymes. The activity of GFOR/GL for the Glu condition (35 U/g of cell) was similar to the reference condition CTAB (31 U/g). Additionally, for the immobilized process, it was found that the cell treatment with glutaraldehyde, that is usually done before immobilization (Glu Imb condition), can also be suppressed because the sole treatment of the support beads with the crosslink agent (White Imb Condition) is enough to inactivate Z. mobilis metabolism. The yields in lactobionic acid and sorbitol, independently of the condition (Glu Imb or White Imb), were about 80%, with products concentrations nearly to 500 mmol/L. The enzymes stability remained stable after 150 days of storage. Bioconversion reactions were carried out in batch mode in a mechanically stirred reactor, with 20 and 30 g/L of the immobilized biocatalyst, resulting in 530 mmol/L of products after 24 h. The process was also tested in fed-batch mode with the purpose of allowing the use of a larger mass of lactose, which could not be employed in batch because of the relatively low solubility of this carbohydrate in water. With 20 g/L of immobilized biomass, product concentrations of 745 mmol/L were obtained in 42 h, whereas with 30 g/L 32 h were needed to reach 776 mmol/L. The results for the reactions conducted in pneumatic-agitated tubular bioreactor with 20 g/L of cells, in batch and fed-batch modes, were very close to those found in the system with mechanical agitation, evidencing the flexibility of the process under this aspect

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-06-29T12:07:11Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Livia Araujo.pdf: 1983609 bytes, checksum: cbba526737c10f6743b3fd015372721a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T12:07:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Livia Araujo.pdf: 1983609 bytes, checksum: cbba526737c10f6743b3fd015372721a (MD5) Previous issue date: 2014-02-20 / CAPEs / Zymomonas mobilis vem despertando um grande interesse no meio científico, industrial e biotecnológico devido ao seu alto potencial fermentativo. Do ponto de vista taxonômico, Z. mobilis é a única espécie do gênero Zymomonas, e é subdivida em três subespécies: Z. mobilis subsp. mobilis, Z. mobilis subsp. pomaceae e Z. mobilis subsp. francensis. A diferenciação destas subespécies é baseada em testes fisiológicos. Estes testes consomem tempo e são frequentemente duvidosos. Por isso, técnicas moleculares são propostas como uma alternativa rápida e confiável para diferenciação destas bactérias. O presente estudo teve como objetivo realizar a caracterização molecular das 32 linhagens de Zymomonas mobilis depositadas na Coleção de Microrganismos UFPEDA, através da análise das sequências do gene 16S rDNA e ARDRA. As linhagens foram cultivadas em meio SSDL por 24 horas à 30º, seguida de centrifugação e extração de DNA cromossômico. As reações de PCR foram realizadas com iniciadores e condições específicas para a amplificação do gene 16S rDNA. Os produtos do gene 16S rDNA amplificados foram purificados, sequenciados e clivados com as enzimas de restrição Hae III, NdeII e StuI. Os dados obtidos pelo sequenciamento do gene 16S rDNA foram analisados, comparados e alinhados, pelo programas BLASTn e MultiAlin, com sequências de linhagens de Z. mobilis previamente depositadas no banco de dados GenBank. Um dendograma foi construido através do programa ClustalW pelo método de neighbor-joining Os perfis de restrição teórico das enzimas de restrição Hae III, NdeII e StuI foram gerados a partir do WebCutter 2.0. Dendogramas foram construídos a partir da matriz de similaridade genética de Jaccard, calculada pela análise dos perfis de restrição teóricos de cada enzima. A análise das sequências obtidas no presente estudo revelou o elevado grau de conservação no gene 16SrDNA, confirmando a relação de proximidade das linhagens de Zymomonas mobilis depositadas na Coleção de Micro-organismos UFPEDA e a aproximidade com a Z. mobilis subsp. mobilis LMG445, sugerindo que as linhagens desta coleção pertencem a esta subespécie.Além disso, conclui-se que a análise do perfil restrição teórico do gene 16S rDNA possibilita a diferenciação de Z. mobilis,a nível de subespécie, mas não é eficaz para analisar a variabilidade genética entre as linhagens de Z. mobilis UFPEDA. Baseados nestes resultados, outros marcadores filogenéticos devem ser empregados para analisar a variabilidade genética destas linhagens, possibilitando um melhor conhecimento da diversidade desta bactéria. / Zymomonas mobilis has attracted great interest in the scientific, industrial and biotechnological medium due to its high fermentation potential. The taxonomic viewpoint, Z. mobilis is the only species of the genus Zymomonas , and is subdivided into three subspecies : Z. mobilis subsp. mobilis, Z. mobilis subsp. pomaceae and Z. mobilis subsp. francensis. The differentiation of these subspecies is based on physiological tests. These tests are time consuming and often unreliable. Therefore, molecular techniques are proposed as a fast and reliable alternative to differentiation of these bacteria. This study aims to perform molecular characterization of 32 strains of Zymomonas mobilis deposited in the Collection of Microorganisms UFPEDA by sequence analysis of 16S rDNA gene and the theoretical restriction profile of this gene. The strains were grown in SSDL for 24 hours at 30 ° , followed by centrifugation and extraction of chromosomal DNA . PCR reactions were performed with primers and specific conditions for amplification of the 16S rDNA gene. The amplified products of 16S rDNA were purified, sequenced, and cleaved with restriction enzymes Hae III, NdeII and StuI . The data obtained by 16S rDNA gene were analyzed, compared and aligned by BLASTn and MultiAlin programs with sequences of strains of Z. mobilis previously deposited in the GenBank databas . A dendogram was constructed using the program ClustalW method by neighbor-joining. Profiles theoretical restriction of restriction enzyme Hae III, NdeII and StuI were generated from WebCutter 2.0. Dendrograms were constructed from the genetic Jaccard similarity matrix, calculated by analyzing the theoretical restriction profiles of each enzyme. The analysis of the sequences obtained in this study revealed the high degree of conservation in 16SrDNA gene, confirming the close relationship of strains of Zymomonas mobilis deposited in the Collection of Micro-organisms UFPEDA and closeness with Z. mobilis subsp. mobilis LMG445, suggesting that the strains in this collection belong to this subespécie. In addition, it is concluded that the theoretical restriction profile analysis of the 16S rDNA gene allows differentiation of Z. mobilis , the level of subspecies , but it is not effective to analyze the genetic variability between strains of Z. mobilis UFPEDA . Based on these results , other phylogenetic markers should be employed to analyze the genetic variability of these strains , allowing a better understanding of the diversity of this bacteria.

The rapid development of the bioethanol industry globally demonstrates the importance of bioethanol as an alternate energy source to the depleting fossil fuels. To decrease costs and avoid undue pressure on the global food supply, the renewable lignocelluloses appear to be a better substrate for bioethanol production compared to others being investigated. This study investigated the conversion of lignocellulosic material, sugarcane bagasse, to ethanol by the use of Zymomonas mobilis and Pichia stipitis. The investigation of fermentation characteristics of the two strains revealed that their performance on the ethanol production was closely related to the viable cell concentration in the medium. The increase of inoculum size to five fold resulted in an increase in the system co-efficiency to 2.2 fold and 5.2 fold respectively for Z. mobilis and P. stipitis. A theoretical value de (the cell instantaneous ethanol production rate) was introduced to describe the ethanol productivity based on biomass. System co-efficiency proved to be only affected by the viable cell concentration (xC) and de, regardless of ethanol re-assimilation. Immobilized culture of Z. mobilis and P. stipitis showed distinct differences in their characteristics. The bacterium acclimatized to the interior of gel beads; the biomass concentration within the beads increased greater than 10 fold during the reuse of the beads, resulting in an improved fermentation performance. The immobilized P. stipitis gave a similar system co-efficiency level of approximately 0.5 g/l/h under different culture conditions; cell growth in the medium was considerably more vigorous compared to that within the beads. P. stipitis sole-culture on the glucose/xylose medium with a high inoculum size showed a comparable fermentation efficiency with the best result of the co-culture processes. Fermentation of 50.0 g/l of sugar mixture (30.0 g/l glucose and 20.0 g/l xylose) was completed in 20 h with an ethanol yield of 0.44 g/g. No catabolite repression due to glucose was observed for the xylose assimilation. Co-culture of immobilized Z. mobilis and free cells of P. stipitis proved to be the best fermentation scheme on the glucose/xylose sugar mixture co-fermentation. The removal of Z. mobilis after the utilization of glucose improved the stability of the performance. The best result showed that 50.0 g/l sugars were fully converted to ethanol within 19 h, giving an ethanol yield of 0.49 g/g, which is 96% of the theoretical rate. When co-cultured, viable cells of Z. mobilis inhibited the cell activity of P. stipitis, and were capable of growing to high concentration levels without an appropriate carbon source. Acid and enzymatic hydrolysates of sugarcane bagasse showed similar fermentability, but the hydrolysate without overliming significantly inhibited both cell growth and ethanol production of P. stipitis. The co-culture process on the hydrolysate medium successfully utilized 53.56 g/l sugars (32.14 g/l glucose and 21.42 g/l xylose) in 26 h with a yield of 0.43 g/g; this value further increased to 0.49 g/g when ethanol peaked at 40 h. A high cell density proved to be an effective method to improve the system co-efficiency for ethanol production. For the fermentation processes on the sugar medium, results achieved in this study, 10.54 g/l/h for Z. mobilis free cell culture on glucose, 0.755 g/l/h for P. stipitis free cell culture on xylose, 1.092 g/l/h for P. stipites free cell culture on the glucose/xylose mixture and 1.277 g/l/h for glucose/xylose co-fermentation using co-culture, are higher than the best values reported in the literature in batch culture. In the fermentation of the hydrolysate, the system co-efficiency of 0.879 g/l/h achieved with co-culture is comparable to the best values reported for the fermentation of lignocellulosic hydrolysates. / Master of Science (Hons)

Zymomonas mobilis is a non-pathogenic, facultatively-anaerobic Gram-negative bacterium, which has historically been used for the fermentation of alcoholic beverages in many tropical/sub-tropical countries. Due to its excellent ethanol-producing capabilities, significant effort has been undertaken over recent years to utilize it for industrial ‘bioethanol’ production. Its physiological and metabolic properties indicate that it may also be an excellent organism for the bio-production of many different types of organic molecules. Consequently, the aim of my thesis was to develop new molecular methodologies that would enable Z. mobilis to be ‘engineered’ for use in future ‘bioproduction’ endeavours. In the first part of my study, I analyzed the native (cryptic) plasmids present within a variety of Z. mobilis strains, including two poorly-studied Z. mobilis strains: NCIMB 11163 and NCIMB 8227. Several plasmid libraries containing restriction-digested fragments of Z. mobilis cryptic plasmid DNA were prepared, and their inserts were sequenced. This enabled the complete DNA sequences of three small (non-integrating, double-stranded DNA) cryptic plasmids to be determined: pZMO1A and pZMO7 from NCIMB 11163, and pZMO1B from NCIMB 8227. Their DNA sequences were analyzed using bioinformatic approaches, to identify open reading frames, and regions of DNA that were putatively involved in transcription or DNA replication. In the second part of this thesis, the minimally-replicating region from plasmid pZMO7 was used to construct a series of Escherichia coli-Z. mobilis shuttle vectors. These vectors were found to be stable within several Z. mobilis strains for over 60 generations without antibiotic selective pressure. A reliable and reproducible method based on quantitative real time PCR (Q-RT-PCR) was developed to accurately determine the copy number of cryptic plasmids and shuttle-vectors present in Z. mobilis cultures. The pZMO7-based shuttle vectors exhibited good compatibility with cryptic plasmids as well as the widely-used pZM2-based shuttle vectors. Genes encoding glutathione S-transferase (GST) as well as green and red fluorescent protein (GFP and RFP) reporters were cloned into various shuttle vector constructs; placing them under the control of endogenous (Ppdc) or exogenous (Plac and Ptac) promoters. Promoter strength was evaluated by quantifying the reporter gene expression. The plasmid-based expression of GFP and RFP was visualized within planktonic and biofilm cultures using confocal laser scanning microscopy (CLSM). Shuttle vector-based GST pull-down experiments were used to study intracellular protein-protein binding interactions. In the third part of my thesis, I explored the potential use of Z. mobilis for the bioproduction of isoprenoid (terpenoid) compounds. Five predicted sesquiterpene synthases (terpene cyclases) of unknown function from the dimorphic fungus Penicillium marneffei, and several terpene cyclases from several other bacteria, fungi and plants were initially functionally-analyzed in E. coli. Several cyclase genes were cloned into E. coli-Z. mobilis shuttle vectors for expression trials within Z. mobilis cells. In summary, this thesis describes the development of a variety of novel methodologies and genetic ‘tools’ that may be used to express heterologous genes within Z. mobilis cells. These will be invaluable for future studies concerned with exploring the biology and industrial applications of this ‘microbial cell factory’. / published_or_final_version / Chemistry / Doctoral / Doctor of Philosophy

Orientador: Crispin Humberto Garcia Cruz / Banca: Vanildo Luiz Del Bianchi / Banca: Fernanda Maria Pagane Guereschi Ernandes / Resumo: A produção de biocombustíveis é uma necessidade e existe a procura de processos economicamente viáveis de obtenção a partir de fontes renováveis de energia, destacando-se a produção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos. O objetivo deste trabalho foi obter etanol a partir do hidrolisado do bagaço de cana-de-açúcar por fermentação pelo consórcio formado por Pachysolen tannophilus e Zymomonas mobilis. Os métodos para a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar, foram variações da concentração de H2SO4 de 0 a 5% v/v, tempo de 15 e 30 min a 121°C e 12 e 24 h a temperatura ambiente e aplicação de desintoxicação com carvão ativado. Para as fermentações até 72 h realizou-se um planejamento experimetal com as variáveis independentes: pH inicial (4,5; 5,5 e 6,5), temperatura (25; 30 e 35 °C), agitação (0; 75 e 150 rpm), tempo de incubação (24; 48 e 72 h) e concentração do substrato (5; 10 e 15% m/v) utilizando três meios de fermentação (glicose, hidrolisado sem desintoxicar e hidrolisado desintoxicado). Para analisar a cinética, a fermentação foi monitorada a cada 2 h no período de 24 h em pH 5,5 a 30°C, sem agitação com 15% m/v de substrato para cada micro-organismo nos três meios testados. Para a fermentação com o consórcio os micro-organismos foram inoculados juntos ao início da fermentação dividida em dois grupos um foi em pH 4,5 com 5% de substrato e outro em pH 6,5 com 15% de substrato, sem agitação a 30°C em 24 h monitorada a cada 2 h. Os resultados para a hidrólise o resultado de açúcares totais para o padrão escolhido (2% de H2SO4 em 15 min a 121 ºC) foi de 78,7 mg/mL. A desintoxicação apresentou redução de 26,2 % de compostos fenólicos totais. A maior produção de etanol por Z. mobilis foi de 36,6 mg/mL no tempo de fermentação de 6 h. Por P. tannophilus foi de 39,8 mg/mL no ensaio com 72 h, 35 °C, 150 rpm, pH 6,5 e 15% m/v com meio hidrolisado sem desintoxicar ... / Abstract: The biofuel production is necessary and there are searches for economically viable processes for the production from renewable energy sources, stands out ethanol production from lignocellulosic materials. The aim of this study was to obtain ethanol from sugarcane bagasse hydrolyzate with fermentation by Zymomonas mobilis and Pachysolen tannophilus consortium. The methods for sugarcane bagasse hydrolysis were variations in the concentration of H2SO4 from 0 to 5% v/v, time 15 to 30 min at 121 °C, 12 and 24 h at ambient temperature and submission of detoxification with activated charcoal. For up to 72 h fermentations made experimetal planning with independent variables: initial pH (4,5; 5,5 and 6,5), temperature (25, 30 and 35 ° C), agitation (0; 75 and 150 rpm), incubation time (24; 48 and 72 h) and substrate concentration (5; 10 and 15% w/v) using three fermentation media (glucose, hydrolyzed without detoxify and detoxified hydrolyzate). To evaluate kinetics, the fermentation was monitored every 2 h during 24 h at pH 5,5 at 30 °C without shaking with 15% w/v substrate, for each micro-organism. The consortium fermentation, micro-organisms were inoculated together at the beginning of fermentation and was divided into two groups one was at pH 4,5 with 5% and another substrate at pH 6,5 with 15% substrate without shaking at 30 °C 24 h monitored every 2 h. The results for hydrolysis to total sugars of chosen standard (2% H2SO4 for 15 min at 121 °C) were 78,7 mg/mL. The detoxification decreased 26, 2% of total phenolic compounds. The higher ethanol production by Z. mobilis was 36,6 mg/mL in 6 h of fermentation. For P.tannophilus was 39,8 mg/mL in 72 h, 35 °C, 150 rpm, pH 6,5 and 15% w/v with without detoxify hydrolyzate medium and 38,7 mg/mL in detoxified hydrolyzate medium at 6 h. The consortium obtained 42 mg/mL of ethanol under pH 6,5 with 15% w/v detoxified hydrolyzate medium at 6 h with productivity of 5,4 g/L.h-1. The consortium was ... / Mestre

Sorbitol e ácido glucônico são obtidos equimolarmente em reação catalisada por glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glucono-δ-lactonase (GL), enzimas periplasmáticas de Zymomonas mobilis. Visto que a demanda comercial do sorbitol é muito superior à do ácido glucônico, este trabalho objetivou aprofundar o conhecimento sobre a capacidade do complexo GFOR/GL de oxidar outras aldoses a seus respectivos ácidos orgânicos. O cultivo de Z. mobilis foi analisado visando a obtenção de biomassa, GFOR/GL e etanol. Em cultivo descontínuo em meio com 7,5 a 10,0 g/L de extrato de levedura bruto, obtiveramse cerca de 24 unidades de GFOR/GL por grama de células secas (U/g). Em regime descontínuo alimentado, atividade de 27 U/g e rendimento em etanol de 95% foram atingidos. A ação de GFOR/GL sobre diferentes pares frutose/aldoses foi avaliada com células permeabilizadas livres ou imobilizadas em alginato de cálcio. Com 0,7 mol/L de frutose/glicose, em sistema imobilizado, as mais altas atividades foram medidas entre 47 e 50°C com pH de 7,8 a 8,2, constatando-se que um valor de pH mais alto no meio permite a ocorrência de um pH próximo ao ideal (6,4) no interior das esferas de alginato. Conforme os substratos são consumidos, com conseqüente redução da velocidade reacional, pHs mais baixos no meio externo são exigidos. Entre as aldoses testadas, a maior afinidade enzima / substrato foi observada com maltose e a menor com lactose. Devido às aplicações comerciais do seu produto de oxidação - ácido lactobiônico - lactose foi estudada em detalhes. Com 0,7 mol/L de lactose/frutose, a máxima velocidade específica de formação de ácido lactobiônico foi, em média, de 4,0 mmol/g/h, com células livres, a 39°C e pH 6,4, e de 2,0 mmol/g/h, com o sistema imobilizado, a 47ºC e pH 6,4. Os resultados indicam a viabilidade da produção de ácido lactobiônico por este processo, já que conversões superiores a 85 % são obtidas. / Sorbitol and gluconic acid can be obtained, in equimolar basis, by reaction catalysed by the periplasmic enzymes glucose-fructose oxidoreductase (GFOR) and glucono-δ-lactonase (GL) of Zymomonas mobilis. Since the commercial demand for sorbitol is much larger than that for gluconic acid, the aim of this work was to achieve a deeper knowledge on the capacity of GFOR/GL complex in oxidising other aldoses to their respective organic acids. Z. mobilis cultivation was analysed with respect to growth and GFOR/GL and ethanol production. In batch cultivation in medium with 7.5 and 10.0 g/L of non-purified yeast extract, ca. of 24 GFOR/GL units per gram of dry cells (U/g) were obtained. In fed-batch mode, an activity of 27 U/g and an ethanol yield over 95% were achieved. The action of GFOR/GL on different fructose/aldose pairs was assessed with permeabilised cells, either free or immobilised in calcium alginate. With 0.7 mol/L of fructose/aldose, in immobilised system, the highest activities were measured between 47 and 50°C at pH 7.8-8.2, observing that higher pH values in the reaction medium led to the occurrence of pH values close to the optimum (6.4) in the inner space of alginate beads. As substrates were consumed, and as a consequence the reaction rate decreased, lower pH values in the external medium were needed. Among the aldoses tested, the highest enzyme - substrate affinity was observed for maltose and the lowest for lactose. Due to the commercial uses of its oxidation product - lactobionic acid - lactose was studied in details. With 0.7 mol/L of lactose/fructose, the maximum lactobionic acid specific production rate was in average 4.0 mmol/g/h with free cells, at 39ºC and pH 6.4, and 2.0 mmol/g/h with immobilised system, at 47ºC and pH 6.4. The results indicate the feasibility of producing lactobionic acid by this process, since conversion over 85% are obtained.

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:25:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-06. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:48:35Z : No. of bitstreams: 1 000843884.pdf: 1475946 bytes, checksum: 6f51d0f969e5f4ac156a68ba477a8f29 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A produção de etanol combustível a partir de resíduos lignocelulósicos, como tecnologia emergente, conhecida como bioetanol de segunda geração, está sendo bastante pesquisada em virtude de uma preocupação com o desenvolvimento de fontes energéticas renováveis e mais limpas. Neste contexto as indústrias vinícolas têm destaque, já que o subproduto gerado por elas, bagaço e engaço, por exemplo, é de lenta decomposição. Ao mesmo tempo em que há buscas por novos substratos, há também por micro-organismos capazes de fermentar monossacarídeos presentes nestes resíduos para produzir bioetanol, e também que estes consigam fermentar em consórcio sem que haja competição entre eles para o melhor aproveitamento destas fontes de carbono. Neste trabalho foram realizadas fermentações pela bactéria Zymomonas mobilis CCT 4494 e pela levedura Candida tropicalis em hidrolisados ácidos dos resíduos de uvas das espécies Isabel e Bordô, para isto, foi utilizada a concentração de ácido sulfúrico de 1,5% com aquecimento em autoclave a 121 ºC e 1 kgf/cm2. Foram realizadas também, fermentações utilizando meios semi-sintéticos com glicose e xilose (50 g/L) como substratos para a Z. mobilis e C. tropicalis, respectivamente. Nas fermentações realizadas pela bactéria Z. mobilis, utilizando tanto a mistura (50% bagaço e 50% engaço) dos resíduos quanto apenas o engaço não houve detecção de etanol por cromatografia gasosa. Com o meio semi-sintético, em 8 horas de fermentação, foram produzidos 17,0 g/L de etanol. Durante as fermentações efetuadas pela levedura C. tropicalis, houve produção de etanol de 1,04 g/L e 5,89 g/L em 6 horas de fermentação utilizando a mistura dos resíduos e o engaço, respectivamente e, 18,56 g/L em 8 horas em meio semi-sintético. No consórcio dos micro-organismos, a produção de etanol, utilizando primeiramente a mistura e depois o engaço foi de 0,72 g/L e 1,15 g/L, ambas em 8 horas... / The production of fuel ethanol from lignocellulosic residues, as an emerging technology, known as second-generation bioethanol is being extensive research because of a concern with the development of renewable and cleaner energy sources. In this context, the wine industry has highlighted, since the by-product generated by them, bagasse and stems, for example, is the slow decomposition. While there search for new substrates, there are also micro-organisms capable of fermenting monosaccharides present in these residues to produce bioethanol, and also that they are able to ferment in a consortium without competition between them for better use of these carbon sources . In this work were carried out fermentations by Zymomonas mobilis CCT 4494 bacteria and the yeast Candida tropicalis in hydrolyzed acid waste grape species Isabel and Bordô, for this, we used the sulfuric ...

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-24Bitstream added on 2014-11-10T11:58:02Z : No. of bitstreams: 1 000791305_20150801.pdf: 168537 bytes, checksum: eebff6a38fa55ffbd364d7251fcc3116 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-03T12:20:57Z: 000791305_20150801.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-03T12:22:18Z : No. of bitstreams: 1 000791305.pdf: 2104232 bytes, checksum: f474316f23c6cc7323aecf25161298ee (MD5) / A produção de biocombustíveis é uma necessidade e existe a procura de processos economicamente viáveis de obtenção a partir de fontes renováveis de energia, destacando-se a produção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos. O objetivo deste trabalho foi obter etanol a partir do hidrolisado do bagaço de cana-de-açúcar por fermentação pelo consórcio formado por Pachysolen tannophilus e Zymomonas mobilis. Os métodos para a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar, foram variações da concentração de H2SO4 de 0 a 5% v/v, tempo de 15 e 30 min a 121°C e 12 e 24 h a temperatura ambiente e aplicação de desintoxicação com carvão ativado. Para as fermentações até 72 h realizou-se um planejamento experimetal com as variáveis independentes: pH inicial (4,5; 5,5 e 6,5), temperatura (25; 30 e 35 °C), agitação (0; 75 e 150 rpm), tempo de incubação (24; 48 e 72 h) e concentração do substrato (5; 10 e 15% m/v) utilizando três meios de fermentação (glicose, hidrolisado sem desintoxicar e hidrolisado desintoxicado). Para analisar a cinética, a fermentação foi monitorada a cada 2 h no período de 24 h em pH 5,5 a 30°C, sem agitação com 15% m/v de substrato para cada micro-organismo nos três meios testados. Para a fermentação com o consórcio os micro-organismos foram inoculados juntos ao início da fermentação dividida em dois grupos um foi em pH 4,5 com 5% de substrato e outro em pH 6,5 com 15% de substrato, sem agitação a 30°C em 24 h monitorada a cada 2 h. Os resultados para a hidrólise o resultado de açúcares totais para o padrão escolhido (2% de H2SO4 em 15 min a 121 ºC) foi de 78,7 mg/mL. A desintoxicação apresentou redução de 26,2 % de compostos fenólicos totais. A maior produção de etanol por Z. mobilis foi de 36,6 mg/mL no tempo de fermentação de 6 h. Por P. tannophilus foi de 39,8 mg/mL no ensaio com 72 h, 35 °C, 150 rpm, pH 6,5 e 15% m/v com meio hidrolisado sem desintoxicar ... / The biofuel production is necessary and there are searches for economically viable processes for the production from renewable energy sources, stands out ethanol production from lignocellulosic materials. The aim of this study was to obtain ethanol from sugarcane bagasse hydrolyzate with fermentation by Zymomonas mobilis and Pachysolen tannophilus consortium. The methods for sugarcane bagasse hydrolysis were variations in the concentration of H2SO4 from 0 to 5% v/v, time 15 to 30 min at 121 °C, 12 and 24 h at ambient temperature and submission of detoxification with activated charcoal. For up to 72 h fermentations made experimetal planning with independent variables: initial pH (4,5; 5,5 and 6,5), temperature (25, 30 and 35 ° C), agitation (0; 75 and 150 rpm), incubation time (24; 48 and 72 h) and substrate concentration (5; 10 and 15% w/v) using three fermentation media (glucose, hydrolyzed without detoxify and detoxified hydrolyzate). To evaluate kinetics, the fermentation was monitored every 2 h during 24 h at pH 5,5 at 30 °C without shaking with 15% w/v substrate, for each micro-organism. The consortium fermentation, micro-organisms were inoculated together at the beginning of fermentation and was divided into two groups one was at pH 4,5 with 5% and another substrate at pH 6,5 with 15% substrate without shaking at 30 °C 24 h monitored every 2 h. The results for hydrolysis to total sugars of chosen standard (2% H2SO4 for 15 min at 121 °C) were 78,7 mg/mL. The detoxification decreased 26, 2% of total phenolic compounds. The higher ethanol production by Z. mobilis was 36,6 mg/mL in 6 h of fermentation. For P.tannophilus was 39,8 mg/mL in 72 h, 35 °C, 150 rpm, pH 6,5 and 15% w/v with without detoxify hydrolyzate medium and 38,7 mg/mL in detoxified hydrolyzate medium at 6 h. The consortium obtained 42 mg/mL of ethanol under pH 6,5 with 15% w/v detoxified hydrolyzate medium at 6 h with productivity of 5,4 g/L.h-1. The consortium was ...

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-10-25Bitstream added on 2014-12-02T11:21:32Z : No. of bitstreams: 1 000793729_20151025.pdf: 68328 bytes, checksum: 2c29ffdb00da2de696af129da92f019f (MD5) Bitstreams deleted on 2015-11-03T14:39:12Z: 000793729_20151025.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-11-03T14:40:14Z : No. of bitstreams: 1 000793729.pdf: 4280289 bytes, checksum: fa8d7dafbfb92dc16f13a166c4e979d4 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A bactéria Zymomonas mobilis é considerada um microrganismo com alto potencial biotecnológico para a produção de etanol e levana, por apresentar baixa produção de biomassa e alta tolerância a elevadas concentrações de etanol. Apesar disso, sua eficiência pode ser prejudicada, devido a exposição das células livres a condições desfavoráveis durante os processos fermentativos convencionais. A utilização de células imobilizadas é uma alternativa para solucionar tais problemas, pois oferece inúmeras vantagens como maior concentração celular, maior estabilidade e conseqüentemente maior produção. Diante disso, o objetivo deste trabalho, foi selecionar um suporte adequado para a imobilização de Zymomonas mobilis visando aumentar a produção de etanol e levana empregando sacarose como fonte de carbono. Os suportes avaliados foram: alginato, quitosana, bucha vegetal e bagaço de cana. Os melhores parâmetros para a produção de etanol e levana, foram determinados utilizando a metodologia de superfície de resposta (MSR). O primeiro experimento realizado foi 2(5-2) com as variáveis independentes: concentração de sacarose; pH; tempo de incubação; temperatura e agitação do meio de cultura. Com base nas melhores condições observadas no experimento 2(5-2) foi avaliada a capacidade de reutilização dos suportes em fermentações subseqüentes durante 12 dias. A produção de etanol foi determinada pelo método de microdifusão e a levana foi determinada indiretamente em unidades de frutose após hidrólise ácida. A biomassa foi determinada por densidade ótica a 570 nm e a fixação do microrganismo no suporte foi confirmada por microscopia eletrônica de varredura. No experimento 2(5-2), verificou-se que o melhor suporte de imobilização foi a bucha vegetal, a qual apresentou os maiores valores de biomassa imobilizada (2,95 g/L); produção de levana (24,9 g/L) e etanol (50,95 g/L). Para os experimentos com ... / Zymomonas mobilis is considered to have high biotechnological potential for ethanol and levan production, because it produces little biomass and shows good tolerance to ethanol concentrations. However, this efficiency can be decreased if the free cells are exposed to unfavorable conditions during conventional fermentations. Cell immobilization is an alternative to solve this problem and offers numerous advantages such as higher cell concentrations, greater stability and improved production. Thus the aim of this work was to select a suitable support for the immobilization of Zymomonas mobilis in order to increase the production of ethanol and levan from sucrose as the carbon source. The optimum values for ethanol and levan production were determined using response surface methodology (RSM). The first experiment was a 2(5-2) design with the following independent variables: sucrose concentration, pH, incubation time, temperature and agitation of the culture medium. Based on the best conditions observed in the 2(5-2) experiment, reuse of the support was evaluated during 12 days of fermentation. Ethanol production was determined by microdiffusion and the levan production on fructose units after acid hydrolysis. The biomass was determined by optical density at 570 nm and microbial growth on the support was verified by scanning electron microscopy. In the 2(5-2) experiment the loofa sponge was the best support for immobilization with the highest values for immobilized biomass (2.95 g/L); levan production (24.9 g/L) and ethanol production (50.95 g/L). In the immobilization support reuse experiments in batch fermentations, all the supports evaluated could be reused for 12 cycles, with the exception of chitosan beads. Sugarcane bagasse was shown to be the best substrate for microbial adhesion (3.23 g/L) and for levan (32.13 g/L) and ethanol production (36.50 g/L). Thus the loofa sponge and sugarcane bagasse represented the most promising support ...

Sorbitol e ácido glucônico são obtidos equimolarmente em reação catalisada por glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glucono-δ-lactonase (GL), enzimas periplasmáticas de Zymomonas mobilis. Visto que a demanda comercial do sorbitol é muito superior à do ácido glucônico, este trabalho objetivou aprofundar o conhecimento sobre a capacidade do complexo GFOR/GL de oxidar outras aldoses a seus respectivos ácidos orgânicos. O cultivo de Z. mobilis foi analisado visando a obtenção de biomassa, GFOR/GL e etanol. Em cultivo descontínuo em meio com 7,5 a 10,0 g/L de extrato de levedura bruto, obtiveramse cerca de 24 unidades de GFOR/GL por grama de células secas (U/g). Em regime descontínuo alimentado, atividade de 27 U/g e rendimento em etanol de 95% foram atingidos. A ação de GFOR/GL sobre diferentes pares frutose/aldoses foi avaliada com células permeabilizadas livres ou imobilizadas em alginato de cálcio. Com 0,7 mol/L de frutose/glicose, em sistema imobilizado, as mais altas atividades foram medidas entre 47 e 50°C com pH de 7,8 a 8,2, constatando-se que um valor de pH mais alto no meio permite a ocorrência de um pH próximo ao ideal (6,4) no interior das esferas de alginato. Conforme os substratos são consumidos, com conseqüente redução da velocidade reacional, pHs mais baixos no meio externo são exigidos. Entre as aldoses testadas, a maior afinidade enzima / substrato foi observada com maltose e a menor com lactose. Devido às aplicações comerciais do seu produto de oxidação - ácido lactobiônico - lactose foi estudada em detalhes. Com 0,7 mol/L de lactose/frutose, a máxima velocidade específica de formação de ácido lactobiônico foi, em média, de 4,0 mmol/g/h, com células livres, a 39°C e pH 6,4, e de 2,0 mmol/g/h, com o sistema imobilizado, a 47ºC e pH 6,4. Os resultados indicam a viabilidade da produção de ácido lactobiônico por este processo, já que conversões superiores a 85 % são obtidas. / Sorbitol and gluconic acid can be obtained, in equimolar basis, by reaction catalysed by the periplasmic enzymes glucose-fructose oxidoreductase (GFOR) and glucono-δ-lactonase (GL) of Zymomonas mobilis. Since the commercial demand for sorbitol is much larger than that for gluconic acid, the aim of this work was to achieve a deeper knowledge on the capacity of GFOR/GL complex in oxidising other aldoses to their respective organic acids. Z. mobilis cultivation was analysed with respect to growth and GFOR/GL and ethanol production. In batch cultivation in medium with 7.5 and 10.0 g/L of non-purified yeast extract, ca. of 24 GFOR/GL units per gram of dry cells (U/g) were obtained. In fed-batch mode, an activity of 27 U/g and an ethanol yield over 95% were achieved. The action of GFOR/GL on different fructose/aldose pairs was assessed with permeabilised cells, either free or immobilised in calcium alginate. With 0.7 mol/L of fructose/aldose, in immobilised system, the highest activities were measured between 47 and 50°C at pH 7.8-8.2, observing that higher pH values in the reaction medium led to the occurrence of pH values close to the optimum (6.4) in the inner space of alginate beads. As substrates were consumed, and as a consequence the reaction rate decreased, lower pH values in the external medium were needed. Among the aldoses tested, the highest enzyme - substrate affinity was observed for maltose and the lowest for lactose. Due to the commercial uses of its oxidation product - lactobionic acid - lactose was studied in details. With 0.7 mol/L of lactose/fructose, the maximum lactobionic acid specific production rate was in average 4.0 mmol/g/h with free cells, at 39ºC and pH 6.4, and 2.0 mmol/g/h with immobilised system, at 47ºC and pH 6.4. The results indicate the feasibility of producing lactobionic acid by this process, since conversion over 85% are obtained.