Le stress oxydant est un acteur clé dans les réponses des plantes à des conditions contraignantes. En raison de la complexité de la régulation de l’état redox cellulaire, il reste beaucoup à élucider concernant les interactions entre différentes composantes dans ces conditions. Grâce à une approche de génétique inverse basée sur un mutant d’Arabidopsis déficient en catalase (cat2) qui présente des modifications d’état redox prévisibles et bien définies, cette étude a exploré les interactions entre le stress oxydant et (1) un gène spécifique impliqué dans la déphosphorylation des protéines, (2) des enzymes spécifiques impliquées dans les systèmes antioxydants réducteurs. Les résultats obtenus révèlent que la sous-unité B'γ de la protéine phosphatase de type 2A (PP2A-B'γ) est importante dans la détermination des phénotypes et des réponses de défense photopériode-dépendantes chez cat2. En conditions de jours courts (SD), un double cat2 pp2a-b'γ mutant montrait une gamme de réponses qui n’étaient pas observées chez cat2. Ces effets comprenaient l’apparition de lésions ainsi que l’accumulation de l’acide salicylique et d’autres composés de défense. Des analyses métabolomiques et protéomiques ont permis de démontrer que ces effets étaient accompagnés de modifications de l’abondance de métabolites et protéines spécifiques, ainsi que des changements dans le statut de phosphorylation de certains polypeptides. Dans un deuxième volet du travail, l’importance d’une enzyme productrice du NADPH a été évaluée en produisant des doubles cat2 nadp-me2 mutants chez lesquels l’isoforme majeure de l’enzyme malique cytosolique n’est plus exprimée. Malgré une induction de cette enzyme par le stress oxydant aux niveaux de transcrits et d’activité, et une diminution importante de l’activité foliaire associée aux mutations nadp-me2, peu de différence a été observée entre les lignées cat2 et cat2 nadp-me2. De même, la mutation nadp-me2 n’a pas affecté la réponse phénotypique de plantes exposées à l’ozone. Dans la troisième partie du travail, le couplage entre les pools ascorbate et glutathion lors du stress oxydant a été exploré par l’introduction de mutations pour la déshydroascorbate réductase (DHAR) dans le fond génétique cat2. L’activité extractible de cette enzyme a été diminuée à des niveaux très faibles chez des lignées portant à la fois les mutations dhar1 et dhar3. Cependant, peu de différence a été observée dans les phénotypes et les statuts d’ascorbate et de glutathion chez un triple mutant cat2 dhar1 dhar3 par rapport à cat2. Des analyses préliminaires d’un quadruple cat2 dhar1 dhar2 dhar3 mutant semblent pourtant indiquer que les trois DHARs jouent des rôles fonctionnellement redondants dans le stress oxydant. Dans son ensemble, ces travaux apportent des données nouvelles sur les enzymes qui régulent les réponses aux stress oxydants et ont généré des outils intéressants pour des études ultérieures. / Oxidative stress is a key player in plant responses to challenging environmental conditions. The intricate nature of the regulation of cellular redox state means that much remains to be elucidated on interactions between different components in these conditions. By using a genetic approach based on a catalase-deficient Arabidopsis mutant (cat2) that presents well-defined, predictable changes in redox state, this study explored interactions between oxidative stress and (1) a specific gene involved in protein dephosphorylation, and (2) specific enzymes involved in the antioxidative/reducing system. The results showed that protein phosphatase 2 subunit B'γ (PP2A-B'γ) is involved in determining day length-dependent phenotypes and related defense responses in cat2. A cat2 pp2A-B'γ double mutant showed a range of responses that were not observed in cat2 grown in short days, including lesion formation and accumulation of salicylic acid (SA) and related metabolites. Metabolomics and proteomics analyses showed that these effects were associated with altered abundance of specific metabolites and proteins, as well as changes in protein phosphorylation status. A second part of the study investigated the importance of NADP-generating enzymes in oxidative stress by production of cat2 nadp-me2 double mutants, in which the cytosolic isoform of NADP-malic enzyme is knocked out. Although NADP-ME2 was shown to be induced by oxidative stress, and mutants for this gene had much decreased leaf NADP-malic enzyme activity, no effects on cat2 phenotypes or redox profiles were apparent. Similarly, phenotypic responses to ozone were not affected in an nadp-me2 single mutant. In the third part, coupling between ascorbate and glutathione pools during oxidative stress was investigated by introduction of loss of function mutations for dehydroascorbate reductase (DHAR) into the cat2 background. In lines carrying a combination of dhar1 and dhar3 mutations, extractable leaf activity was decreased to very low levels. Despite this, cat2 dhar1 dhar3 and cat2 phenotypes and ascorbate and glutathione pools were similar. However, preliminary functional analysis of a cat2 dhar1 dhar2 dhar3 quadruple mutant suggested that the three DHARs play functionally redundant roles in oxidative stress. Overall, the work provides new data on enzymes that regulate responses to oxidative stress and has produced interesting genetic tools for further study.

L'esca est un syndrome cryptogamique vasculaire de la vigne (Vitis vinifera). Une phase pionnière, sous la dépendance de Phaeoacremonium aleophilum (PA), Phaeomoniella chlamydospora (PC) et éventuellement de Eutypa lata (EL) permet la mise en place d'autres espèces. Depuis l'interdiction de l'arsénite de sodium, cette maladie n'est plus contrôlée.<br /> Nous avons étudié les propriétés de PA, PC et EL, en particulier l'impact sur leur croissance de fongicides commerciaux et de fongicides systémiques synthétisés au laboratoire, ainsi que de molécules naturelles. Ces pathogènes ne présentent pas la même sensibilité à ces molécules et l'un d'eux (PA) est peu affecté par divers traitements. En parallèle, nous avons étudié les propriétés d'ambimobilité de l'acide salicylique (AS) et de quelques-uns de ses dérivés halogénés.<br /> Nous avons montré que F 30, un dérivé acide du fenpiclonil, est mobile dans les boutures de vigne après application foliaire. Il est en partie retenu dans le bois et libère la molécule parent dans les racines. L'acide 5-chlorosalicylique (5-ClAS), connu pour être plus actif que AS pour stimuler les défenses naturelles, présente une mobilité voisine de celle de AS. Sur ces bases, F 30 et 5-ClAS ont été retenus pour des tests préliminaires de traitement par voie foliaire de boutures de vigne infectées.<br /> Cette recherche exploratoire souligne la complexité de la problématique, une lutte chimique (fongicide), génératrice de contraintes, devant s'intégrer dans une stratégie globale de contrôle.

La délivrance contrôlée de médicaments constitue un enjeu thérapeutique de première importance pour le milieu médical. Elle doit, en effet, permettre de diminuer la toxicité du médicament en limitant sa concentration dans l'organisme et en ciblant son lieu de délivrance. Ce projet de recherche a conduit à la réalisation de nouveaux nano-vecteurs particulaires utilisables pour la délivrance de médicaments par hyperthermie locale. Ces objets sont constitués d'un cœur de polynorbornène et d’une écorce de poly (oxyde d’éthylène) et sont synthétisés par polymérisation par ouverture de cycle de type métathèse (ROMP) en dispersion. L’acide salicylique est encapsulé dans ces particules en tant que molécule modèle. L'originalité de ce sujet pluridisciplinaire réside : dans la nature de la particule, qui permet une libération du principe actif à partir de 35-45°C et dans la technique d'imprégnation des particules par la voie fluide supercritique. / Controlled release systems are attracting increasing interest because of their potential application in biomedical field. Indeed, such systems should enable to lower toxicity of medicines by targeting the therapeutic action and by limiting the concentration of drugs in the organism. In this research project, new nanoparticles have been developed for a thermosensitive control of drugs’ delivery. These particles consist of a polynorbornene core and a polyethylene oxide shell and are developed by dispersion ring opening metathesis polymerization. As a model drug, salicylic acid has been encapsulated in those core-shell materials. This multidisciplinary project is original for two reasons. On the one hand, the nature of the particle which enables to release the drug from 35-45°C. On the other hand, the encapsulation technique that has been chosen is the impregnation under supercritical carbon dioxide.

Le H2O2 est reconnu comme un signal dans l’activation des mécanismes de défense en réponse à divers stress, et son accumulation est donc régulée étroitement par le système antioxydant des plantes. Puisque la signalisation par le H2O2 peut être transmise par des processus thiol-dépendants, le statut du glutathion pourrait jouer un rôle important. Le rôle de ce composé en tant que molécule antioxydante est bien établi; cependant, son importance en tant que signal reste à élucider. Afin d’étudier cette question, ce travail a utilisé un mutant, cat2, ayant un défaut dans son métabolisme du H2O2 peroxysomal qui engendre, d’une manière conditionnelle, une oxydation et une accumulation du glutathion. Les modifications du glutathion dans cat2 sont accompagnées par l’activation à la fois de réponses dépendantes de l’acide salicylique (SA) ainsi que l’expression de gènes associés à l’acide jasmonique (JA). L’activation des deux voies phytohormonales par le stress oxydant intracellulaire est largement empêchée en bloquant génétiquement l’accumulation du glutathion dans un double mutant, cat2 cad2, qui porte une mutation additionnelle dans la voie de synthèse du glutathion. Les phénotypes contrastants de cat2 cad2 et cat2 gr1, dans lequel la perte de l’activité GR1 aggrave le stress oxydant, suggèrent que des processus glutathion-dépendants relient le H2O2 et l’activation des réponses de pathogenèse SA-dépendantes par un effet qui est additionnel aux fonctions antioxydantes du glutathion. Des comparaisons directes de cat2 cad2 et cat2 npr1 indiquent que les effets de bloquer l’accumulation du glutathion sur l’induction des voies SA et JA chez cat2 ne sont pas causés par une déficience dans la fonction de la NPR1. L’autophagie a été impliquée dans des processus comme la sénescence, et interagirait à la fois avec le stress oxydant et avec la signalisation par le SA. Afin d’explorer des relations entre autophagie et stress oxydant, des mutants atg ont été sélectionnés et croisés avec le cat2. Des analyses phénotypiques ont révélé que l’étendue de lésions SA-dépendantes observée chez cat2 cultivé en jours longs est similaire chez trois double mutants cat2 atg, alors que l’augmentation de la disponibilité en H2O2 peroxysomal liée à la mutation cat2 retarde la sénescence précoce observée chez les mutants atg. Dans son ensemble, le travail suggère que (1) des nouvelles fonctions glutathion-dépendantes sont importantes pour relier la disponibilité en H2O2 intracellulaire et activation des voies de signalisation SA et JA, et (2) que le H2O2 produit par la photorespiration pourrait jouer un rôle antagoniste dans les phénotypes de sénescence précoce observée chez les mutants atg. / H2O2 is a recognized signal in activation of defence mechanisms in response to various stresses, and its accumulation is thus tightly controlled by plant antioxidant systems. Because H2O2 signals may be transmitted by thiol-dependent processes, glutathione status could play an important role. While the antioxidant role of this compound is long established, the importance of glutathione in signaling remains unclear. To study this question, this work exploited a stress mimic mutant, cat2, which has a defect in metabolism of peroxisomal H2O2 that conditionally leads to oxidation and accumulation of glutathione. In cat2, changes in glutathione are accompanied by activation of both salicylic acid (SA)-dependent responses and jasmonic acid (JA)-associated genes in a time-dependent manner. This up-regulation of both phytohormone signaling pathway by intracellular oxidative stress can be largely prevented by genetically blocking glutathione accumulation in a double mutant, cat2 cad2, that additionally carries a mutation in the pathway of glutathione synthesis. Contrasting phenotypes between cat2 cad2 and cat2 gr1, in which loss of GR1 activity exacerbates oxidative stress, suggest that glutathione-dependent processes couple H2O2 to activation of SA-dependent pathogenesis responses through an effect that is additional to glutathione antioxidant functions. Direct comparison of cat2 cad2 and cat2 npr1 double mutants suggests that the effects of blocking glutathione accumulation on cat2-triggered up-regulation of both SA and JA pathways are not mediated by defective NPR1 function. Autophagy has been implicated in processes such as senescence, and may interact with oxidative stress and SA signaling. To explore relationships between autophagy and oxidative stress, selected atg mutants were crossed with cat2. Phenotypic analysis revealed that SA-dependent lesion spread observed in cat2 grown in long days is similar in three cat2 atg double mutants, whereas increased peroxisomal H2O2 availability in cat2 delays an oxidative stress related-senescence triggered by atg in short days. Overall, the work suggests that (1) novel glutathione-dependent functions are important to couple intracellular H2O2 availability to the activation of both SA and JA signaling pathways and (2) H2O2 produced through photorespiration may play an antagonistic role in the early senescence phenotype observed in atg mutants.