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Associação entre o exame clínico andrológico e testes de viabilidade espermática, integridade de acrossoma e fragmentação de cromatina para determinar a qualidade seminal de touros / Association between clinical andrologic examination and tests of spermatic viability, integrity of acrosome and fragmented chromatin to determine seminal quality of bullsSilva, Rogério Orfaly Addad da 08 December 2006 (has links)
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Previous issue date: 2006-12-08 / Thirty six Nelore bulls with age between 30 and 120 months were used to evaluation of the seminal quality and the reproductive aptitude. The animals had been kept in extensive conditions, with feeding the grass, receiving mineral supplementation and serving a herd with 3,782 females of some categories (heifers and cows). Data enclosed measured of scrotal circumference and evaluation of the semen collected by eletroejaculation and evaluated the physical characteristics (volume, mass activity, motility, strong), morphologic (major, minor and total defects) and spermatic structure integrity (integrity of plasmatic membrane, acrosome and chromatin) in this period had been carried through that preceded three consecutive mating season (2003, 2004 and 2005). The data had been submitted analyze of variance, the averages compared for test SNK and the coefficient of correlation of Pearson was calculated using the SAS. The bulls presented scrotal circumference of 33.8 ± 2.8cm, 15.6 ± 8.5% of total spermatic defects, 40.1 ± 23.1% of gametes with normal membrane and acrosome and 8.8 ± 3.8% of fragmented chromatin. The relations between scrotal circumference, physical and morphologic characteristics, spermatic integrity and the reproductive performance of the herd had been low and not significant (P< 0.05). In sexually mature bulls the integrity of plasmatic membrane, acrosome and nuclear chromatin had not been the most frequent trouble of the spermatic morphology. / Foram utilizados 36 touros da raça Nelore com idade entre 30 e 120 meses, para avaliação da qualidade seminal e da aptidão reprodutiva. Os animais foram mantidos em condições extensivas, com alimentação a pasto, recebendo suplementação mineral e servindo um rebanho com 3782 fêmeas de várias categorias (novilhas, vacas primíparas e pluríparas). Foram realizadas colheitas de dados que abrangiam medidas de circunferência escrotal e avaliação do sêmen colhido por eletroejaculação e avaliadas as características físicas (volume, turbilhonamento, motilidade, vigor), morfológicas (defeitos maiores, menores e totais) e de integridade espermática (integridade de membrana plasmática, de acrossoma e de cromatina) no período que antecedeu três estações de monta consecutivas (2003, 2004 e 2005). Os dados foram submetidos a analise de variância, as médias comparadas pelo teste SNK e o coeficiente de correlação de Pearson foi calculado utilizando o SAS. Os touros apresentaram circunferência escrotal de 33,8 ± 2,8cm, 15,6 ± 8,5% de defeitos espermáticos totais, 40,1 ± 23,1% de gametas com membrana e acrossoma íntegros e 8,8 ± 3,8% de cromatina fragmentada. As relações entre circunferência escrotal, as características físicas, morfológicas e de integridade espermática e o desempenho reprodutivo do rebanho foram baixas e não significativas (P>0,05). Em touros sexualmente maduros a integridade de membrana plasmática, acrossoma e fragmentação de cromatina nuclear não foram os distúrbios mais freqüentes da morfologia espermática.
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Efeito do plasma seminal na descongelação do sêmen ovino avaliado in vitro e na inseminação artificial cervical / Effect of seminal plasma on frozen-thawed ram semen evaluated In vitro and on cervical artifical inseminationSilva, Thiago Antônio de Souza Nascimento 04 July 2007 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2007. / Submitted by Fabrícia da Silva Costa Feitosa (fabriciascf@gmail.com) on 2010-01-14T20:26:08Z
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Previous issue date: 2007-07-04 / Este trabalho teve por objetivo avaliar in vitro e pela inseminação artificial (IA) em ovelhas com estro sincronizado o efeito da adição do plasma seminal (PS) na descongelação do sêmen ovino criopreservado em “pellets”. Foram realizados dois trabalhos. No primeiro foi avaliado in vitro a adição do PS. Não houve diferença significativa para o parâmetro de motilidade entre os tratamentos. Mas com relação à integridade do acrossoma a adição do PS proporcionou uma média superior de espermatozóides vivos com acrossoma integro (P<0,05) em relação ao tratamento com PBS nas 2 e 6 horas de incubação. No segundo trabalho foi realizado a avaliação in vitro e in vivo com IA em ovelhas com estro sincronizado. Os resultados in vitro confirmaram os resultados encontrados no primeiro trabalho. As IA foram realizadas em tempo fixo a partir das 50 horas após a retirada dos pessários vaginais, pelo método transcervical sem tração. Conforme o grau de penetração do aplicador de sêmen no canal cervical das ovelhas considerou-se três graus de profundidade caracterizados como: grau 1: superficial; grau 2: intermediário; grau 3: profundo. Como grupo controle 61 ovelhas foram inseminadas com sêmen fresco/diluído com solução salina fosfatada (PBS). Das 100 restantes, metade foi inseminada com sêmen congelado/descongelado com PBS e a outra metade com sêmen congelado/descongelado com PS. Após 45 dias da IA, foi realizado o diagnóstico de prenhez, por ultra-sonografia. As ovelhas inseminadas apresentaram os percentuais de prenhez de 60,0% (50/30), 74,0% (50/38) e 67,2% (61/41), respectivamente, para sêmen congelado/descongelado, com PBS, com PS e fresco/diluído. Os índices de prenhez não diferiram entre os tratamentos (PBS/PS/FRESCO) nos graus 1 e 2 de penetração. No entanto, as percentagens de prenhez diagnosticadas nas ovelhas inseminadas com sêmen fresco (95,6%) e com sêmen congelado com PS (94,1%) foram superiores as obtidas com sêmen congelado com PBS (60,0%; P<0,05) no grau 3 de penetração. Tendo como base os resultados obtidos, conclui-se que, o sêmen congelado utilizado via cervical, adicionado de PS obteve índices de gestação satisfatórios no mesmo nível que o sêmen fresco, é capaz de proporcionar os mesmos índices obtidos com o sêmen fresco e realizar um efeito protetor nos espermatozóides contra a reação precoce do acrossoma. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of the present experiment was to evaluate in vitro and artificial insemination (AI) in sheep with synchronized estrus the effect of addition of seminal plasma in ram semen frozen-thawed criopreserved at pellets. Two works were made. On the first was evaluate the addition of seminal plasma in vitro. To motility there wasn’t difference among treatments. But about the acrossome intact the addition of seminal plasma had a higher average of spermatozoa alives with acrossome intact (P<0,05) than PBS treatment at 2 and 6 hours of incubation period. On the second experiment was evaluate in vitro and in vivo with artificial insemination in sheep with synchronized estrus. The results in vitro confirmed the results found in the first experiment. The AI was in fixed time, at 50 hours after removing the vaginal device, by the method trans-cervical without traction. The penetration degree of the semen applicator in the ewe cervical channel was classified as following: degree 1: superficial; degree 2: intermediate; degree 3: deep. In control group 61 ewes were inseminated with fresh semen diluted with PBS and the other 100, half ewes were inseminated with frozen-thawed semen with PBS, and the other half ewes was inseminated with frozen-thawed semen with seminal plasma. The diagnosis of pregnancy was performed 45 days after AI with ultrasound. The pregnancy rate was 60.0% (50/30), 74.0% (50/37) and 67.2% (61/41), respectively for frozen semen and thawed without seminal plasma, with seminal plasma and fresh semen. The pregnancy rate did not differ among treatments in degrees 1 and 2. However, the pregnancy in ewes inseminated with fresh semen (95.6%) and with frozen-thawed semen with seminal plasma (94.1%) were higher than with frozen-thawed semen without plasma (60.0%; P<0.05) in degree 3. Based on results, the conclusion is, frozen semen additioned of seminal plasma used at cervical way had satisfactory pregnancy rates similar that fresh semen and had a protector effect on spermatozoa against the premature acrossome reaction.
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Avaliação de espermatozoides ovinos criopreservados em Tris-gema acrescido de antioxidantes enzimáticos e não-enzimáticosSILVA, Sildivane Valcácia 30 April 2010 (has links)
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Previous issue date: 2010-04-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The objective of this work was to evaluate the effect of addition of antioxidants superoxide dismutase (SOD), glutathione (GSH), catalase (CAT), vitamin E (Trolox), and the association between CAT and SOD to Tris egg-yolk ram semen freezing extender. We used five Santa Inês breed rams, with history of fertility, and the ejaculates obtained by artificial vagina. The pool of semen samples were diluted in Tris egg-yolk plus glycerol 5% supplemented with antioxidants, according to the experiments and experimental groups: Exp 1 (G1= control group, G2= 25 U/mL SOD; G3= 50 U/mL SOD; G4= 100 U/mL SOD; G5= 2 mM GSH; G6= 5 mM GSH and G7= 7 mM GSH) and Exp 2 (G1= control group, G2= 30 μM Trolox, G3= 60 μM Trolox, G4= 120 μM Trolox, G5= 25 U/mL CAT, G6= 50 U/mL CAT; G7= 100 U/mL CAT, G8= 100 U/mL SOD + 25 U/mL CAT), at concentration of 240 x 106 spermatozoa/mL. Semen was stored in straws (0.25 mL), frozen using an automated system and stored in liquid nitrogen (- 196 °C). After thawing (37 ºC/30 seconds), samples were analyzed for plasma membrane integrity (iMP), acrosome (IAC) and mitochondrial membrane potential (MMP) with fluorescent probes, kinematics sperm by CASA, and ultrastructure spermatozoa by transmission electron microscopy (TEM). In Exp 1, evaluation was performed in vivo, with the semen used in embryo transfer program. In the Exp 1, significant differences (P<0.05) were observed among groups for total motility (MT), straightness (STR) and oscillation index (WOB) and the GSH 7 mM was lower in MT and higher in STR, and GSH 5 e 7 mM groups were greater in WOB when compared to control, SOD 25 and 100 U/mL. Ultrastructure study showed acrosome better (P<0.05) preserved after freezing in SOD (50 and 100 U/mL) and GSH (5 and 7 mM), whereas mitochondria from control group together with 7 mM GSH suffered further damage. The plasma membrane remained preserved after freezing, regardless of group. For in vivo fertilization, SOD group gave better results than GSH (P>0.05). For Exp 2, CAT 100 U/mL showed a lower percentage (P<0.05) of spermatozoa with intact acrosome. Significant differences (P<0.05) were observed among groups on the kinematics sperm (progressive motility, linearity, straightness, oscillation index, straight line velocity and velocity average path), and were higher for Trolox (30 and 60 μM) and lower for CAT (50 and 100 U/mL). On ultrastructural evaluation, CAT (50 and 100 U/mL) had lower acrosome preservation (P<0.05) and CAT 25 U/mL was higher (P<0.05) than CAT 100 U/ml for the preservation of plasma membrane. Thus, we conclude that the addition of GSH at a concentration of 7mm and 50 CAT and 100 U/mL do not preserve the structural integrity of spermatozoa after cryopreservation; the addition of SOD 100 U/mL, Trolox 60 and 120 mM, and association of CAT 25 U/mL + SOD 100 U/mL provide better preservation of sperm membranes of ram after freezing. / Objetivou-se com este trabalho avaliar o efeito da adição dos antioxidantes superóxido dismutase (SOD), glutationa reduzida (GSH), catalase (CAT), vitamina E (Trolox), e a associação entre CAT e SOD ao diluente Tris-gema de congelação do sêmen ovino. Foram utilizados cinco reprodutores ovinos da raça Santa Inês, com histórico de fertilidade, sendo os ejaculados obtidos pelo método de vagina artificial. Os ejaculados foram avaliados e submetidos à formação do pool, diluído em Tris-gema e glicerol 5%, acrescido de antioxidantes de acordo com o experimento e o grupo experimental: Exp. 1 (G1= Controle; G2= 25 U/mL de SOD; G3= 50 U/mL de SOD; G4= 100 U/mL de SOD; G5= 2 mM de GSH; G6= 5 mM de GSH; G7= 7 mM de GSH) e Exp. 2 (G1= Controle; G2= 30 μM de Trolox; G3= 60 μM de Trolox; G4= 120 μM de Trolox; G5= 25 U/mL de CAT; G6= 50 U/mL de CAT; G7= 100 U/mL de CAT; G8= 25 U/mL de CAT + 100 U/mL de SOD), na concentração de 240 x 106 espermatozoides/mL. O sêmen foi acondicionado em palhetas (0,25 mL), congelado utilizando sistema automatizado e armazenado em nitrogênio líquido (- 196 ºC). Após descongelação (37 oC/30 segundos), as amostras foram submetidas à análise de integridade da membrana plasmática (iMP), acrossoma (iAc) e potencial de membrana mitocondrial (PMM) com sondas fluorescentes; cinética espermática, pelo CASA; e ultraestrutura dos espermatozoides, por microscopia eletrônica de transmissão. No Exp. 1, foi realizada avaliação in vivo, com o sêmen utilizado em programa de transferência de embriões. Diferenças significativas (P<0,05) foram observadas entre grupos para motilidade total (MT), retilinearidade (STR) e índice de oscilação (WOB), sendo o GSH 7mM inferior (P<0,05) na MT e superior na STR, e os grupos GSH 5 e 7 mM commaior (P<0,05) WOB em comparação ao controle, SOD 25 e 100 U/mL. Na análise ultraestrutural, evidenciou-se que o acrossoma foi melhor preservado (P<0,05), pós-congelação, nos grupos SOD 50 e 100 U/mL e GSH 2 e 5 mM, enquanto que o acrossoma e as mitocôndrias do grupo Controle, juntamente com o GSH 7 mM, sofreram maiores danos (P<0,05). Para a fertilização in vivo, o grupo SOD conferiu resultados numericamente superiores aos grupos controle e GSH. Para o Exp. 2, o CAT 100 U/mL apresentou menor porcentual (P<0,05) de espermatozoides com acrossoma íntegros. Diferenças significativas (P<0,05) foram observadas entre grupos na cinética espermática (motilidade progressiva, linearidade, retilinearidade, índice de oscilação, velocidade em linha reta e velocidade média do percurso), sendo superiores para os grupos Trolox 30 e 60 μM e inferiores para os grupos CAT 50 e 100 U/mL. Na avaliação ultraestrutural, os grupos CAT 50 e 100 U/mL apresentaram menor preservação (P<0,05) do acrossoma, enquanto o CAT 25 U/mL foi superior (P<0,05) ao CAT 100 U/mL para a preservação da membrana plasmática e o SOD 25 U/mL foi inferior (P<0,05) aos demais grupos na preservação da mitocôndria. Assim, conclui-se que a adição de GSH na concentração de 7mM e CAT 50 e 100 U/mL não preservam a integridade estrutural de espermatozoides ovinos pós-criopreservação; a adição de SOD 100 U/mL, Trolox 60 e 120 μM, e a associação de CAT 25 U/mL + SOD 100 U/mL proporcionam maior preservação das membranas de espermatozóides congelados de ovinos.
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Otimização do sistema de produção in vitro de embriões suínos / Optimization of the porcine in vitro embryo production systemKlein, Norton 19 July 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013-07-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The in vitro production of pig embryos progressed significantly in the
last decade. However, the embryo growing rates remain variable and
with low embryonic quality. The chromosomal abnormalities as a result
of high polyspermy rates and the inefficient culture systems are pointed
as the main problems. Thus, the aim of this study was to improve the
rates of monospermy, and also the hatching rates of in vitro produced
porcine embryos. The first study investigated decreasing sperm
concentrations combined with different incubation periods during in
vitro fertilization (IVF). A total of 829 oocytes were matured and
allocated in two experiments. In the first, oocytes were IVF using
different sperm concentrations (62.5, 125, 187.5 or 250 x 103 sperm /
mL). In the second experiment the oocytes were IVF using 62.5 x 103
sperm / mL pointed in experiment 1, for 2, 3 or 4 hours incubation time.
Then the zygotes were cultured during twelve hours to evaluate the
fertilization parameters, or during seven days to evaluate embryonic
development. A third experiment was performed to evaluate the sperm
acrosome reaction according to the incubation period. The higher sperm
concentration reduced embryo production from 33.9% to 13.4%. The
reduction of the incubation period from 4 to 3 or 2 hours significantly
increased the rates of cleavage (42.1 to 71.6% and 73.3%), embryo
development (14 to 34.7 and 38.9%) and hatching (25 to 66.7 and
65.7%. Increased sperm concentration and incubation period
significantly altered the parameters related to fertilization, substantially
impairing the monospermic embryos production. The number of sperm
with reacted acrosome increased significantly as incubation time was
increased. In the second study we evaluated the assisted hatching of
porcine embryos IVP by zona pellucid incision or treatment with
pronase. Oocytes were matured and in vitro fertilized with 62.5 x 103
spermatozoa / mL concentration for three hours. The zygotes were
cultured for seven days, and then embryonic development and hatching
rates evaluated. It was also determined the cell density and cell
apoptosis rates of hatched embryos. Both the manual incision or pronase
digestion were effective in weakening the ZP of embryos with high cell
density. However, it was observed a reduction in the survival rates, and
higher apoptosis rates in hatched embryos treated with Pronase. With
basis on the data we concluded that a reduction in sperm concentration
and incubation period decreases the incidence of polyspermy and
improves the embryo development rates. This is probably due to
reduction of capacitated /reacted sperm available for fertilization. Also,
the weakening of the zona pellucid by incision improves significantly
the number and quality of embryos hatched at the end of embryo
culture / A produção in vitro de embriões suínos avançou significativamente na
última década. Entretanto, os índices de desenvolvimento embrionário
continuam inconstantes e a qualidade dos embriões extremamente baixa.
A incidência de anormalidades cromossômicas decorrentes das altas
taxas de polispermia e a ineficiência dos sistemas de cultivo são
apontados como os principais impasses. Desta forma, este estudo buscou
melhorar os índices de monospermia, e as taxas de eclosão dos embriões
suínos produzidos in vitro. O primeiro estudo investigou a utilização de
diferentes concentrações espermáticas e períodos de incubação dos
gametas durante a fecundação in vitro (FIV). Para tanto, um total de 829
oócitos foram maturados e destinados à dois experimentos. No primeiro,
os oócitos foram FIV utilizando diferentes concentrações espermáticas
(62.5, 125, 187.5 ou 250 x 103 espermatozoides/mL). No segundo, os
oócitos foram FIV utilizando 62.5 x 103 espermatozoides/mL durante
duas, três ou quatro horas. Após a FIV os zigotos foram cultivados por
doze horas para análise dos parâmetros da fertilização ou por sete dias
para o estudo do desenvolvimento embrionário. Um terceiro
experimento avaliou o número de espermatozóides com acrossoma
reagido de acordo com o período de incubação. A máxima concentração
de espermatozóides reduziu a produção embrionária (de 33.9% para
13.4%). Já a redução do período de incubação de quatro para três ou
duas horas, aumentou significativamente as taxas de clivagem (42.1%
para 71.6 e 73.3%), de desenvolvimento embrionário (14% para 34.7 e
38.9%) e de eclosão (25% para 66.7 e 65.7%). Tanto o aumento da
concentração espermática, como o aumento período de incubação
alteraram significativamente a maioria dos parâmetros relacionados a
fecundação, prejudicando substancialmente a produção de embriões
monospérmicos. O número de espermatozoides com acrossoma reagido
aumentou significativamente com o pronlongamento da fecundação. No
segundo estudo, investigou-se a indução da eclosão assistida de
embriões suínos PIV através da incisão da zona pelúcida ou pelo
tratamento com pronase. Os oócitos foram maturados e fecundados in
vitro com uma concentração de 62.5 x 103 espermatozóides/mL por três
horas. Os zigotos foram cultivados durante sete dias, então, avaliados
quanto ao desenvolvimento embrionário e a incidência de eclosão.
Determinamos também a densidade celular e os índices de apoptose
celular dos embriões eclodidos. Tanto a incisão da zona como a digestão
com pronase foram efetivos na fragilização da ZP dos embriões com alta
densidade celular. Todavia, constatou-se uma redução da sobrevivência
e aumento do índice de apoptose celular dos embriões eclodidos pelo
tratamento com pronase. Com base nos dados obtidos concluímos que a
redução da concentração de espermatozóides e do período de incubação
diminuem a incidência de polispermia e melhoram o desenvolvimento
embrionário. Isto é provavelmente devido a redução da disponibilidade
de espermatozóides capacitados/reagidos para a fecundação. Da mesma
forma, a fragilização da zona pelúcida através da incisão, melhora
significativamente o número e a qualidade dos embriões eclodidos ao
final do cultivo embrionário
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Avaliação da integridade do acrossoma, membrana citoplasmática, potencial mitocondrial, cromática e produção de embriões in vitro de sêmen bovino com altos índices de gota citoplasmática proximalCarreira, Janaina Torres [UNESP] 28 February 2008 (has links) (PDF)
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carreira_jt_me_jabo.pdf: 1115702 bytes, checksum: f2dddb9edf2109b5192f0e4f605b5b97 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da gota citoplasmática proximal (GCP) no sêmen de bovinos quanto à integridade do DNA, das membranas citoplasmática, acrossomal, no potencial mitocondrial e verificar a taxa de produção de embriões in vitro. Três amostras descongeladas de cinco (Controle: espermiograma normal), e oito touros Bos indicus (Gota: GCP ≥15%) foram avaliadas. Foram realizados os seguintes testes: motilidade e vigor pós-descongelação, concentração, morfologia espermática, teste de termo-resistência lento (TTL), integridade da membrana acrossomal, plasmática e potencial mitocondrial utilizando sondas fluorescentes (PI, FITC-PSA e JC-1) e integridade da cromatina pelo método de coloração com laranja de acridina. Dois touros com índices elevados de GCP e três animais controle foram selecionados para fertilização in vitro (FIV). As análises estatísticas foram efetuadas empregando-se o programa Statistical Analysis System. O nível de significância foi de 5%. Os resultados obtidos demonstraram que altos índices de GCP não afetaram a motilidade e o vigor, antes e após o TTL, assim como não interferiram na porcentagem de acrossomas intactos. Os resultados destas avaliações mostraram que a alta incidência de GCP afetou a integridade da membrana acrossomal e plasmática bem como a presença de potencial mitocondrial. No entanto, a alta incidência de GCP não promoveu aumento na porcentagem de injúrias à cromatina após descongelação, mas os resultados sugerem que podem ser mais sensíveis à desnaturação quando incubados por três horas. No experimento II, os índices de produção de embriões in vitro podem ter sido afetados pela interação da alteração morfológica e o efeito individual do touro. / The objective of this study was to evaluate the effects of the proximal cytoplasmic droplets (PCD) in bovine semen, on the integrity of DNA, cytoplasmic membrane, acrossome, mitochondrial function and the rate of in vitro embryo production. Three batches of five (control group G1: normal sperm parameters) and eight Bos indicus bulls (G2: PCD ≥15%) were analysed. The following tests were carried out: post thaw motility and, vigor, concentration, sperm morphology, slow thermo-resistance (TRT), membrane integrity, acrossome status, mitochondrial function through fluorescent probes (FITC-PSA, PI and JC-1) and integrity of chromatin was accessed by acridine orange stain. Two bulls with high rates of PCD and three animals (control group) were selected for in vitro fertilization (IVF). Statistical analyses were performed using the Statistical Analysis System. The significance level was 5%. The results showed that high rates of PCD did not affect motility and vigor, before and after the TRT, and did not affect the percentage of intact acrossome. The results showed that the high incidence of PCD affected membrane integrity, acrossome status and mitochondrial function when compared to the G1 group due. However, the high incidence of PCD did not affect the percentage of chromatin injury after thawing, but results suggest that spermatozoa may be more susceptible to damage when incubated for three hours. In experiment II the embryo production rate may have been affected by the interaction of the morphology traits and the bull effect.
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