Les aquaporines (AQPs) sont de petites protéines membranaires permettant le passage facilité de l'eau, du glycérol et de certains solutés à travers les membranes biologiques. Elles jouent d'importants rôles de transport transmembranaires ou transcellulaires dans diverses cellules telles que les cellules rénales, mais aussi dans les kératinocytes de l'épiderme. L'épiderme est un épithélium pluristratifié en constant renouvellement. Le calcium extracellulaire joue un rôle important dans le mécanisme de différenciation des kératinocytes.Dans ce travail, nous avons montré que la différenciation induite par le calcium de kératinocytes humains s'accompagne de l'adressage de l'aquaporine-3 (AQP3) du réticulum endoplasmique, vers les membranes plasmiques. Pour étudier la cinétique et les bases moléculaires de cette régulation, notre objectif était de produire des clones stables d'une lignée de kératinocytes humains en culture (HaCat) exprimant une AQP3 fluorescente. Malgré plusieurs tentatives, je n'ai pas pu obtenir ces clones stables. J'ai alors choisi un autre modèle de cellules épithéliales en culture; les cellules MDCK. Nous avons produit deux lignées stables de MDCK exprimant des aquaporines fluorescentes: l'AQP3-GFP et l'AQP2-mCherry. De manière intéressante, dans les cellules MDCK, l'AQP3 -GFP reproduit la régulation de son adressage par le calcium observée dans les kératinocytes humains; dans des cellules MDCK cultivées en présence de 0,15mM de Ca2+, l'AQP3-GFP est localisée dans le réticulum endoplasmique, tandis qu'à 1,5mM de Ca2+ extracellulaire, celle-ci est localisée aux membranes plasmiques. Dans les mêmes conditions, l'AQP2-mCherry conserve une localisation intracellulaire. Par des expériences de " calcium switch ", nous avons étudié la cinétique du trafic cellulaire de l'AQP3 et montré que l'adressage de l'AQP3 à la membrane plasmique en réponse au calcium est lent (6h minimum) et semble dépendant non seulement de la différenciation cellulaire, mais aussi de l'établissement de la polarité cellulaire. A l'aide d'inhibiteurs de la PLC et de la PKC, nous avons montré l'implication de cette voie de signalisation, qui dépend du calcium, dans le trafic de l'AQP3. De plus, l'adressage membranaire de l'AQP3 est dépendant du cytosquelette d'actine.En conclusion, nous montrons pour la première fois une régulation du trafic intracellulaire d'une aquaporine par le calcium au cours de la différenciation et de l'établissement de la polarité cellulaire de cellules épithéliales. Cette régulation permet probablement l'hydratation de l'épiderme humain, sans remettre en cause la barrière de perméabilité que constitue la peau.

La protéine RhBG humaine est un membre de la famille des protéines Rh (Rhésus), premiers canaux à gaz caractérisés chez les mammifères et par conséquent, de la superfamille Amt/Mep/Rh des transporteurs d'ammonium. Elle facilite le transport de la forme neutre de l'ammonium (NH3) et est ancrée à la membrane plasmique basolatérale de cellules épithéliales rénales, via l'ankyrine G, protéine adaptatrice du squelette membranaire dépendant de la spectrine. Nous avons montré que la mutation du motif d'ancrage à l'ankyrine G, localisé dans l'extrémité C-terminale intracytoplasmique de RhBG, retarde l'adressage, diminue la stabilité à la surface et abolit la fonction de transport de NH3 de la protéine RhBG dans les cellules épithéliales HEK293. Nous avons également montré que la tyrosine Y429, qui appartient au signal d'adressage basolatéral YED de RhBG, est phosphorylée in vitro par les kinases Src et Syk purifiées. D'autre part, le traitement de cellules HEK293 par le pervanadate, un inhibiteur de phosphatases sur phosphotyrosine (donc un activateur indirect des tyrosine kinases) diminue fortement l'activité de transport de la protéine native mais pas celle d'un mutant Y429A (bloquant sa phosphorylation). Ce résultat montre d'une part que Y429 est le seul résidu tyrosine de RhBG impliqué dans la régulation du transport de NH3, via une phosphorylation, d'autre part que la protéine RhBG est phosphorylée ex vivo sur cette tyrosine. Des mutations Y429D et Y429E, mimant une phosphorylation constitutive, abolissent le transport de NH3 et favorisent la solubilisation du RhBG membranaire. À l'inverse, des mutants Y429A et Y429F non phosphorylés et non phosphorylables se comportent comme la protéine RhBG sauvage. En revanche, des études en microscopie confocale montrent que seules les mutations Y429A et Y429F entraînent une dépolarisation de l'expression de RhBG dans des cellules MDCK polarisées, les mutants Y429D et Y429E étant normalement localisés dans le domaine basolatéral des cellules. L'ensemble de ces résultats démontre que l'adressage, l'ancrage au squelette sous-membranaire et la fonction de transport d'ammonium de RhBG sont régulés à la fois par la phosphorylation et la liaison au squelette membranaire de son domaine C-terminal cytoplasmique et nous a conduit à proposer un modèle dans lequel la phosphorylation de la tyrosine Y429 faisant partie du motif YED, serait nécessaire à l'adressage de RhBG vers la membrane basolatérale de cellules épithéliales polarisées, alors que la déphosphorylation de cette tyrosine permettrait l'ancrage de la protéine au squelette membranaire, via l'ankyrine G, et l'activation du canal à NH3 par un changement conformationnel potentiel de l'extrémité C-terminale.

La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement des petites tumeurs localisées, reposant sur l'action conjuguée d'un photosensibilisateur (PS), de la lumière et de l'oxygène. Dans le cadre d'un nouveau mode de PDT, la VTP (vascular targeted photodynamic therapy), notre stratégie a consisté à favoriser l'effet anti-vasculaire du traitement par ciblage de la néo-vascularisation tumorale. Pour cela, nous avons étudié in vitro et in vivo un PS de type chlorine (TPC) couplé, via le bras espaceur (Ahx), à un heptapeptide (ATWLPPR) spécifique d'un corécepteur du VEGF, la neuropiline-1 (NRP-1). Une étude comparative de la TPC versus le PS conjugué (TPC-Ahx-ATWLPPR), a permis de mettre en évidence in vitro, grâce à une technique d'ARN interférence visant à éteindre l'expression de NRP-1, une incorporation cellulaire récepteur dépendante du conjugué. In vivo, l'accumulation préférentielle de la TPC-Ahx-ATWLPPR au niveau de l'endothélium vasculaire de la tumeur ainsi que son effet anti-vasculaire après PDT ont été mises en évidence. Une étude de stabilité in vitro et in vivo du conjugué a été réalisée. In vivo, la séquence peptidique est dégradée 4 h après injection par voie intra-veineuse. Des études de pharmacocinétique et de biodistribution tissulaire de la TPC-Ahx-ATWLPPR et de son principal produit de dégradation, TPC-Ahx-A ont été réalisées chez la souris nude xénogreffée. La dégradation de la partie peptidique est majoritaire dans les organes du système réticulo-endothélial où l'accumulation du conjugué est la plus importante. Dans le but d'augmenter la stabilité in vivo du peptide adresseur, de nouveaux peptides ont été synthétisés, puis couplés à la TPC et testés. Le pseudopeptide Aψ[CH2NH]TWLPPR est prometteur car il reste affin vis-à-vis de NRP-1 et après couplage au PS, il ne subit aucune dégradation dans le 8plasma in vivo 4 h après injection par voie intra-veineuse.

Cette thèse porte sur la conception et la réalisation d'un microsystème d'éjection matriciel monolithique pour la fonctionnalisation in-situ des puces à ADN. L'objectif est de développer un système flexible, peu onéreux et performant, permettant le dépôt localisé de micro-gouttes de réactifs (nucléotides en solution dans l'acétonitrile) afin de synthétiser les séquences d'oligonucléotides in-situ. Les avantages d'un tel système sont le faible coût de l'équipement, une grande fléxibilité dans le choix des séquences synthétisées et la possibilité de réaliser des puces à forte densité d'unités d'hybridation. L'éjection par actionnement thermique a été retenue. Le principe s'inspire du jet d'encre thermique mais l'originalité vient du fait que les éjecteurs sont disposés de façons matricielle avec une très grande densité et sont actionnables individuellement. La structure retenue intègre une résistance chauffante sur une membrane diélectrique et une buse d'éjection réalisée en résine photosensible Su8. Ces caractéristiques permettent d'atteindre localement des températures suffisamment élevées pour provoquer une ébullition localisée autour de la buse déjection. Un procédé technologique original a été mis au point pour intégrer le dispositif d'adressage à cette résistance. Il s'agit de diodes réalisées dans la résistance en polysilicium. Ces diodes sont obtenues par diffusion et implantation de zones N et P. La tension de seuil et le courant de fuite de ces diodes ont été paramétrés en fonction des dopages mis en Suvre de façon à ce que seul le micro-éjecteur actionné ne chauffe. Les matrices réalisées ont été caractériésées électriquement et thermiquement ; il a été ainsi montré que l'adressage est opérationnel, la puissance thermique offerte est suffisante pour l'éjection. Il a été montré que des gouttelettes de 0,1pl à 3nl pouvaient être éjectées lorsque la tension d'alimentation varie entre 25V et 5V et l'impulsion électrique d'alimentation entre 50µs et 50ms.

Arias est un système de mémoire partagée répartie (MPR) réalisé dans le cadre du projet SIRAC, qui étudie les supports logiciels pour les applications distribuées. Une MPR facilite grandement la programmation de telles applications. Nous retraçons l'évolution des systèmes distributés qui ont abouti à cette idée, et caractérisons les diverses particularités de quelques projets antérieurs. Nous édictons nos objectifs propres et dégageons les spécifications qui sont souhaitables pour notre projet. Partant de là, et après avoir esquissé l'architecture générale d'Arias, nous nous concentrons sur les problèmes liés à la répartition de la mémoire. En particulier, l'allocation et la localisation de la mémoire dans une MPR à grand espace d'adresses posent des difficultés de réalisation qui ont des conséquences importantes dans la conception de l'interface logicielle avec l'application et le système d'exploitation sous-jacent. L'analyse de ces difficultés nous mène au module d'allocation et de localisation que nous décrivons. Une fois son implémentation décrite dans ses détails techniques, nous en explicitons les paramètres d'ajustement et soulignons leur impact à travers des mesures et des simulations. Nous montrons plusieurs configurations envisageables, dont certaines sont spécialement adaptées à certains types d'utilisation. Pour finir, nous concluons sur les leçons apprises de ce travail, tant du point de vue de ce qui a été réalisé que sur les travaux futurs et les perspectives générales des MPR.

Dans ce document, nous avons étudié les nouvelles possibilités de routage et d'adressage dans les réseaux sans-fil multisauts spontanés de grande taille (WMNs). Les WMNs promettent à l'avenir un changement profond de l'architecture d'Internet, mais beaucoup de problèmes restent à résoudre avant leur déploiement. Le routage, par exemple, est simple dans de petits réseaux statiques, mais les réseaux sans fil sont en pratique dynamiques : des liens peuvent apparaître et disparaître, des noeuds rejoignent ou quittent le réseau. Ainsi la taille du réseau peut s'agrandir, ce qui implique des problèmes de grandes tables de routage O (N). Les nouveaux types de réseaux spontanées amplifient cette tendance, ils comprennent des milliers de noeuds qui agissent comme des routeurs. Plusieurs expérimentations mettent en évidence des problèmes de passage à l'échelle dans les protocoles de routage topologique comme AODV, DSDV, DSR ou OLSR. Les algorithmes classiques de routage doivent être remplacés par des technologies appropriées qui garantissent une bonne évolutivité et offrent une connectivité robuste. Nous avons pris en considération les algorithmes de routage géographiques, car ils ne nécessitent pas de topologie complète et globale du réseau pour calculer les itinéraires et ils passent donc mieux à l'échelle que les algorithmes topologiques. Néanmoins, il reste de nombreux problèmes que nous devrons résoudre : le plus important étant que les algorithmes géographiques sont peu efficaces. Elle peut renvoyer des chemins beaucoup plus longs que ne le feraient les algorithmes topologiques de routage. Afin de résoudre ce problème, nous avons étudié le comportement du routage géographique glouton simple, l'algorithme de base du routage géographique et nous avons spécifié deux protocoles de routage Binary Waypoint Routing et Scalable Waypoint Routing. Nos protocoles ne nécessitent pas de surcoût pour découvrir une topologie de réseau, mais ils font plutôt une analyse passive du trafic afin de découvrir des chemins efficaces. Nous recueillons une information géographique qui permet de transmettre les paquets. Notre méthode de redirection de paquets se conforme aux propriétés topologiques du réseau et améliore en conséquence la performance de routage géographique des algorithmes.

L'activité constitutive est une propriété pharmacologique que possèdent de nombreuxrécepteurs couplés aux protéines G. Cependant, son rôle biologique reste largement inconnu.Nous avons étudié les relations entre la pharmacologie et le trafic intracellulaire du récepteurcannabinoïque CB1, un récepteur abondamment exprimé dans le cerveau qui possède uneactivité constitutive avérée. Exprimé dans les cellules HEK-293, l'activité constitutive durécepteur CB1 provoque un cycle continu d'endocytose et de recyclage du récepteur entre lamembrane plasmique et les endosomes intracellulaires : à l'équilibre, le récepteur CB1 estmajoritairement présent dans les endosomes. Le cycle fait intervenir une endocytose par puitsrecouverts de clathrine et un trafic intracellulaire dépendant de Rab5 et de Rab4, mais pas deRab11. Dans les neurones d'hippocampe en culture, ce cycle d'endocytose/recyclage durécepteur CB1 est limité au compartiment somatodendritique, et le récepteur est stable à lasurface de l'axone. Ce cycle dépend de l'activité constitutive du récepteur CB1 etl'endocytose sélective du récepteur dirige l'établissement de l'expression axonale durécepteur CB1 à la surface du neurone.

La technologie a aujourd'hui atteint une maturité suffisante pour garantir la réalisation de MEMS avec un rendement de fabrication proche de 100%. Dés lors, on peut sereinement envisager l'intégration à haute densité de micro actionneurs ou de détecteurs pour de nouvelles fonctionnalités. Le travail présenté porte sur la mise en place de systèmes d'adressage matriciel pour des actionneurs thermiques, ainsi que sur la réalisation de source de chaleur à profil de température ajustable, voire configurable. Dans un premier temps, nous effectuerons un tour d'horizon des applications utilisant des micro sources de chaleur. Ceci afin de spécifier les caractéristiques propres à chaque type d'application. Une solution générique au problème d'adressage de source de chaleur sera alors proposée, basée sur des éléments à seuils symétriques en polysilicium. La mise au point de cette solution, impliquant un contrôle du dopage du polysilicium par implantation, sera détaillée. Ensuite nous présenterons les deux projets ayant permis de valider l'utilisation de ce système d'adressage : le projet MicroPyros visant à la réalisation d'une matrice de micro actionneurs pyrotechniques, ainsi qu'un projet visant la réalisation d'une matrice de micro éjecteurs. Pour chacun des deux cas, des études ont été menées, conduisant à des réalisations au sein de la centrale technologique du LAAS CNRS. Les différentes matrices réalisées ont ensuite été testées et validées. Enfin, nous présenterons les résultats du dernier run technologique, visant à permettre la comparaison des réalisations suspendues, sur membranes et sur silicium, ainsi qu'à explorer de nouvelles fonctionnalités basées sur les éléments à seuils symétriques en polysilicium.

Le système Tat (pour Twin Arginine Translocation) exporte des protéines repliées depuis le cytoplasme vers le périplasme des bactéries. L'adressage des protéines à exporter au système Tat repose sur une séquence signal spécifique amino terminale clivée après exportation. Chez le phytopathogène Dickeya dadantii, l'homologue de pectine lyase PnlH possède une séquence signal Tat qui assure son adressage au système Tat mais qui n'est pas clivée après exportation et ancre la protéine dans la membrane externe. Chez les protéobactéries, la majorité des protéines de membrane externe sont soit des lipoprotéines soit des protéines intégrales de membrane en tonneau β. L'adressage de ces protéines à la membrane externe repose sur des voies spécifiques du type de protéine : la voie Lol pour les lipoprotéines et la combinaison des chaperons périplasmiques SurA, Skp et DegP et du complexe de membrane externe Bam (β barrel assembly machinery) pour les protéines en tonneau β. Au cours de ce travail, l'étude de l'adressage de PnlH à la membrane externe a montré que SurA se liait à la séquence signal hydrophobe de PnlH pour la protéger de l'environnement hydrophile au cours de son transit dans le périplasme. La séquence signal de PnlH (41 acides aminés) porte l'intégralité de l'information nécessaire à son adressage à la membrane externe. La nature de l'information adressant les protéines au système Tat est bien connue et dans ce travail nous nous sommes efforcés d'identifier les informations requises pour les deux dernières étapes de l'adressage de PnlH à la membrane externe : la traversée du périplasme et l'insertion dans la membrane externe. La délétion d'une région conservée comprise entre les résidus 28 et 41 de la séquence signal de PnlH affecte l'adressage de cette dernière à la membrane externe. Des substitutions des acides aminés conservés de cette région ne semblent pas affecter l'adressage de PnlH, indiquant que l'information nécessaire à l'adressage de PnlH à la membrane externe après exportation ne réside pas dans la séquence en acides aminés de la séquence signal de PnlH. En revanche, nos données suggèrent que la présence d'une hélice α hydrophobe dans la séquence signal de PnlH est importante pour son adressage à la membrane externe. Cette observation est particulièrement intéressante puisqu'une telle structure est généralement considérée comme une caractéristique des protéines de membrane interne.

Depuis quelques années, le récepteur opioïdergique delta (DOPR) apparaît comme une alternative intéressante dans le traitement de la douleur puisque son utilisation est accompagnée de moins d'effets secondaires qu'avec les traitements opioïdergiques actuels, ciblant principalement le récepteur opioïdergique mu (MOPR). Par contre, les agonistes sélectifs pour DOPR n'ont que très peu d'effets chez les animaux sains en raison d'une faible expression membranaire du récepteur. Depuis quelques années, un nombre croissant d'études se sont intéressées à l'adressage de DOPR et les résultats montrent que différentes situations peuvent moduler son expression à la membrane plasmique. Mes travaux de Thèse se sont donc intéressés à la régulation de DOPR dans un contexte de traitement de la douleur. En premier lieu, nous avons montré que les agonistes sélectifs pour DOPR soulagent l'hyperalgésie thermique induite par l'inflammation et que cet effet est conservé lors d'un traitement prolongé. À l'opposé, les effets antinociceptifs et moteurs de la deltorphine sont rapidement soumis à la tolérance. La dichotomie observée quant au développement de la tolérance pour les effets des agonistes DOPR suggère que des mécanismes de régulation différents s'opèrent lors de l'activation soutenue de DOPR. Dans un deuxième temps, nous avons montré que des agonistes sélectifs pour DOPR et MOPR, inhibent les comportements douloureux ainsi que l'activation neuronale (c'est-à-dire l'expression de c-fos) induits par la formaline ou la capasïcine. De plus, les agonistes DOPR et MOPR empêchent la relâche de substance P via l'inhibition des fibres afférentes primaires, ce qui confirme leur localisation sur les fibres peptidergiques. Par ailleurs, puisque les agonistes DOPR et MOPR ont des actions similaires sur la relâche de substance P, nos résultats proposent une colocalisation de DOPR et MOPR. L'ensemble de ces résultats contribuent à élargir nos connaissances sur les rôles et la régulation de DOPR dans le but d'en faire une cible thérapeutique pour le traitement de la douleur chronique.