Diese Arbeit hatte es zum Ziel, eine neue und effiziente Affinitätsplattform für die Aufreinigung und Isolierung von Proteinen basierend auf nicht‐porösen und stabilen Korund‐Partikeln zu entwickeln. Das Rohmaterial wurde kovalent mit Proteinbindern modifiziert, um so die Isolierung spezieller Target‐Proteine aus komplexen biologischen Proben zu realisieren. Für die erste Modifizierungsschicht auf der Korundoberfläche wurden verschiedene Phosphonsäuren und Silane untersucht. Anschließend wurde der etablierte bifunktionale Crosslinker Glutaraldehyd mit dem biokompatibleren verzweigten Polyglycerol (PG) verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass Polyglycerol eine hervorragende Alternative zu Glutaraldehyd darstellen kann. Für die angestrebte Anwendung als neues Tool für die Antikörperreinigung wurde humanes IgG mit Protein‐A‐funktionalisierten Korundpartikeln erfolgreich aus Humanplasma isoliert. Um das Anwendungsspektrum der neuen Korundmethode auszuweiten, wurde im zweiten Teil dieser Arbeit eine Affinitätsplattform für die Isolierung Polyhistidin‐getaggten Proteinen basierend auf Metallionen‐funktionalisiertem Korund entwickelt und angewendet. Hauptkriterien dieser Methodenentwicklung waren die schnelle, effiziente und ökonomische Aufreinigung rekombinanter Proteine aus bakteriellen Lysaten in einem säulenfreien Format. Als Modellsystem wurde Polyhistidin‐getaggtes Protein A/G (His6‐PAG) mit Rinderserumalbumin versetzt, was die Entwicklung eines optimierten Protokolls für die Isolierung rekombinanter Proteine ermöglichte. Im direkten Vergleich mit kommerziellen Ni‐NTA‐Agarose‐Beads zeigten die Korundpartikel höhere Proteinreinheiten. Abschließend konnte gezeigt werden, dass Zink eine ideale Alternative als Metallion darstellt, um etwaige Nachteile des Nickels in der Anwendung von Life‐Science‐Methoden zu umgehen und eine zukunftsträchtige Methode mit weiterem Potenzial zu realisieren. / This work aimed to develop and establish a novel efficient affinity platform for protein purification based on nonporous, stable, and easily available corundum powder. The material was functionalized covalently with protein binders to isolate and enrich specific proteins from complex biological matrices. Phosphonic acids and silanes were tested as the first modification layer. In the next step, the well‐known bifunctional crosslinker glutaraldehyde was compared with a more biocompatible, hyperbranched polyglycerol (PG). It could have been shown that oxidized polyglycerol is an excellent alternative to glutaraldehyde. Human IgG was purified with protein A functionalized corundum from crude human plasma for the initial purpose of antibody isolation. To broaden the application of functionalized corundum, a novel purification platform for the isolation of poly His‐tagged proteins based on metal‐ion‐functionalized corundum was established.The main goal of this approach was the efficient, economical, and fast purification of recombinant proteins in a column‐free format that can also easily be performed in moderately equipped laboratories. As a model system for method optimization, His‐tagged protein A/G (His6‐PAG), mixed with bovine serum albumin (BSA), was established leading to a purification protocol with minimal nonspecific binding by the variation of the imidazole content in the used binding and washing buffers. Corundum in direct comparison with standard Ni‐NTA agarose beads generated higher purities of isolated proteins. Finally, it was shown that zinc‐functionalized corundum is another efficient approach to circumvent potential negative effects of nickel use in life science applications.

Die Epithelien vielzelliger Organismen bilden eine funktionelle Grenzschicht, die für die Homöostase innerhalb und für den spezifischen Stoffaustausch zwischen den Kompartimenten verantwortlich ist. Der interzelluläre Spalt zwischen Epithelzellen wird durch tight junctions verschlossen, die eine selektive Permeabilitätsbarriere bilden. Da viele Krankheiten auf eine Dysfunktion der Barriere zurückzuführen sind, ist eine genaue Kenntnis der molekularen Zusammensetzung der tight junctions aus pharmakologischer Sicht von großem Interesse. In dieser Arbeit wurden Anreicherungsstrategien entwickelt, die eine Proteomanalyse der tight junction-Proteine erlauben. Der Fokus wurde dabei auf die Claudine und Tricellulin gelegt, die als transmembranale Proteine das molekulare Rückgrat der tight junctions bilden. Durch Affinitätsreinigung gelang erstmals eine Anreicherung verschiedener Claudine, die durch Massenspektrometrie identifiziert wurden. Die metabolische Markierung der Proteine mit stabilen Isotopen (SILAC) erlaubte die quantitative Diskriminierung von Proteinen, die unspezifisch an das Matrixmaterial banden. Von den potentiellen Interaktionspartnern der Claudine wurden Integrin-a3, SUMO-1 und Sphingosinkinase 2 ausgewählt, um deren Interaktion mit Claudinen weiter zu verifizieren. Es wurden keine Hinweise auf Wechselwirkungen zwischen Claudinen und Integrin-a3 sowie SUMO-1 gefunden, während die Interaktion von Claudinen mit Sphingosinkinase 2 weder bestätigt noch ausgeschlossen werden konnte. Ferner wurde eine Affinitätsreinigung durchgeführt, um Interaktionspartner von Tricellulin anzureichern. Durch die quantitative massenspektrometrische Analyse wurde ausschließlich Claudin-4 nicht aber Claudin-3 und 7 als potentieller, spezifischer Interaktionspartner von Tricellulin identifiziert. Es wurde aber gezeigt, dass die Kombination aus Affinitätsreinigung und quantitativer Massenspektrometrie einen wertvollen Beitrag zur Entschlüsselung von Protein-Komplexen leisten kann. / Epithelia function as specialized barriers that separate different compartments within multicellular organisms and regulate the specific exchange of substances between them. The intercellular space between adjacent epithelial cells is sealed by tight junctions forming a permeability barrier. Dysregulation of the barrier occurs in a variety of diseases. Hence, a deeper knowledge is required of the molecular composition of tight junctions, in particular with respect to pharmacological applications. In the present study, new enrichment strategies have been established that allow the proteomic analysis of tight junction proteins. Special emphasis was placed on claudins and tricellulin as these transmembrane proteins constitute the molecular backbone of the tight junctions. For the first time, using an affinity purification, the enrichment of several claudins was accomplished that were identified by mass spectrometry. The metabolic labeling of proteins with stable isotopes (SILAC) allowed the quantitative discrimination of proteins that bound unspecifically to the matrix. Integrin-a3, SUMO 1 and sphingosin kinase 2 were chosen for further verifications from the proteins considered to potentially interact with claudins. While there was no evidence for an association of claudins with integrin-a3 and SUMO-1, an interaction of claudins with sphingosin kinase 2 could be neither confirmed nor disproved. Furthermore, an affinity purification was performed in order to enrich interaction partners of tricellulin. Claudin-4 was identified as a specific, potential interaction partner of tricellulin by quantitative mass spectrometric analysis whereas claudin 3 and -7 were determined to be enriched unspecifically. The present study demonstrates that a combination of affinity purification and quantitative mass spectrometry can substantially contribute to the elucidation of protein complexes.

Das magenbesiedelnde Bakterium Helicobacter pylori gehört zu den am weitesten verbreiteten Infektionserregern. Obwohl die Infektion meist lebenslang symptomlos verläuft, kann H. pylori bei einigen Menschen schwere Erkrankungen bis hin zum Magenkarzinom verursachen. Ziele dieser Arbeit waren Magenkarzinom-assoziierte Antigene für einen diagnostischen Test zu finden und Methoden zur Untersuchung von Spotkompositionen mittels MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie zu entwickeln. Im ersten Teil der Promotion wurden die Antigenerkennungsmuster von 30 Magenadenokarzinom- mit 30 Ulkus duodeni-Patienten mithilfe hochauflösender zweidimensionaler Immunoblots von H. pylori Lysat verglichen. Diese fokussierte Gegenüberstellung eignet sich gut für diese Fragestellung, da beide Erkrankungen von diesem Bakterium verursacht werden, aber nur sehr selten gemeinsam auftreten. Durch univariate statistische Analysen wurden 14 Magenkarzinom korrelierte Spots gefunden (p / The stomach-colonizing bacterium Helicobacter pylori is one of the most widespread infectious agents. Although infection mostly persists unnoticed, it may cause serious diseases like gastric carcinoma. Aims of this project were to find gastric carcinoma-associated antigens for a diagnostic test and to develop methods to analyze spot compositions using MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. In the first part of this project antigen recognition patterns of 30 gastric carcinoma- and 30 duodenal ulcer- patients were compared using high-resolution two-dimensional immunoblots of H. pylori lysate. This focused comparison lent itself to this question because both diseases are caused by the bacterium but rarely occur conjointly. Utilizing univariate statistical tests 14 gastric carcinoma-associated spots were found (p