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Caractérisation fonctionnelle de JMJ24, une déméthylase d'histone de la famille JUMONJI, chez Arabidopsis thalianaAudonnet, Laure 26 February 2014 (has links) (PDF)
Cette dernière décennie a vu augmenter le nombre d'études portant sur la caractérisation des protéines JUMONJI (JMJ) et montrant leur rôle prépondérant dans la régulation des gènes et le développement des organismes. Ces protéines sont capables de déméthyler certains résidus des queues des histones et ont été organisées en groupes phylogénétiques en fonction de la conservation de leur domaine catalytique. Pour chaque clade entre un et trois substrats spécifiques ont pu être identifiés. De la sous famille KDM3, dont le résidu cible est H3K9, seul un membre, IBM1, a été caractérisé chez Arabidopsis. Cette étude montre que la mutation de JMJ24, un autre membre de ce groupe, entraine une augmentation de la taille des racines, cotylédons et organes floraux, suggérant un rôle dans le contrôle du développement à différents stades. De plus, l'analyse de l'expression tissulaire indique que JMJ24 est exprimé dans le phloème, en cohérence avec l'effet pléiotropique de sa mutation. Enfin, nos données suggèrent une interaction entre JMJ24 et d'autres protéines JMJ, telles JMJ14 et IBM1, mais aussi une interaction avec les protéines DCL, impliquées dans la régulation des gènes et des éléments transposables.
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Altérations mitochondriales et processus inflammatoire dans la déficience en acyl- Coenzyme A oxydase 1 peroxysomaleEl Hajj, Hammam 22 May 2012 (has links) (PDF)
L'acyl-CoA oxydase 1 (ACOX1) est l'enzyme qui catalyse la première étape de la voie classique de la β-oxydation peroxysomale. Cette voie catabolise exclusivement les acides gras à très longue chaîne (AGTLC). Chez l'homme, la déficience en ACOX1 est à l'origine de la pseudo adrénoleucodystrophie néonatale (P-NALD), une maladie neurodégénérative rare caractérisée par une accumulation des AGTLC dans le plasma et les tissus, une hépatomégalie, un retard du développement moteur et une démyélinisation de la matière blanche cérébrale. Chez la souris, l'extinction du gène Acox1 provoque une accumulation des AGTLC dans le plasma, un retard de croissance, une stéatose hépatique et le développement d'une hépatocarcinogenèse avec l'âge. Cependant, ces souris ne développent pas de symptômes cérébraux contrairement aux patients P NALD. Au cours de ce travail, on a pu montrer sur des fibroblastes issus de patients atteints de P NALD qu'en absence d'activité ACOX1, les peroxysomes sont diminués en nombre et augmentés en taille avec un niveau de β-oxydation peroxysomale fortement réduit. L'accumulation des AGTLC suite à la déficience en ACOX1 dans ces cellules provoque, au niveau transcriptionnel, la perturbation de la voie de synthèse du cholestérol et déclenche une réaction inflammatoire caractérisée par l'activation de la voie de l'IL-1 et la sécrétion d'IL-6 et d'IL-8. Le rôle métabolique important que joue l'ACOX1 dans l'homéostasie énergétique cellulaire a pu être souligné chez l'homme et chez la souris. En effet, la déficience en ACOX1 dans les fibroblastes de patients P-NALD perturbe la morphologie de la mitochondrie qui apparaît anormale ainsi que le métabolisme énergétique mitochondrial caractérisé par une inhibition de PGC-1α par acétylation, une surexpression de l'activité du complexe V et une diminution du taux d'ATP mitochondrial. L'absence dans le foie de l'activité ACOX1, chez la souris Acox1-/-, se traduit par des perturbations, au niveau mitochondrial, dela biogenèse et du métabolisme énergétique. Ces perturbations mitochondriales se caractérisent par une diminution de l'activité du complexe IV de la chaîne respiratoire accompagnée d'une diminution de la respiration. Cependant, ces perturbations n'affectent pas le taux d'ATP total. Les altérations mitochondriales observées chez les souris Acox1-/- sont en grande partie corrigées par l'expression de l'ACOX1 humaine. Ceci montre le rôle indispensable de l'ACOX1 dans l'homéostasie de la fonction mitochondriale.L'ensemble des résultats obtenus au cours de ce travail confirme l'importance de l'activité acyl-CoA oxydase 1 pour la dégradation des AGTLC au niveau du système de β-oxydation peroxysomale et pour la biogenèse du peroxysome. L'accumulation des substrats non métabolisés en absence d'ACOX1 pourrait être à l'origine de la perturbation de la fonction mitochondriale montrant à quel point l'activité de l'ACOX1 est indispensable au métabolisme cellulaire
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Analyse d'un processus pédogénétique par une approche expérimentale : le lessivage des argiles dans le solQuénard, Laurence 20 December 2011 (has links) (PDF)
Le lessivage, compris comme la translocation de particules fines dans les sols à partir d'un horizon dit éluvié vers un horizon d'accumulation dit illuvié, est considéré comme un processus pedogénétique majeur. Il a été décrit dans de nombreux sols mais reste assez peu connu, mal caractérisé et son existence même est encore sujette à débat dans la communauté scientifique. Pour améliorer nos connaissances, ce projet a eu pour objectif de mettre en place des expérimentations au laboratoire pour permettre une quantification et une approche cinétique du lessivage. Nous avons ainsi construit trois dispositifs expérimentaux, deux étant dédiés à l'étude de l'éluviation sur sols remaniés et non perturbés, et le troisième dédié à l'étude de l'illuviation. Ces expériences associées à une approche de bilan de masse sur les bases de données pédologiques existantes nous ont permis de : (i) déterminer la nature des particules migrantes, (ii) quantifier les particules mobilisées et identifier certains processus responsables de cette mobilisation, (iii) quantifier les quantités de particules fixées au sein des horizons d'accumulation et identifier quelques processus responsables de cette fixation, (iv) déterminer l'impact de la structure du sol et des événements climatiques extrêmes sur le lessivage, (v) extrapoler ces résultats expérimentaux sur les durées de la pédogenèse et les confronter aux profils de sols décrits dans la littérature. Nos résultats montrent que : (1) les particules qui migrent ont la signature de la fraction 0-2 μm, légèrement enrichie en smectites lors des premières pluies ; (2) le transfert des particules dépend du mode de fonctionnement hydrodynamique, matriciel ou préférentiel ; (3) seule une fraction des particules mises en suspension dans l'horizon d'éluviation est fixée dans l'horizon d'illuviation ; (4) le lessivage est le processus majeur responsable de la formation de profils à texture contrastée dans 1 à 12% des cas.
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Analyse d'images de microscopie électronique de biopolymères hélicoïdaux flexiblesDesfosses, Ambroise 31 October 2012 (has links) (PDF)
Le virus de la Rougeole reste le plus meurtrier des virus contre lesquels il existe un vaccin, avec environ 350000 décès par an dans le monde. Ce virus appartient à la famille des Paramyxoviridae, qui sont des virus enveloppés de forme sphérique dont le génome est composé d'un seul brin d'ARN de polarité négative. L'élément central de la réplication et de la transcription du génome viral est le complexe, de forme hélicoïdale, entre l'ARN du virus et la nucléoprotéine. Cette association intime appelée nucléocapside a des propriétés étonnantes non encore élucidées. En effet, l'ARN des virus à ARN négatif a la particularité de n'être jamais nu, même lors des étapes de réplication/transcription nécessitant pourtant le passage de la polymérase virale. On suppose que l'interaction avec la phosphoprotéine, cofacteur de la polymérase, provoque un changement de la conformation de la nucléoprotéine pour rendre l'ARN viral accessible à la polymérase. Lorsque la nucléoprotéine est exprimée dans des cellules d'insectes, elle se fixe aux ARNs cellulaires et forme des nucléocapsides recombinantes. Les études précédentes sur d'autres virus à ARN négatif (Rage, Marbourg, Sendaï) ont montré que les nucléocapsides recombinantes sont semblables aux nucléocapsides virales. Au sein de la nucléocapside, le domaine C-terminal de la nucléoprotéine joue un rôle crucial en interagissant avec de nombreux partenaires viraux et cellulaires, notamment avec la phosphoprotéine dans les étapes de réplication/transcription du génome viral. Cependant, des observations en microscopie électronique à transmission avaient montré que les nucléocapsides recombinantes contenant la nucléoprotéine entière était trop flexibles pour envisager leur reconstruction tridimensionnelle par analyse d'image, ce qui avait conduit à les rigidifier par un traitement protéasique dont l'effet latéral est justement l'élimination du domaine C-terminal de la nucléoprotéine. Nous avons mis au point des conditions de préparation en coloration négative permettant de rigidifier la nucléocapside intacte, afin d'en calculer une reconstruction tridimensionnelle à basse résolution et de la comparer avec celle de la nucléocapside protéolysée. Nous avons ainsi montré que les nucléocapsides de la Rougeole changeaient radicalement de structure tridimensionnelle en réponse au traitement protéolytique, non seulement en terme de pas de l'hélice ou de nombre de sous-unités par tour, mais aussi au niveau de la conformation de la nucléoprotéine et de ses contacts avec les sous-unités adjacentes, ce qui n'avait encore jamais été observé aussi clairement.
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Analyse de la dynamique du facteur de transcription HSF1 "Heat Shock Factor 1" par microscopie de fluorescenceHerbomel, Gaëtan 19 October 2012 (has links) (PDF)
La majorité des études sur la dynamique des facteurs de transcription en cellules vivantes s'accordent sur une dynamique rapide. Il existe cependant quelques exceptions, comme la dynamique du facteur de transcription HSF " Heat Shock Factor ", sur les chromosomes polyténiques de drosophile. Notre projet a consisté à étudier la dynamique d'HSF1 dans des cellules humaines. L'exposition des cellules à un stress tel qu'un choc thermique induit une réponse ubiquitaire et transitoire, dont la fonction est de protéger les cellules contre les effets délétères du stress. Au cours d'un choc thermique, plusieurs phénomènes se produisent : i) un arrêt global de la transcription excepté pour certains gènes tels que ceux codant pour les protéines de choc thermique (HSPs), dont l'expression est sous le contrôle du facteur de transcription HSF1. ii) une activation d'HSF1 qui se relocalise de façon rapide et transitoire sur les corps nucléaires de stress (nSBs), où il induit la transcription des séquences satellite III. Les nSBs forment un site d'activité naturellement amplifié et visible en microscopie. Nous avons utilisé deux techniques complémentaires pour étudier la dynamique d'HSF1 en cellules vivantes : le recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la spectroscopie à corrélation de fluorescence multi-confocale (mFCS), qui permet l'analyse FCS en plusieurs points simultanément. En cellules HeLa, la protéine HSF1-eGFP présente une dynamique rapide qui est significativement ralentie suite à un choc thermique. En mFCS, nous avons obtenu des constantes de diffusion de 14 µm²/s avant choc thermique et de 10 µm²/s après choc thermique. En FRAP, le temps de demi-recouvrement est de 0,2 s avant choc thermique, 2,6 s après choc thermique dans le nucléoplasme et 65 s sur les corps nucléaires de stress. Le ralentissement de la dynamique d'HSF1 s'explique par deux phénomènes : i) la formation de complexes de haut poids moléculaire, ii) une augmentation des interactions avec la chromatine. Pour mieux caractériser le changement de dynamique d'HSF1 après choc thermique, plusieurs mutants ont été analysés. Le domaine de trimérisation est indispensable pour le changement de dynamique après choc thermique, alors que le domaine de liaison à l'ADN et le domaine de transactivation n'ont que peu d'effet sur le changement de dynamique. Il ne peut donc pas être expliqué uniquement par les interactions directes à la chromatine du domaine de liaison à l'ADN, ni même par les liaisons indirectes du domaine de transactivation via d'autres protéines. La protéine HSF1 pourrait interagir de façon aspécifique avec la chromatine lors de la recherche de site de liaison, ou d'autres protéines via d'autres domaines pourraient entrainer des interactions indirectes avec la chromatine.
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Association des copolymères à séquences (1->4)-a-L-guluronane en présence d'ions calciumWolnik, Anna 05 February 2014 (has links) (PDF)
Les alginates forment des gels transparents en solution aqueuse en présence de certains ions divalents. Cette propriété est principalement attribuée à la formation de zones de jonction impliquant les séquences (1->4)-a-L-guluronane de chaînes adjacentes. Des oligomères d'alginates ont été utilisés comme briques élémentaires pour la synthèse de polymères biohybrides contenant des chaines pendantes oligo-(1->4)-a-L-guluronane. La rhéologie et la diffusion de la lumière ont permis d'étudier leur gélification ionotropique. De plus, une image atomistique des associations entre chaines latérales a été donnée grâce à la modélisation moléculaire et la microscopie de force atomique. Les polymères biohybrides portant des résidus pendant (1->4)-a-L-guluronane forment des gels en présence de Ca2+. L'addition de blocs guluronane ou mannuronane au gel préformé fait diminuer sa force avec quasiment la même efficacité. L'étude par dynamique moléculaire de séquences (1->4)-a-L-guluronan totalement chargées en présence d'ions Ca2+ suggère qu'environ 8 unités de répétition sont suffisantes pour former spontanément des zones de jonction. De plus, l'analyse conformationnelle de duplexes de chaines (1->4)-a-L-guluronane ayant 12 unités de répétition révèle une grande variété de conformations accessibles, ce qui est consistant avec la difficulté d'obtention de cristaux de Ca2+-guluronate de dimension suffisante pour les études cristallographiques. Les forces d'adhésion entre des homo-oligomères d'alginates en présence de Ca2+ mesuré par spectroscopie de force atomique montrent que la force d'interaction croit selon l'ordre suivant: M-M < M-G or G-M < G-G. Un résultat important est que les blocs mannuronanes, en complexe avec le calcium, peuvent être impliqués dans des associations homotypiques et hétérotypiques. Ce résultat est consistant avec la détection d'agrégats d'oligomères de mannuronanes observés en diffusion de la lumière pendant l'addition de CaCl2. Les blocs M contribuent donc également à la formation du gel mais la force associée est plus faible que celle des blocs G.
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Caractérisation chimique et biologique de Waltheria indica L. (Malvaceae), herbacée utilisée en médecine traditionnelle au Burkina Faso pour la prise en charge de l'asthmeZongo, Ragomzingba 27 March 2013 (has links) (PDF)
Au Burkina Faso, W. indica L. syn. W. americana est utilisée en médecine traditionnelle dans la prise en charge aussi bien curative que préventive de l'asthme. Basée sur une approche ethnopharmacologique, cette étude visait à caractériser W. indica sur le plan chimique et pharmacologique en relation avec l'usage traditionnel contre l'asthme. Méthodologie : Après avoir confirmé les données bibliographiques sur l'usage antiasthmatique de la plante par un entretien avec des tradipraticiens de santé, une recherche bioguidée a été réalisée. Des investigations chimiques à type d'extraction, de purification et de détermination structurale ont été conduites en alternance avec les investigations biologiques de laboratoire. En outre, une caractérisation in situ des groupes chimiques a été réalisée dans différentes parties de la plante. Puis, une évaluation de la toxicité générale aigue de l'extrait hydro alcoolique des racines a été réalisée chez la souris. Résultats et discussion : Des alcaloïdes et des polyphénols ont été mis en évidence dans les différentes parties de la plante. Plusieurs composés ont été isolés à partir de l'extrait hydro alcoolique (HA) des racines. Un seul a été identifié comme étant (-)-épicatéchine. HA, ses fractions n-hexane (F1), dichlorométhane (F2), acétate d'éthyle (F3), la fraction résiduelle (F4) et l'épicatéchine isolée de F3 inhibaient in vitro l'activité de la 5-LOX, la LOX-IB de soja et la PLA2 de manière dose dépendante. L'inhibition de la PDE4A1α par les fractions n'était pas dose dépendant. Sur le plan tissulaire, HA, F3 et les fractions dérivées de F3 inhibaient les contractions induites par l'acétylcholine sur la trachée de rat ex vivo. Un effet dose dépendant était observé avec une CI50 de 1051 µg/mL pour HA, entre 181 et 477 µg/mL pour F3 et ses fractions. HA est modérément toxique chez la souris par voie intrapéritonéale (DL50 =210 mg/Kg). Cette étude est la première investigation pharmacologique de l'usage traditionnel de W. indica contre l'asthme. Nos résultats supportent cet usage traditionnel de la plante et démontrent la participation de l'épicatéchine aux propriétés antiasthmatiques. Conclusion : La validation pharmacologique de l'usage traditionnel de W. indica contre l'asthme doit être complétée par les futures investigations précliniques avec l'isolement et les tests biologiques d'autres composés de la plante qui participeraient à l'activité de W. indica.
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Caractérisation des capacités métaboliques des populations microbiennes impliquées dans les processus de bioremédiation des chloroéthènes par des approches moléculaires haut débit : les biopuces ADN fonctionnellesDugat-Bony, Eric 07 November 2011 (has links) (PDF)
Les chloroéthènes sont les polluants majeurs des eaux souterraines et des nappes phréatiques. De par leur toxicité et leur effet cancérigène, ils représentent une préoccupation majeure pour les autorités publiques et sanitaires. La restauration des sites contaminés est possible par des techniques de dépollution biologique impliquant les microorganismes (bioremédiation microbienne). Cependant, la réussite des traitements dépend à la fois des conditions physicochimiques du site pollué et des capacités de dégradation de la microflore indigène. Ainsi, pour optimiser les processus de décontamination, l'identification et le suivi des différentes populations microbiennes sont indispensables avant et pendant le traitement. Les biopuces ADN fonctionnelles (FGA, Functional Gene Array), outils moléculaires haut débit, sont particulièrement bien adaptées pour des applications en bioremédiation. Leur élaboration nécessite de disposer de logiciels performants pour le design de sondes qui combinent à la fois une forte sensibilité, une très bonne spécificité et un caractère exploratoire, ce dernier étant indispensable pour la détection des séquences connues mais surtout de celles encore jamais décrites au sein d'échantillons environnementaux. Un nouveau logiciel, autorisant la sélection de sondes combinant tous ces critères, a été développé et nommé HiSpOD. Son utilisation pour la construction d'une FGA dédiée aux voies de biodégradation des chloroéthènes a permis d'évaluer l'effet de traitements de biostimulation sur la microflore indigène pour plusieurs sites industriels contaminés. Les données révèlent différentes associations entre microorganismes déhalorespirants qui sont fonction des paramètres environnementaux.
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Caractérisation génétique et moléculaire d'une incompatibilité nucléo-cytoplasmique chez Arabidopsis ThalianaGobron, Nicolas 27 April 2012 (has links) (PDF)
Un croisement intra-spécifique entre deux accessions d'Arabidopsis thaliana (Sha et Mr-0) a donné 100% d'individus mâles stériles dans la descendance F1 lorsque Sha est utilisé comme parent maternel et Mr-0 comme parent mâle (Sha x Mr-0). Dans le croisement réciproque (Mr-0 x Sha), les individus F1 sont mâles fertiles. Étant donné que l'hérédité du cytoplasme chez Arabidopsis thaliana est maternelle (non Mendélienne), cela indique que cette stérilité mâle résulte d'une interaction entre le cytoplasme de Sha et les allèles nucléaires de Mr-0. Une cartographie génétique d'une population en ségrégation a permis, au cours d'un travail préliminaire à cette thèse (Cezar Sophie Hiard et Cezary Waszczak), de localiser les locus nucléaires sur les chromosomes 1 et 3 ; de plus, la présence des allèles Mr-0 au deux locus est nécessaire pour observer le phénotype de stérilité mâle. Les objectifs de thèse étaient de décrire le phénotype de stérilité mâle, d'identifier les facteurs cytoplasmique(s) et nucléaires, et de commencer l'étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à l'origine de cette stérilité mâle. Le clonage positionnel, stratégie adoptée pour identifier les facteurs nucléaires, a permis de diminuer les intervalles aux deux locus et, pour l'un d'entre eux, de pouvoir proposer une approche " gènes candidats ". En parallèle, des croisements réciproques supplémentaires, entre Mr-0 et d'autres accessions que Sha, ont été réalisés et ont permis d'identifier d'autres accessions inductrice de stérilité qui proviennent de la même région géographique que Sha (Asie Centrale) ; la détermination des cytotypes chez les nouvelles accessions testées a montré que la stérilité mâle en F1 apparaît lorsque le parent maternel possède un cytoplasme du même groupe que celui de Sha. Concernant le facteur cytoplasmique inducteur de stérilité, nous avons identifié un seul candidat, l'orf117Sha mitochondrial, qui est spécifique des accessions inductrices de stérilité comme Sha et qui présente beaucoup de similarités avec des facteurs inducteurs de stérilité identifiés dans d'autres systèmes de stérilité mâle cytoplasmique chez les Angiospermes. La caractérisation du phénotype de stérilité mâle par une approche cytologique classique a été réalisée sur des génotypes où les allèles Mr-0 aux locus mainteneurs sont introgressés dans un fond génétique Sha ; selon les génotypes, les allèles mainteneurs Mr-0 sont présents simultanément ou uniquement à l'un des deux locus identifiés, afin de pouvoir observer indépendamment l'influence des allèles Mr-0. Des observations d'anthères prélevées sur ces génotypes et colorées à l'Alexander ont permis de confirmer l'effet des allèles Mr-0 aux locus mainteneurs (introgressés dans un fond génétique homogène) sur la viabilité des grains de pollen, ainsi que le déclenchement tardif de la stérilité mâle nucléo-cytoplasmique au cours du développement pollinique. L'effet, sur la viabilité des grains de pollen, d'autres locus que les locus mainteneurs, appelés locus distorteurs de ségrégation et non liés à la SMNC, a également été observé. De nombreuses incompatibilités génétiques s'expriment dans la F1 Sha x Mr-0 ; elles créent une barrière reproductive post-zygotique en affectant la production de pollen dans la descendance. Le croisement Sha x Mr-0 pourrait révéler un processus évolutif en cours pouvant aboutir à terme à des événements de spéciation au sein d'Arabidopsis thaliana.
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Caractérisation structurale de protéines membranaires par échange hydrogène/deutérium spectrométrie de masseMehmood, Shahid 28 February 2012 (has links) (PDF)
Des exporteurs " ATP-Binding Cassette " (ABC) sont connus pour être responsables de la résistance contre un large spectre d'agents antibiotiques ou chimiothérapeutiques chez les bactéries et les cellules de mammifères. L'échange hydrogène / deutérium associé à la spectrométrie de masse (HDX-MS) a été utilisé pour caractériser les changements conformationnels de deux exporteurs ABC bactériens, BmrA et BmrC/BmrD, en présence et en absence de nucléotide. Les cinétiques locales d'HDX ont montré la nature hautement dynamique des domaines intra-cellulaires (ICDs) dans la forme apo, ce qui n'était pas attendu d'après les structures cristallographiques aux rayons X des protéines homologues. Dans la conformation ouverte vers l'extérieur (" outward facing "), domaines fixant les nucléotides (NBDs) interagissant, le mouvement des ICDs sont largement réduits pour les deux transporteurs. Les cinétiques d'HDX MS dans la conformation " outward facing " ont été déterminées en appliquant cette technique sur des mutants incapables d'hydrolyser les nucléotides et sur la forme sauvage inhibée au vanadate. La dynamique des NBDs, en particulier pour les régions qui interagissent au cours de l'hydrolyse de l'ATP, a été aussi diminuée dans la conformation " outward facing " comparativement à celle ouverte vers l'intérieur. L'ajout de différents agents connus pour être transportés par des transporteurs ABC n'a pas affecté la dynamique des NBDs. Par ailleurs, nous avons aussi appliqué l'HDX MS à la protéine GLIC, un homologue procaryote d'un " ligand-gated ion channel " pentamérique (pLGIC). Les cinétiques locales d'HDX sont en plein accord avec la structure cristallographique disponible et le changement de pH révèle des différences de deutération dans les régions d'interaction des sous-unités.
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