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Inhibición de la Expresión del Gen de la Deshidrogenasa Aldehídica: Evaluación del Sistema de RNA de Interferencia

Cortínez Flores, Gabriel Alejandro January 2008 (has links)
Doctor en Bioquímica / El alcoholismo es una enfermedad multifactorial que genera una serie de trastornos personales, sociales y de salud pública. Según estimaciones del Ministerio de Salud de Chile el abuso en el consumo de alcohol y el alcoholismo causa pérdidas al país por US$3.000 millones anuales. Luego de la oxidación hepática del etanol, el acetaldehído generado es metabolizado a acetato por la deshidrogenasa aldehídica 2 (ALDH2*1). En la población Asiática existen individuos que poseen una variante de la ALDH2 con baja actividad (ALDH2*2) los que experimentan un marcado aumento del acetaldehído sanguíneo después de una ingesta alcohólica. Este incremento del acetaldehído causa diversos efectos tales como el enrojecimiento facial, palpitaciones, hipotensión, cefaleas y náuseas (conocido como “fenotipo asiático”) los que producen un rechazo al consumo del alcohol. Los heterocigotos (ALDH2*1/ALDH2*2) beben moderadamente, mientras que los homocigotos (ALDH2*2/ALDH2*2) son abstemios. El tratamiento farmacológico del alcoholismo se basa en el uso de diversos medicamentos como la naltrexona y el acamprosato que actúan en el sistema nervioso central bloqueando los receptores de endorfinas y NMDA, inhibiendo la sensación de placer asociada al alcohol o disminuyendo los síntomas de la abstinencia alcohólica. Otro fármaco utilizado es el disulfiram, un modificador químico de grupos sulfhidrilos, que inhibe la ALDH2 produciendo un aumento en el nivel de acetaldehído cuando el paciente bebe alcohol, emulando el fenotipo asiático. Estos fármacos requieren administración diaria lo que a causa de la baja adhesión a los tratamientos farmacológicos, reduce su eficacia terapéutica. Un nuevo fármaco de efecto prolongado, que emule el fenotipo asiático sin los efectos secundarios del disulfiram, sería de gran ayuda en el campo del alcoholismo. En esta tesis se evaluó la utilidad de dos algoritmos para diseñar racionalmente siRNAs eficientes que disminuyan la actividad de la ALDH2, mediante la degradación selectiva de su mensajero. El objetivo final fue generar un siRNA como herramienta genética en el campo del alcoholismo o como posible fármaco para su tratamiento. Se diseñaron y estudiaron tres RNAs interferentes dirigidos a distintos sitios del RNA mensajero de la ALDH2 de rata. Dos de ellos disminuyen en 60-70% la actividad de la ALDH2 en células humanas HEK-293 que expresan el gen de la enzima de rata. Empleando la secuencia del RNA interferente más prometedor (siRNA2) se diseñaron y probaron tres genes que, estando bajo el control del promotor del RNA U6 humano, dan origen a horquillas de RNA (shRNA a, b y c) precursoras del siRNA2. El shRNAc, codificado en un plásmido, disminuyó en 50% la actividad de la ALDH2 en células HEK-293. La reducción de actividad concuerda con el 60% de disminución de su mensajero. Esta disminución es específica, puesto que el mensajero de la β-actina y el de IFITM-1 se mantuvieron constantes. La transducción de células de hepatoma de rata H4-II-E-C3 con un vector adenoviral de 1ra generación que codifica la misma horquilla (AdV-shRNAc) disminuyó en 10-15% la actividad de la ALDH2 endógena. La pérdida de eficiencia probablemente se debe a la inhibición de exportina 5 y Dicer, por acción del RNA VAI codificado en los adenovirus. Finalmente, los algoritmos permitieron diseñar siRNAs que reducen la actividad de la ALDH2 por sobre el 50%. La transfección de células humanas (HEK-293) con dos de los tres siRNAs sintetizados químicamente o con un plásmido que codifica un shRNA, redujeron significativamente la actividad de la ALDH2 en células humanas, estableciendo que la interferencia por RNA es una estrategia de silenciamiento génico de utilidad para disminuir la actividad de la ALDH2.
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Inhibición del mRNA de la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2) de rata in vivo mediante una ribozima de horquilla codificada en un vector adenoviral

Irrazábal Aguilera, Thergiory January 2010 (has links)
El alcoholismo está determinado por factores genéticos y medioambientales. El factor genético principal corresponde a los genes que codifican las enzimas que metabolizan el alcohol. El metabolismo hepático del etanol contempla la oxidación del etanol a acetaldehído mediante la deshidrogenasa alcohólica y la posterior oxidación del acetaldehído a acetato, llevada a cabo fundamentalmente por la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2). Un 30-40 % de la población oriental presenta una mutación que genera una ALDH2 sin actividad; al beber alcohol, estos individuos sufren un aumento en el nivel de acetaldehído sanguíneo, lo que trae como consecuencia efectos disfóricos que generan aversión por el alcohol. El fármaco disulfiram, utilizado para el tratamiento del alcoholismo, imita este fenotipo asiático ya que inactiva covalentemente a la ALDH2. Sin embargo, su eficacia farmacológica está contrarrestada por la variabilidad individual, la toxicidad, el requerimiento de ingesta diaria y por la necesidad de que el paciente se comprometa a medicarse. El desarrollo de fármacos alternativos más específicos y de mayor duración es concebible en base a disminuir la cantidad de la enzima ALDH2 disminuyendo la expresión de su gen. Ello se puede efectuar con moléculas capaces de degradar el mRNA de la ALDH2 como las ribozimas, moléculas de RNA que reconocen su blanco por enlaces de Watson y Crick y lo cortan en una secuencia específica. En este trabajo de tesis se determinó si la ribozima de horquilla RzCG20 ―capaz de disminuir la actividad de la ALDH2 en células de hepatoma de rata en cultivo― es capaz de producir el mismo efecto in vivo al entregar, en un vector adenoviral, un gen que codifica dicha ribozima a ratas UChB dependientes de alcohol, de manera que al consumirlo sufran un aumento del acetaldehído sanguíneo cuyos efectos aversivos disminuyan el consumo voluntario de alcohol. Se produjeron y purificaron vectores adenovirales que codifican la ribozima RzCG20, la ribozima control RzCG20c diseñada para unirse a su blanco sin degradarlo, o un RNA no funcional control. Se transdujeron células de hepatoma de rata en cultivo con las preparaciones adenovirales obtenidas para asegurar que eran biológicamente activas, es decir, que eran capaces de disminuir la actividad de la ALDH2. En experimentos in vivo, los vectores adenovirales se inyectaron en la vena de la cola de ratas que voluntariamente beben gran cantidad de alcohol (ratas UChB), determinándose que una sola administración del vector adenoviral codificante de la ribozima RzCG20 a ratas UChB (n=5) disminuye en ~50 % el consumo de alcohol durante 34 días de un periodo de acceso restringido a etanol (1 h al día). Igual efecto se obtuvo con el adenovirus codificante de la ribozima control RzCG20c; el adenovirus control y el vehículo no disminuyeron el consumo. A los 39 días postinyección, las ratas que recibieron los vectores adenovirales codificantes de las ribozimas evidenciaron una reducción de ~24 % en la actividad de la ALDH2 hepática (medición espectrofotométrica) y un aumento en el acetaldehído sanguíneo dos veces mayor que los animales controles (según cromatografía de gases) luego de una administración intraperitoneal de alcohol (1 g/kg). En conclusión, se demostró actividad biológica específica in vivo de la ribozima RzCG20 y la ribozima control RzCG20c para silenciar el mRNA de la ALDH2: ambas ribozimas lograron una disminución parcial de la actividad de la ALDH2 sin afectar la actividad de otras ALDHs. Las posibles diferencias mecanísticas entre las ribozimas no se manifestaron en sus efectos bioquímicos sugiriendo que la sola unión de la ribozima control RzCG20c a los 17 nucleótidos reconocidos en el mRNA de la ALDH2 es suficiente para reducir, por bloqueo del mRNA, la actividad de la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial en un grado que permite disminuir el consumo de alcohol. En suma, el desarrollo de una terapia génica para el alcoholismo disminuyendo la expresión del mRNA de la ALDH2 mediante ribozimas de horquilla es promisorio.
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Terapia Génica por Vectores Adenovirales en Modelos Animales de Alcoholismo: Inhibición de la Expresión del Gen de la Deshidrogenasa Aldehídica Mitocondrial Mediante un Gen Antisentido

Ocaranza Osses, Paula January 2006 (has links)
Doctor en Bioquímica / El alcoholismo es una enfermedad de etiología multifactorial que causa un número de problemas sociales, laborales, legales y médicos. El riesgo de un individuo de desarrollar alcoholismo está influenciado por varios genes. Algunos genes permiten el desarrollo del alcoholismo y otros genes protegen a sus portadores de esta condición. La deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2) metaboliza gran parte del acetaldehído generado en el metabolismo hepático del alcohol. En algunos individuos de la población asiática, una mutación en el gen que codifica la ALDH2, disminuye o elimina la actividad de esta enzima. La inactivación de esta enzima produce una exagerada acumulación del acetaldehído sanguíneo luego del consumo de bebidas alcohólicas, lo que genera efectos disfóricos que producen un rechazo al alcohol. Este fenotipo protector descrito en la población asiática puede ser producido en alcohólicos a los cuales se ha administrado el medicamento aversivo disulfiram (Antabus®). Este fármaco, eficaz en disminuir la actividad ALDH2, es sin embargo poco específico, posee una vida media corta, muestra una gran variabilidad individual y genera una serie de efectos tóxicos por unirse en forma no específica a los grupos sulfhidrilos de varias proteínas. La terapia génica se perfila como una alternativa al actual tratamiento farmacológico del alcoholismo. Un nuevo medicamento aversivo sin los efectos secundarios del disulfiram sería de gran utilidad en el campo del alcoholismo. El tipo de terapia a desarrollar pretende imitar el fenotipo asiático, disminuyendo específicamente la actividad de la ALDH2 mediante la reducción de la traducción del mRNA. La estrategia utilizada para lograr este objetivo, es inhibir la traducción mediante la generación de un RNA antisentido de la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial codificado en un vector adenoviral. En estudios en esta tesis, primeramente, el gen antisentido de la ALDH2 (cDNA de Aldh2 en posición 3’ a 5’) contenido en el vector adenoviral bajo el promotor CMV se transdujo a células de hepatoma de rata generando niveles altos de mRNA antisentido. La administración de este vector a células de hepatoma de rata disminuyó de 60 a 70% la actividad ALDH2 y aumentó 8 veces (10 μM a 80 μM) los niveles de acetaldehído acumulado cuando estas células se incubaron con etanol. En estudios in vivo, se administró el adenovirus portador del gen antisentido-Aldh2 a ratas bebedoras UChB (línea de ratas Bebedoras desarrollada en la Universidad de Chile). Las ratas que recibieron una sola dosis del vector (1012 pv/kg) por vía intravenosa, disminuyeron su consumo de alcohol en 50%, y se observó una reducción de 90% en la actividad de la ALDH2. La reducción del consumo de etanol duró 34 días, tiempo al cual el estudio se finalizó. En estudios paralelos de más corta duración (10 días), los niveles plasmáticos de acetaldehído en los animales tratados con el vector anti-Aldh2 aumentó 6 a 8 veces (8 μM a 60 μM) sobre niveles controles (6-14 μM; p<0,01) asociado a un 37,5% de inhibición de la actividad ALDH2 hepática. En conclusión, en animales que reciben el gen Aldh2-antisentido, una reducción específica en la actividad de la ALDH2 permite la elevación de los niveles de acetaldehído sistémico, que genera una aversión al etanol. Los estudios sugieren que es posible desarrollar una terapia génica específica y de larga duración para el alcoholismo / Alcoholism is defined by the compulsive excessive use of alcohol despite of negative consequences perceived by the subject. It is not only one of major public health problems due to the morbidity caused by the alcohol abuse disorder but it is also a major social problem. The risk of developing this disease is genetically influenced, with some genes being permissive and other genes protective. Most of the elimination of ethanol occurs by oxidation to acetaldehyde and further into acetate. The reactions are sequentially catalyzed by alcohol dehydrogenase (ADH) and aldehyde dehydrogenase (ALDH). The oxidation of acetaldehyde to acetate is catalyzed primarily by ALDH2, the low Km isozyme of ALDH present in mitochondria. A mutation in the gene coding for ALDH2 present in some Asian populations, lowers or abolishes the activity of this enzyme and results in marked elevations in blood acetaldehyde upon ethanol consumption. The resulting phenotype greatly protects against alcohol abuse and alcoholism. The protective Asian phenotype can be elicited in alcoholics who are administered the aversive medication disulfiram (Antabuse®), affording these individuals the same protection from alcohol abuse. However, disulfiram is a non-specific drug that binds to sulfhydryl groups, has a short half-life, cannot be metabolized by some patients into its active metabolite, and has marked toxicity side effects, as it nonspecifically binds to sulfhydryl groups in other proteins. Gene therapy, as a new approach, opens the possibility of developing a specific aversive medication for alcoholism. This new treatment, based on the reduction of Aldh2 mRNA transduction, provides a means by which gene expression can be specifically inhibited to yield the low-ALDH2 Asian phenotype. The aim of the work presented in this thesis is to reduce Aldh2 mRNA translation in the rat by the intracellular generation of an antisense aldehyde dehydrogenase RNA coded by an antisense gene (Aldh2 cDNA in a 3´ to 5´ orientation) contained in an adenoviral vector. Rat hepatoma cells were transduced with the antisense coding gene against ALDH2 carried by the adenoviral vector, leading to the generation of high levels of antisense mRNA. The cells infected with this vector, reduced their ALDH2 activity by 60 to 70% and, in the presence of ethanol, increased 8-fold the levels of acetaldehyde (10 μM to 80 μM). In studies in vivo, the adenoviral vector coding for the antisense-Aldh2 RNA was administered to UChB rats (University of Chile alcohol dependent rats). The rats infected with a single dose of the vector (1012 vp/kg) by tail vein injection inhibited its ALDH2 activity in 90% and reduced its alcohol consumption in 50%. The reduction in alcohol consumption lasted 34 days, time at which the study was terminated. A parallel study in which rats were infected 10 days earlier with a single dose of the vector carrying the antisense gene showed a 37.5% reduction in hepatic ALDH2 activity, while acetaldehyde plasma levels following the administration of ethanol increased 6-8 fold over controls (5-10 μM to 40-60 μM) (p<0,01). Overall, rats treated with an Aldh2- antisense coding gene show significant reductions in hepatic ALDH2 activity and elevations in systemic acetaldehyde upon ethanol administration, which are accompanied by marked reductions in ethanol voluntary consumption in alcohol dependent animals. These preclinical studies suggest that a long-lasting specific gene therapy against alcoholism may be developed
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Participación de Enzimas Aldehido Deshidrogenasas en la Generación de Células Dendriticas Humanas In Vitro

Cuevas Lizana, Carlos Alberto January 2008 (has links)
Las células dendríticas (DCs) cumplen un rol fundamental en la ejecución y regulación de la respuesta inmune. En los últimos años su producción in vitro se ha convertido en una herramienta de gran utilidad en inmunología. En tanto, los retinoides son moléculas que han mostrado participar en procesos de diferenciación celular en diversos tejidos, siendo producidos por una variedad de células, incluidas las DCs. Se ha descrito que miembros de la familia de las aldehído deshidrogenasas (ALDH), son responsables de catalizar la oxidación irreversible de retinoides tales como el retinal a ácido retinoico. Los objetivos de esta memoria fueron: Estudiar las diferencias de expresión de marcadores de diferenciación en cultivos normales y cultivos mantenidos con el inhibidor dietilaminobenzaldehido (DEAB), específico de ALDHs; evaluar la acción de DEAB en cultivos diferenciados por una vía independiente de la enzima; definir si la adición del inhibidor tiene repercusiones en la viabilidad y funcionalidad normal de las DCs, y evaluar la expresión de mRNA y la actividad enzimática de ALDHs en cultivos normales de diferenciación. Nuestros resultados indican que DCs generadas en presencia de DEAB muestran una expresión significativamente menor del marcador de superficie CD11c, mientras el marcador CD14 se expresa en niveles más elevados que en las DCs generadas en condiciones normales. La adición de DEAB a cultivos independientes de la enzima no tuvo efecto alguno en la diferenciación celular. La cantidad de células muertas para todas las condiciones de experimentación es invariable y funcionalmente las células mantenidas con DEAB presentan características propias de deprivación de retinoides. x También se pudo demostrar diferencias en la expresión de isoenzimas de ALDHs a distintos días de diferenciación, al igual que en los niveles de actividad enzimática. Concluimos que las enzimas retinal deshidrogenasas cumplen un rol muy importante en la generación de células dendríticas humanas in vitro.
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Genética molecular de la biosíntesis del ácido abscísico. Clonación y caracterización del gen ABA2

González Guzmán, Miguel 18 December 2019 (has links)
[EN] Mutants able to germinate and perform early growth in medium containing a high NaCl concentration were identified and named salt resistant (sre). The sre mutants also were able to germinate in high-osmoticum medium, indicating that they are osmotolerant in a germination assay. Complementation analyses revealed that sre1-1 and sre1-2 were alleles of the abscisic acid (ABA) biosynthesis ABA2 gene. A map-based cloning strategy allowed the identification of the ABA2 gene and molecular characterization of the new aba2 alleles. The ABA2 gene product belongs to the family of short-chain dehydrogenases/reductases, which are known to be NAD- or NADP-dependent oxidoreductases. Recombinant ABA2 protein produced in Escherichia coli exhibits a Km value for xanthoxin of 19 µM and catalyzes in a NAD-dependent manner the conversion of xanthoxin to abscisic aldehyde, as determined by HPLC-mass spectrometry. The ABA2 mRNA is expressed constitutively in all plant organs examined and is not upregulated in response to osmotic stress. The results of this work are discussed in the context of previous genetic and biochemical evidence regarding ABA biosynthesis, confirming the xanthoxin-->abscisic aldehyde-->ABA transition as the last steps of the major ABA biosynthetic pathway. The abscisic aldehyde oxidase 3 (AAO3) gene product of A. thaliana catalyzes the final step in abscisic acid (ABA) biosynthesis. An aao3-1 mutant in a Landsberg erecta genetic background exhibited a wilty phenotype in rosette leaves, whereas seed dormancy was not affected (Seo et al., 2000a). Therefore, it was speculated that a different aldehyde oxidase would be the major contributor to ABA biosynthesis in seeds (Seo et al., 2000a). Through a screening based on germination under high-salt concentration, we isolated two mutants in a Columbia genetic background, initially named sre2-1 and sre2-2. Complementation tests with different ABA-deficient mutants indicated that sre2-1 and sre2- 2 mutants were allelic to aao3-1, and therefore they were renamed as aao3-2 and aao3-3, respectively. Indeed, molecular characterization of the aao3-2 mutant revealed a T-DNA insertional mutation that abolished the transcription of AAO3 gene, while sequence analysis of AAO3 in aao3-3 mutant revealed a deletion of three nucleotides and several missense mutations. Physiological characterization of aao3-2 and aao3-3 mutants revealed a wilty phenotype and osmotolerance in germination assays. In contrast to aao3-1, both aao3-2 and aao3-3 mutants showed a reduced dormancy. Accordingly, ABA levels were reduced in dry seeds and rosette leaves of both aao3-2 and aao3-3. Taken together, these results indicate that AAO3 gene product plays a major role in seed ABA biosynthesis. / [ES] El ácido abscísico (ABA) es una fitohormona implicada en el control de procesos vegetales esenciales, principalmente el desarrollo de la semilla así como la respuesta de las plantas a diferentes estreses ambientales, particularmente frío, sequía y salinidad. En el presente trabajo se ha realizado la búsqueda en colecciones de Arabidopsis thaliana mutagenizadas con T-DNA de mutantes capaces de germinar en condiciones de alta sal (NaCl), identificándose tres loci mutantes, inicialmente denominados sre1, sre2 y sre3 (“salt resistant”). Los mutantes sre, además de su capacidad para germinar y establecer plántula en condiciones de estrés osmótico, mostraban una germinación resistente a paclobutrazol, latencia muy reducida, mayor transpiración y niveles de ABA en hojas de roseta significativamente menores que plantas silvestres. El análisis de complementación reveló que los mutantes sre1 eran alélicos al mutante aba2-1, los mutante sre2 eran alélicos al mutante aao3-1 y el mutante sre3 era alélico al mutante aba1-5. Así, el ABA bloquea la germinación y el establecimiento de la plántula en condiciones de bajo potencial hídrico, por lo que mutantes capaces de germinar en condiciones de estrés osmótico representan frecuentemente mutantes defectivos en la biosíntesis de ABA. Mediante una combinación de las estrategias de mapeo posicional y gen candidato se llevó a cabo la identificación del gen ABA2 y de las mutaciones sre1-1/aba2-11 y sre1- 2/aba2-12. El gen ABA2 (At1g52340) codifica una alcohol deshidrogenasa de cadena corta dependiente de NAD+ (SDR). La mutación sre1-1/aba2-11 es debida a una deleción de 53 pb que también supone un cambio en la pauta de lectura, generando un alelo nulo de ABA2. La mutación sre1-2/aba2-12 conduce a la sustitución Gly28Arg, afectando al sitio de unión del coenzima. Mediante un análisis HPLC-MS se ha demostrado que la proteína recombinante ABA2 cataliza la conversión de xantoxina en aldehído abscísico en una reacción dependiente de NAD+ . Los resultados obtenidos en el presente trabajo establecen inequívocamente que la conversión de xantoxina en aldehído abscísico representa el penúltimo paso de la ruta de biosíntesis de ABA y que este es catalizado por el producto génico del gen ABA2 (At1g52340). El último paso de la ruta de biosíntesis de ABA es la conversión de aldehído abscísico en ácido abscísico. Este paso está catalizado en Arabidopsis por el producto génico del gen AAO3. Los mutantes sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aao3-3, igual que el mutante aao3-1, muestran una reducción en los niveles de ABA en hojas de roseta y una mayor transpiración que las plantas silvestres. Además, y contrariamente el mutante aao3-1, muestran un fenotipo de osmotolerancia en germinación y establecimiento de plántula, germinación resistente a paclobutrazol, latencia reducida y poseen una reducción del 65% en los niveles de ABA en semillas. La caracterización molecular de la mutación sre2-1/aao3-2 revela una inserción de T-DNA que elimina la transcripción del gen AAO3, constituyendo por tanto un alelo nulo. La secuenciación del gen AAO3 en el mutante sre2-2/aao3-3 revela una deleción de tres nucleótidos y varias mutaciones de cambio de sentido. La evidencia genética y bioquímica resultante del análisis de los mutantes sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aaao3-3 indica que lesiones en el gen AAO3 conducen a niveles reducidos de ABA y fenotipos característicos en semillas. Por consiguiente, queda demostrado que el gen AAO3 desempeña un papel crucial en la biosíntesis de ABA en semillas. / [CA] L´àcid abscísic (ABA) és una fitohormona que ha estat implicada en el control de processos vegetals essencials, principalment en el desenvolupament de la llavor així com en la resposta de les plantes a diferents estressos ambientals, particularment fred, sequera i salinitat. En el present treball de tesi doctoral s´ha fet la recerca en coleccions d´Arabidopsis thaliana mutagenizades amb T-DNA de mutants capaços de germinar en condicions d´elevada sal (NaCl), identificant-se tres loci mutants, inicialment denominats sre1,sre2 i sre3 (“salt resistant”). Els mutants sre, a més de la seva capacitat per a germinar i establir plàntula en condicions d´estrès osmòtic, mostraven una germinació resistent a paclobutrazol, latència molt reduïda, major transpiració i nivells d´ABA en fulles de roseta significativament menors que les plantes silvestres. L´anàlisi de complementació va mostrar que els mutants sre1 eren al·lèlics al mutant aba2-1, els mutants sre2 eren al·lèlics al mutant aao3-1 i el mutant sre3 era al·lèlic al mutant aba1-5. Així, l´ABA bloqueja la germinació i l´establiment de la plàntula en condicions de baix potencial hídric, i aleshores mutants capaços de germinar en condicions d´estrès osmòtic representen normalment mutants amb defectes en la biosíntesi d´ABA. Mitjançant una combinació de les estratègies de mapeig posicional i gen candidat s´ha realitzat la identificació del gen ABA2 y de les mutacions sre1-1/aba2- 11 y sre1-2/aba2-12.El gen ABA2 (At1g52340) codifica una alcohol deshidrogenasa de cadena curta dependent de NAD+ (SDR). La mutació sre1-1/aba2-11 es deguda a una deleció de 53 pb que també suposa un camvi en la pauta de lectura, generant un al·lel nul de ABA2. La mutació sre1-2/aba2-12 produeix a la substitució Gly28Arg, afectant al lloc d´unió del coenzima. Mitjançant un anàlisi HPLC-MS s´ha demostrat que la proteïna recombinant ABA2 catalitza la conversió de xantoxina en aldehid abscísic en una reacció dependent de NAD+ . Els resultats obtinguts en el present treball estableixen inequívocament que la conversió de xantoxina en aldehíd abscísic representa el penúltim pas de la ruta de biosíntesi d´ABA i que està catalitzat pel producte gènic del gen ABA2 (At1g52340). L´últim pas de la ruta de biosíntesi d´ABA és la conversió de l´aldehid abscísic en àcid abscísic. Aquest pas està catalitzat en A. thaliana pel producte gènic del gen AAO3. Els mutants sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aao3-3, igual que el mutant aao3-1, mostraven una reducció en els nivells d´ABA en fulles de roseta i una major transpiració que las plantes silvestres. A més, i contràriament al mutant aao3-1, mostraven un fenotip de osmotolerancia en germinació i establiment de plàntula, germinació resistent a paclobutrazol, latència reduïda i posseeixen una reducció del 65% en els nivells d´ABA en llavors. La caracterització molecular de la mutació sre2-1/aao3-2 revela una inserció de T-DNA que elimina la transcripció del gen AAO3, constituint por tant un al·lel nul. La secuenciació del gen AAO3 en el mutant sre2-2/aao3-3 va revelar una deleció de tres nucleòtids i vàries mutacions de canvi de sentit. L´evidencia genètica i bioquímica resultant de l´anàlisi dels mutants sre2- 1/aao3-2 i sre2-2/aaao3-3 indica que lesions en el gen AAO3 condueixen a nivells reduïts d´ABA i fenotips característics en llavors. Aleshores, queda demostrat que el gen AAO3 poseeix un paper crucial en la biosíntesi d´ABA en llavors. / González Guzmán, M. (2005). Genética molecular de la biosíntesis del ácido abscísico. Clonación y caracterización del gen ABA2 [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/135830 / Premios Extraordinarios de tesis doctorales

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