Evalúa la frecuencia de la variante alélica CYP2D6*4 (SNP rs3892097, variante A) y predecir el fenotipo metabolizador lento en cuatro subpoblaciones peruanas. Se determinaron las frecuencias alélicas y genotípicas del SNP rs3892097 previa amplificación por PCR y digestión con la enzima de restricción Mval (BstI), la predicción del fenotipo metabolizador se realizó en base al Activity score y además, se compararon las frecuencias obtenidas con otras poblaciones del mundo. El alelo CYP2D6*4 (rs3892097, G/A), en la población peruana total en estudio, tiene una frecuencia de 9,3%, mostrando diferencias significativas con la reportada en otras poblaciones del mundo (p<0,05). Asimismo, las frecuencias de este alelo para las subpoblaciones de Huarochirí-Lima, Lima-ciudad-, CalcaCusco y Puno fueron: 2,5%, 9%, 10,9% y 13,8%, respectivamente. El 1,2% de la población peruana en estudio se predice que, fenotípicamente, son metabolizadores lentos, representado en el 3,4% de la subpoblación de Puno y 1% de la población de Lima-ciudad. Este trabajo reporta la caracterización de alelos del CYP2D6 *4 en subpoblaciones peruanas, con la finalidad de aportar al desarrollo de la farmacoterapia personalizada en nuestro país. / Tesis

Em mamíferos a inativação do cromossomo X (ICX) consiste no silenciamento gênico de um dos dois X presentes nas células somáticas normais das fêmeas, garantindo a compensação de dose transcricional em relação aos machos. Existem duas formas de ICX: aleatória, na qual a escolha do cromossomo X inativado se dá ao acaso (X paterno ou materno); e de maneira completamente desviada, na qual a atividade do cromossomo X dependerá de sua origem parental. Nas fêmeas marsupiais a inativação ocorre de forma completamente desviada, sendo o X paterno preferencialmente inativado em todas as células, já nas células embrionárias de eutérios, o que se observa é a ICX aleatória. Entretanto, naquelas células que darão origem aos tecidos extra-embrionários, de camundongos e bovinos, a ICX se dá de forma equivalente à dos marsupiais, ou seja, o X paterno é preferencialmente inativado. Há mais de 30 anos o padrão de ICX em tecidos extra-embrionários humanos tem sido alvo de intenso debate. A crítica que se faz aqui é que tais estudos foram realizados com base na expressão de apenas um ou dois genes ligados ao X com amostras de tecidos extra-embrionários em diferentes idades gestacionais e, por vezes, em poucas amostras, o que deve ter levado às contradições entre as conclusões. O diferencial deste trabalho foi a utilização de técnicas de genotipagem de SNPs presentes em regiões codificadoras, para analisar o padrão de atividade alelo-específica de um grande número de genes presentes ao longo de todo o cromossomo X, gerando um panorama mais representativo da ICX em placenta humana. Neste estudo é comprovado o padrão aleatório de ICX em placenta humana a termo e demonstrado que este órgão se apresenta como um 65 mosaico em relação à escolha do X inativo. A análise global da atividade gênica no cromossomo X indicou ainda que a manutenção do estado epigenético do X inativo parece ser heterogêneo. Em conjunto, os dados gerados são capazes de explicar as incongruências entre as conclusões previamente publicadas. Este trabalho também ilustra as diferenças nos mecanismos de ICX entre humanos e camundongos e reforça a importância de se avaliar esse tema em outras espécies de mamíferos eutérios na tentativa de se elucidar os processos evolutivos envolvidos na compensação de dose em mamíferos / Imprinted inactivation of the paternal X chromosome in marsupials is the primordial mechanism of dosage compensation for X-linked genes between females and males in Therians. In Eutherian mammals, X chromosome inactivation (XCI) evolved into a random process in cells from the embryo proper, where either the maternal or paternal X can be inactivated. However, species like mouse and bovine maintained imprinted XCI exclusively in extraembryonic tissues. The existence of imprinted XCI in humans remains controversial, with studies based on the analyses of only one or two X-linked genes in different extraembryonic tissues. Here we readdress this issue in human term placenta by performing a robust analysis of allele-specific expression of 23 X-linked genes, including XIST, using 28 SNPs in transcribed regions. We show that XCI is random in human placenta, and that this organ is arranged in relatively large patches of cells with either maternal or paternal inactive X. In addition, this chromosome-wide analysis indicated heterogeneous maintenance of the epigenetic state along the inactive X, which combined with the extensive mosaicism found in placenta, can explain the lack of agreement among previous studies. Our results illustrate the differences of XCI mechanism between humans and mice, and highlight the importance of addressing the issue of imprinted XCI in other species in order to understand the evolution of dosage compensation in placental mammals

A asma brônquica é doença inflamatória crônica complexa das vias aéreas provocada pela interação de fatores genéticos e ambientais. O gene HLA-G (Antígeno Leucocitário Humano G) foi identificado como gene de susceptibilidade à asma, codificando uma molécula não clássica do complexo principal de histocompatibilidade (MHC, do inglês Major Histocompatibility Complex) de classe I com função moduladora das células do sistema imunológico. Nesse contexto, avaliamos o papel do HLA-G na asma afim de identificar genótipos, alelos e haplótipos associados com proteção ou susceptibilidade nas diferentes formas de apresentação da doença. Investigamos os sítios polimórficos da região 3\' não traduzida (3\'UTR-untranslated region) do HLA-G (14 pb Ins/Del, + 3001 C/T, +3003 C/T, +3010 C/G, +3027 A/C, +3035 C/T, +3142 C/G, +3187 A/G e +3196 C/G) em 118 pacientes asmáticos estratificados em asma leve ou moderada e grave e 183 indivíduos brasileiros saudáveis. Testes de associação foram realizados para avaliar as frequências dos genótipos, alelos e haplótipos da 3\'UTR do HLA-G na asma brônquica, considerada como grupo total ou estratificada de acordo com a gravidade da doença. Nossos resultados demonstraram que as frequências dos alelos +3001 C, +3003 C, +3035 C e +3196 C e do genótipo 14 bp DI estavam aumentadas no grupo total e nas diversas formas de apresentação da doença. Os alelos +3010 C e +3142 G e o genótipo +3010 CC estavam mais representados em pacientes com asma leve ou moderada. Por outro lado, os genótipos +3010 GG, +3142 CG e +3187 AG e o alelo +3010 G apresentaram maior frequência nos asmáticos graves, estando fortemente associados com o desenvolvimento da forma grave da asma. Além disso, os genótipos 14 pb II, +3010 CC e +3142 GG e o alelo +3010 C conferiram proteção à asma grave. Além disso, identificamos um haplótipo da 3\'UTR do HLA-G associado ao desenvolvimento de asma brônquica, a UTR-8, e um haplótipo que conferiu proteção contra a mesma, a UTR-7. Concluindo, neste estudo, observamos frequências diferenciais de sítios polimórficos do segmento 3\'UTR do HLA-G associados com predisposição à asma brônquica e, também, com a gravidade da doença / Bronchial asthma is a complex chronic inflammatory disease of the airways caused by the interaction of genetic susceptibility and environmental factors. The HLA-G (Human Leucocyte Antigen G) gene was identified as a susceptible marker for bronchial asthma, encoding a nonclassical Major Histocompatibility Complex (MHC) class I molecule, considered to be an important immune check point modulator. In the present study, we evaluated the role of HLA-G in bronchial asthma susceptibility and disease severity, evaluating HLA-G genotypes, alleles or haplotypes. We investigated the HLA-G 3\'Untraslated region (3\'UTR) polymorphic sites (14-bp INS/DEL, +3001, +3003C/T, +3010C/G, +3027A/C, +3035C/T, +3142C/G, +3187A/G, and +3196C/G) in 118 asthmatic Brazilian patients, stratified according to disease severity into mild/moderate and severe asthma, and in 183 healthy individuals. HLA-G 3\'UTR variation sites were individually analyzed or lumped together as haplotypes. Our results showed that frequencies of +3001 C, +3003 C, +3035 C e +3196 C alleles and 14 pb ID genotype were increased in asthma group considered as a whole and in patients stratified according to disease severity. The +3010 C and .3142 G alleles and the +3010 CC genotype were overrepresented in patients with mild and moderate forms. Similarly, the +3010 GG, +3142 CG, +3187 AG genotypes and +3010 G allele presented increased frequency in severe asthmatic patients. In contrast, the 14 pb II, +3010 CC and +3142 GG genotypes and +3010 C allele conferred protection against severe asthma. In addition, we identified a 3\'UTR HLA-G haplotype that was associated with bronchial asthma development (UTR-8) and one haplotype that conferred protection against asthma (UTR-7). In conclusion, in this study, we observed differential frequencies at HLA-G 3\'UTR polymorphic sites that are associated with bronchial asthma predisposition and, also, with disease severity

As enzimas CYP2D6, CYP2C19 e CYP2C9 são responsáveis pelo metabolismo de aproximadamente metade dos 200 medicamentos mais prescritos nos EUA. Padronizamos ensaios de genotipagem baseados na discriminação alélica com o sistema TaqMan® em 198 indivíduos. Para o gene CYP2D6, os alelos *1 e *2 foram os mais freqüentes, seguidos pelos alelos *4, *41, *35, *17, *5, *10, *6, *29 e *9. Desenvolvemos também uma nova metodologia para a determinação do número de cópias do gene CYP2D6. Para o gene CYP2C19, o alelo *1 foi o mais frequente, seguido pelos alelos *17, *2 e *3. Nosso estudo foi o primeiro a determinar a freqüência alélica do gene CYP2C19 no Brasil. Para o gene CYP2C9, o alelo *1 foi o mais frequente, seguido pelos alelos *2 e *3. Desenvolvemos uma metodologia reprodutível e acessível para a genotipagem dos polimorfismos principais dos genes CYP2D6, CYP2C19 e CYP2C9. A identificação precoce de indivíduos suscetíveis a efeitos adversos, bem como de metabolizadores rápidos pode trazer grandes benefícios aos pacientes possibilitando assim uma medicina personalizada. / The enzymes CYP2D6, CYP2C19 and CYP2C9 metabolize approximately half of the 200 most prescribed drugs in the USA. We standardized genotyping tests based on allelic discrimination, using TaqMan® genotyping system in 198 samples. For the CYP2D6 gene, allele *1 and *2 were the most frequent, followed by alleles *4, *4, *35, *17, *5, *10, *6, *29 and *9. We have also developed a new methodology for determining the copy number variations of the CYP2D6 gene. For the CYP2C19 gene, the allele *1 was the most common, followed by the alleles *17, *2 and *3. In our concern, our study was the first to determine the allele frequency of the CYP2C19 gene in Brazil. For CYP2C9 gene, the allele *1 was the most common followed by the alleles *2 and *3. We developed a methodology reproducible and accessible for genotyping the most important polymorphisms of the genes CYP2D6, CYP2C19 and CYP2C9. The previous identification of individuals at risk to develop adverse drug reactions as well as ultrarapid-metabolizers may bring benefits to the patients, leading to a personalized therapy.

As enzimas CYP2D6, CYP2C19 e CYP2C9 são responsáveis pelo metabolismo de aproximadamente metade dos 200 medicamentos mais prescritos nos EUA. Padronizamos ensaios de genotipagem baseados na discriminação alélica com o sistema TaqMan® em 198 indivíduos. Para o gene CYP2D6, os alelos *1 e *2 foram os mais freqüentes, seguidos pelos alelos *4, *41, *35, *17, *5, *10, *6, *29 e *9. Desenvolvemos também uma nova metodologia para a determinação do número de cópias do gene CYP2D6. Para o gene CYP2C19, o alelo *1 foi o mais frequente, seguido pelos alelos *17, *2 e *3. Nosso estudo foi o primeiro a determinar a freqüência alélica do gene CYP2C19 no Brasil. Para o gene CYP2C9, o alelo *1 foi o mais frequente, seguido pelos alelos *2 e *3. Desenvolvemos uma metodologia reprodutível e acessível para a genotipagem dos polimorfismos principais dos genes CYP2D6, CYP2C19 e CYP2C9. A identificação precoce de indivíduos suscetíveis a efeitos adversos, bem como de metabolizadores rápidos pode trazer grandes benefícios aos pacientes possibilitando assim uma medicina personalizada. / The enzymes CYP2D6, CYP2C19 and CYP2C9 metabolize approximately half of the 200 most prescribed drugs in the USA. We standardized genotyping tests based on allelic discrimination, using TaqMan® genotyping system in 198 samples. For the CYP2D6 gene, allele *1 and *2 were the most frequent, followed by alleles *4, *4, *35, *17, *5, *10, *6, *29 and *9. We have also developed a new methodology for determining the copy number variations of the CYP2D6 gene. For the CYP2C19 gene, the allele *1 was the most common, followed by the alleles *17, *2 and *3. In our concern, our study was the first to determine the allele frequency of the CYP2C19 gene in Brazil. For CYP2C9 gene, the allele *1 was the most common followed by the alleles *2 and *3. We developed a methodology reproducible and accessible for genotyping the most important polymorphisms of the genes CYP2D6, CYP2C19 and CYP2C9. The previous identification of individuals at risk to develop adverse drug reactions as well as ultrarapid-metabolizers may bring benefits to the patients, leading to a personalized therapy.

A asma brônquica é doença inflamatória crônica complexa das vias aéreas provocada pela interação de fatores genéticos e ambientais. O gene HLA-G (Antígeno Leucocitário Humano G) foi identificado como gene de susceptibilidade à asma, codificando uma molécula não clássica do complexo principal de histocompatibilidade (MHC, do inglês Major Histocompatibility Complex) de classe I com função moduladora das células do sistema imunológico. Nesse contexto, avaliamos o papel do HLA-G na asma afim de identificar genótipos, alelos e haplótipos associados com proteção ou susceptibilidade nas diferentes formas de apresentação da doença. Investigamos os sítios polimórficos da região 3\' não traduzida (3\'UTR-untranslated region) do HLA-G (14 pb Ins/Del, + 3001 C/T, +3003 C/T, +3010 C/G, +3027 A/C, +3035 C/T, +3142 C/G, +3187 A/G e +3196 C/G) em 118 pacientes asmáticos estratificados em asma leve ou moderada e grave e 183 indivíduos brasileiros saudáveis. Testes de associação foram realizados para avaliar as frequências dos genótipos, alelos e haplótipos da 3\'UTR do HLA-G na asma brônquica, considerada como grupo total ou estratificada de acordo com a gravidade da doença. Nossos resultados demonstraram que as frequências dos alelos +3001 C, +3003 C, +3035 C e +3196 C e do genótipo 14 bp DI estavam aumentadas no grupo total e nas diversas formas de apresentação da doença. Os alelos +3010 C e +3142 G e o genótipo +3010 CC estavam mais representados em pacientes com asma leve ou moderada. Por outro lado, os genótipos +3010 GG, +3142 CG e +3187 AG e o alelo +3010 G apresentaram maior frequência nos asmáticos graves, estando fortemente associados com o desenvolvimento da forma grave da asma. Além disso, os genótipos 14 pb II, +3010 CC e +3142 GG e o alelo +3010 C conferiram proteção à asma grave. Além disso, identificamos um haplótipo da 3\'UTR do HLA-G associado ao desenvolvimento de asma brônquica, a UTR-8, e um haplótipo que conferiu proteção contra a mesma, a UTR-7. Concluindo, neste estudo, observamos frequências diferenciais de sítios polimórficos do segmento 3\'UTR do HLA-G associados com predisposição à asma brônquica e, também, com a gravidade da doença / Bronchial asthma is a complex chronic inflammatory disease of the airways caused by the interaction of genetic susceptibility and environmental factors. The HLA-G (Human Leucocyte Antigen G) gene was identified as a susceptible marker for bronchial asthma, encoding a nonclassical Major Histocompatibility Complex (MHC) class I molecule, considered to be an important immune check point modulator. In the present study, we evaluated the role of HLA-G in bronchial asthma susceptibility and disease severity, evaluating HLA-G genotypes, alleles or haplotypes. We investigated the HLA-G 3\'Untraslated region (3\'UTR) polymorphic sites (14-bp INS/DEL, +3001, +3003C/T, +3010C/G, +3027A/C, +3035C/T, +3142C/G, +3187A/G, and +3196C/G) in 118 asthmatic Brazilian patients, stratified according to disease severity into mild/moderate and severe asthma, and in 183 healthy individuals. HLA-G 3\'UTR variation sites were individually analyzed or lumped together as haplotypes. Our results showed that frequencies of +3001 C, +3003 C, +3035 C e +3196 C alleles and 14 pb ID genotype were increased in asthma group considered as a whole and in patients stratified according to disease severity. The +3010 C and .3142 G alleles and the +3010 CC genotype were overrepresented in patients with mild and moderate forms. Similarly, the +3010 GG, +3142 CG, +3187 AG genotypes and +3010 G allele presented increased frequency in severe asthmatic patients. In contrast, the 14 pb II, +3010 CC and +3142 GG genotypes and +3010 C allele conferred protection against severe asthma. In addition, we identified a 3\'UTR HLA-G haplotype that was associated with bronchial asthma development (UTR-8) and one haplotype that conferred protection against asthma (UTR-7). In conclusion, in this study, we observed differential frequencies at HLA-G 3\'UTR polymorphic sites that are associated with bronchial asthma predisposition and, also, with disease severity

Em mamíferos a inativação do cromossomo X (ICX) consiste no silenciamento gênico de um dos dois X presentes nas células somáticas normais das fêmeas, garantindo a compensação de dose transcricional em relação aos machos. Existem duas formas de ICX: aleatória, na qual a escolha do cromossomo X inativado se dá ao acaso (X paterno ou materno); e de maneira completamente desviada, na qual a atividade do cromossomo X dependerá de sua origem parental. Nas fêmeas marsupiais a inativação ocorre de forma completamente desviada, sendo o X paterno preferencialmente inativado em todas as células, já nas células embrionárias de eutérios, o que se observa é a ICX aleatória. Entretanto, naquelas células que darão origem aos tecidos extra-embrionários, de camundongos e bovinos, a ICX se dá de forma equivalente à dos marsupiais, ou seja, o X paterno é preferencialmente inativado. Há mais de 30 anos o padrão de ICX em tecidos extra-embrionários humanos tem sido alvo de intenso debate. A crítica que se faz aqui é que tais estudos foram realizados com base na expressão de apenas um ou dois genes ligados ao X com amostras de tecidos extra-embrionários em diferentes idades gestacionais e, por vezes, em poucas amostras, o que deve ter levado às contradições entre as conclusões. O diferencial deste trabalho foi a utilização de técnicas de genotipagem de SNPs presentes em regiões codificadoras, para analisar o padrão de atividade alelo-específica de um grande número de genes presentes ao longo de todo o cromossomo X, gerando um panorama mais representativo da ICX em placenta humana. Neste estudo é comprovado o padrão aleatório de ICX em placenta humana a termo e demonstrado que este órgão se apresenta como um 65 mosaico em relação à escolha do X inativo. A análise global da atividade gênica no cromossomo X indicou ainda que a manutenção do estado epigenético do X inativo parece ser heterogêneo. Em conjunto, os dados gerados são capazes de explicar as incongruências entre as conclusões previamente publicadas. Este trabalho também ilustra as diferenças nos mecanismos de ICX entre humanos e camundongos e reforça a importância de se avaliar esse tema em outras espécies de mamíferos eutérios na tentativa de se elucidar os processos evolutivos envolvidos na compensação de dose em mamíferos / Imprinted inactivation of the paternal X chromosome in marsupials is the primordial mechanism of dosage compensation for X-linked genes between females and males in Therians. In Eutherian mammals, X chromosome inactivation (XCI) evolved into a random process in cells from the embryo proper, where either the maternal or paternal X can be inactivated. However, species like mouse and bovine maintained imprinted XCI exclusively in extraembryonic tissues. The existence of imprinted XCI in humans remains controversial, with studies based on the analyses of only one or two X-linked genes in different extraembryonic tissues. Here we readdress this issue in human term placenta by performing a robust analysis of allele-specific expression of 23 X-linked genes, including XIST, using 28 SNPs in transcribed regions. We show that XCI is random in human placenta, and that this organ is arranged in relatively large patches of cells with either maternal or paternal inactive X. In addition, this chromosome-wide analysis indicated heterogeneous maintenance of the epigenetic state along the inactive X, which combined with the extensive mosaicism found in placenta, can explain the lack of agreement among previous studies. Our results illustrate the differences of XCI mechanism between humans and mice, and highlight the importance of addressing the issue of imprinted XCI in other species in order to understand the evolution of dosage compensation in placental mammals

Tesis por compendio / [EN] The selective and sensitive detection of single nucleotide variations is essential for early diagnosis, individualized therapy, and disease prognosis. The SARS-CoV-2 pandemic has highlighted the pressing need to develop reliable, rapid and simple detection methods for mass diagnosis. Likewise, there is a growing demand for genomic biosensors that are selective, multi-analyte and low-cost and allow the detection and identification of certain oncological biomarkers. This doctoral thesis has focused on the development of integrated systems of isothermal amplification, selective hybridization and optical biosensing for detection of point mutations in the PIK3CA, KRAS and BRAF genes associated with colorectal cancer. These predictive biomarkers are related to increased cell proliferation, apoptosis, and resistance to monoclonal antibody treatments (Cetuximab and Panitumumab). Isothermal DNA amplification methods have been explored, as they are particularly suitable for the development of a new generation of diagnostic devices aimed at supporting precision medicine. Specifically, isothermal amplification by recombinase-polymerase (RPA) has been selected as an alternative to detection methods that require unique infrastructures. In addition, its integration with bioanalytical platforms has been investigated, which represents a great advance for the simplification of biorecognition processes and their optical detection. This methodology has presented advantages over other DNA detection systems, in terms of portability and equipment, as well as reduction of test times and the possibility of performing diagnostic tests outside the laboratory. This doctoral thesis, framed in this context, is structured in 4 chapters: In chapter 1 a new variant of recombinase-polymerase amplification is presented, called RPA-blocked, based on the enrichment of minority alleles by introducing a blocking agent. In addition, this research has developed an analytical support consisting of a polycarbonate chip with covalently anchored allele-specific probes.The integration of the method has allowed the development of a portable system for the simultaneous genotyping of mutations in exons 9 and 20 of the PIK3CA gene. in cell lines and tumor tissues of cancer patients. In Chapter 2, the development of a genosensor that incorporates magnetic particles conjugated to allele-specific probes for the concentration and detection of the selective amplification product derived from RPA-blocked is described. With this genosensor, hybridization times and reaction volumes have been reduced. This approach has resulted in a portable and low-cost system for genotyping the KRAS gene applicable to solid tumor samples. Chapters 3 and 4 focus on the development of thermoplastic surfaces for the covalent anchoring of allele-specific probes mediated by dendrimeric molecules, with the aim of increasing the immobilization density. Thus, the covalent anchoring to activated polycarbonate and cycloolefin thermoplastic surfaces of allele-specific probes has been studied, mediated by carboxylic dendrimers through carbodiimide chemistry and by dendrons through the chemoselective reaction of the thiol-ino group. These multiplexed genosensors have allowed the genotyping of the V600 codon of the BRAF gene and the H1047 codon of the PIK3CA gene, in biopsied tissue samples. The research carried out in this thesis has given rise to new methodological contributions of interest based on obtaining integrated biosensor systems. These platforms will contribute to the development of massive diagnostic tools. / [ES] La detección selectiva y sensible de variaciones de nucleótido único es fundamental para el diagnóstico precoz, la terapia individualizada y el pronóstico de enfermedades. La pandemia SARS-CoV-2 ha puesto de manifiesto la necesidad acuciante de desarrollar métodos de detección fiables, rápidos y sencillos para el diagnóstico masivo. Asimismo, existe una demanda creciente de biosensores genómicos que sean selectivos, multianalito y de bajo coste y permitan detectar e identificar ciertos biomarcadores oncológicos.La presente tesis doctoral se ha centrado en el desarrollo de sistemas integrados de amplificación isoterma, hibridación selectiva y biosensado óptico para la detección de mutaciones puntuales en los genes PIK3CA, KRAS y BRAF asociadas al cáncer colorrectal. Estos biomarcadores predictivos se relacionan con un incremento de la proliferación celular, apoptosis y resistencia a tratamientos con anticuerpos monoclonales (Cetuximab y Panitumumab). En este contexto, se han explorado los métodos isotermos de amplificación de ADN, dado que son particularmente adecuados para el desarrollo de una nueva generación de dispositivos de diagnóstico dirigidos a apoyar la medicina de precisión. En concreto, se ha seleccionado la amplificación isoterma por recombinasa-polimerasa (RPA) como una alternativa a los métodos de detección que requieren de infraestructuras singulares. Además, se ha investigado su integración con plataformas bioanalíticas, lo que supone un gran avance para la simplificación de los procesos de biorreconocimiento y su detección óptica. Esta metodología ha presentado ventajas frente a otros sistemas de detección de ADN, en términos de portabilidad y equipos, así como reducción de tiempos de ensayo y la posibilidad de realizar las pruebas de diagnóstico fuera del laboratorio. La presente tesis doctoral, enmarcada en este contexto, se estructura en 4 capítulos: En el capítulo 1 se presenta una nueva variante de la amplificación por recombinasa-polimerasa, denominada RPA-bloqueada, basado en el enriquecimiento de alelos minoritarios mediante de la introducción de un agente bloqueante. Además, en esta investigación se ha desarrollado un soporte analítico formado por un chip de policarbonato con sondas alelo-específicas ancladas covalentemente.La integración del método ha permitido desarrollar un sistema portátil para el genotipado simultáneo de mutaciones en los exones 9 y 20 del gen PIK3CA en líneas celulares y en tejidos tumorales de pacientes oncológicos. En el capítulo 2, se describe el desarrollo de un genosensor que incorpora partículas magnéticas conjugadas a sondas alelo-específicas para la concentración y detección del producto de amplificación selectivo derivado de la RPA-bloqueada. Con este genosensor, se han reducido los tiempos de hibridación y los volúmenes de reacción. Esta aproximación se ha concretado en un sistema portátil y de bajo coste para el genotipado del gen KRAS aplicable a muestras de tumores sólidos. Los capítulos 3 y 4 se centran en el desarrollo de superficies termoplásticas para el anclaje covalente de sondas alelo-específicas mediado por moléculas dendriméricas, con el objetivo de incrementar la densidad de inmovilización. Así, se ha estudiado el anclaje covalente a superficies termoplásticas de policarbonato y cicloolefina activadas, de sondas alelo-específicas, mediado por dendrímeros carboxílicos mediante la química de la carbodiimida y por dendrones mediante la reacción quimioselectiva del grupo tiol-ino. Dichos genosensores multiplexados han permitido el genotipado del codón V600 del gen BRAF y el codón H1047 del gen PIK3CA, en muestras de tejido biopsiado. Las investigaciones desarrolladas en la presente tesis han dado lugar a nuevas aportaciones metodológicas de interés basadas en la obtención de sistemas biosensores integrados. Estas plataformas, contribuirán al desarrollo de herramientas de diag / [CAT] La detecció selectiva i sensible de variacions de nucleòtid únic és fonamental per al diagnòstic precoç, la teràpia individualitzada i el pronòstic de malalties. La pandèmia SARS-CoV-2 ha posat de manifest la necessitat apressant de desenvolupar mètodes de detecció fiables, ràpids i senzills per al diagnòstic massiu. Així mateix, existeix una demanda creixent de biosensors genòmics que siguen selectius, multianàlit i de baix cost i permeten detectar i identificar uns certs biomarcadors oncológics. La present tesi doctoral s'ha centrat en el desenvolupament de sistemes integrats d'amplificació isoterma, hibridació selectiva i biosensat òptic per a la detecció de mutacions puntuals en els gens PIK3CA, KRAS i BRAF associades al càncer colorectal. Aquests biomarcadors predictius es relacionen amb un increment de la proliferació cel·lular, apoptosi i resistència a tractaments amb anticossos monoclonals (Cetuximab i Panitumumab). S'han explorat els mètodes isoterms d'amplificació d'ADN, atés que són particularment adequats per al desenvolupament d'una nova generació de dispositius de diagnòstic dirigits a donar suport a la medicina de precisió. En concret, s'ha seleccionat l'amplificació isoterma per recombinasa-polimerasa (RPA) com una alternativa als mètodes de detecció que requereixen d'infraestructures singulars. A més, s'ha investigat la seua integració amb plataformes bioanalítiques, la qual cosa suposa un gran avanç per a la simplificació dels processos de biorreconeiximent i la seua detecció òptica. Aquesta metodologia ha presentat avantatges enfront d'altres sistemes de detecció d'ADN, en termes de portabilitat i equips, així com reducció de temps d'assaig i la possibilitat de realitzar les proves de diagnòstic fora del laboratori. La present tesi doctoral, emmarcada en aquest context, s'estructura en 4 capítols: En el capítol 1 es presenta una nova variant de l'amplificació per recombinasa-polimerasa, denominada RPA-bloquejada, basat en l'enriquiment d'al·lels minoritaris mitjançant de la introducció d'un agent bloquejant. A més, en aquesta investigació s'ha desenvolupat un suport analític format per un xip de policarbonat amb sondes al·lel-específiques ancorades covalentemente.la integració del mètode ha permés desenvolupar un sistema portàtil per al genotipat simultani de mutacions en els exons 9 i 20 del gen PIK3CA en línies cel·lulars i en teixits tumorals de pacients oncològics. En el capítol 2, es descriu el desenvolupament d'un genosensor que incorpora partícules magnètiques conjugades a sondes al·lel-específiques per a la concentració i detecció del producte d'amplificació selectiu derivat de la RPA-bloquejada. Amb aquest genosensor, s'han reduït els temps d'hibridació i els volums de reacció. Aquesta aproximació s'ha concretat en un sistema portàtil i de baix cost per al genotipat del gen KRAS aplicable a mostres de tumors sòlids. Els capítols 3 i 4 se centren en el desenvolupament de superfícies termoplàstiques per a l'ancoratge covalent de sondes al·lel-específiques mediat per molècules dendrimériques, amb l'objectiu d'incrementar la densitat d'immobilització. Així, s'ha estudiat l'ancoratge covalent a superfícies termoplàstiques de policarbonat i cicloolefina activades, de sondes al·lel-específiques, mediat per dendrimers carboxílics mitjançant la química de la carbodiimida i per dendrones mitjançant la reacció quimioselectiva del grup tiol-ino. Dits genosensors multiplexats han permés el genotipat del codó V600 del gen BRAF i el codó H1047 del gen PIK3CA, en mostres de teixit biopsiat Les investigacions desenvolupades en la present tesi han donat lloc a noves aportacions metodològiques d'interés basades en l'obtenció de sistemes biosensors integrats. Aquestes plataformes, contribuiran al desenvolupament d'eines de diagnòstic massiu. / Martorell Tejedor, S. (2021). Desarrollo de métodos integrados para la determinación de biomarcadores genéticos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/176006 / TESIS / Compendio

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-11-24. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:32Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00483a.pdf: 1399809 bytes, checksum: db2c4c756807d9d1d5e11ec653e60536 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:33Z : No. of bitstreams: 2 Publico-00483a.pdf: 1399809 bytes, checksum: db2c4c756807d9d1d5e11ec653e60536 (MD5) Publico-00483b.pdf: 1297102 bytes, checksum: 7744b75b0f20f0757254b064592deba6 (MD5) / Introdução: Desde a introdução da terapia antirretroviral altamente ativa, infecções como as que ocorrem pelo vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) passaram a ser tratadas como uma condição crônica manejável e não mais como uma doença fatal. A suspeita de hipersensibilidade é a principal razão para o início da interrupção do abacavir. O desenvolvimento desta hipersensibilidade por pacientes infectados com o vírus HIV ainda não está completamente esclarecido. Testes genéticos que comprovam a presença do alelo HLA-B*57:01 e permitem a exclusão do uso do abacavir por pacientes portadores deste alelo o que têm demonstrado uma diminuição da incidência de hipersensibilidade entre indivíduos portadores deste vírus. Objetivo: Verificar a prevalência do alelo HLA-B*57 e do alelo específico HLA-B* 57:01 nos pacientes HIV positivos em tratamento com antirretrovirais no Estado de Mato Grosso e estabelecer a eficácia do rastreio prospectivo do alelo específico para impedir a reação de hipersensibilidade ao abacavir. Métodos: As genotipagens para a detecção do alelo HLA-B*5701 foram realizadas por PCR-SSP (Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific of Primers) utlilizando um multiplex contendo quatro seqüências dos pares de oligonucleotídios iniciadores. Participaram do estudo 517 pacientes portadores do vírus HIV em tratamento no Centro Estadual de Referência em Média e Alta Complexidade – CERMAC DST/AIDS e/ou encaminhados de outras Unidades de atendimento médico do Estado de Mato Grosso. Resultados: Dos 517 pacientes incluídos no estudo, 385 (74,5%) tiveram resultados de tipagem negativos para o alelo HLA-B*57, 103 (19,9%) foram positivos para este alelo e 29 (5,6%) foram positivos para o alelo específico HLA-B*57:01. Entre os pacientes com resultado negativo para os alelos HLA-B*57 e HLA-B* 57:01, a idade média foi de 40 anos, 205 (53,2%) eram do sexo masculino e 242 (62,9%) eram brancos, já entre os pacientes com resultados positivos para o alelo HLA-B*57, a idade média foi de 38 anos, 47 (45,6%) eram do sexo masculino e 64 (62,1%) eram brancos, enquanto entre os pacientes positivos para o alelo HLA-B*57:01, a idade média foi de 40 anos, 7 (58,6%) eram homens e 15 (57,7%) eram brancos. O medicamento abacavir estava presente no tratamento de 68 pacientes avaliados durante o período do estudo e o alelo HLA-B*57:01 alelo estava presente em 7 (10,3%) destes. Reações de hipersensibilidade foram diagnosticadas em quatro destes pacientes, com uma incidência estatisticamente significativa (p <0,001). Conclusões: O rastreamento do alelo HLA-B*57:01 pode reduzir o risco de hipersensibilidade ao abacavir. Nossos resultados demonstram que testes de biologia molecular podem ser usados para prevenir os efeitos tóxicos de determinadas drogas. / Hypersensitivity reaction to abacavir is strongly associated with the presence of the HLA-B*57:01 allele. This study was designed to establish the prevalence of HLA-B*57:01 among HIV-1 infected individuals in Brazil. A total of 517 consecutive outpatient’s clinics of the State Reference Center in High and Medium Complexity - CERMAC and forwarded to other medical care unit of the Mato Grosso State were followed in this study from february 2008 through july 2010. The presence of HLA-B*57:01 was determined by Nested-PCR with HLA-B*57 and HLA-B*57:01 sequence-specific primers (PCR-SSP). A total of 517 patients were enrolled and randomly assigned to a study group. Of these, 385 (74.5%) were negative for HLA-B*57; 103 (19.9%) were positive for HLA-B*57 and 29 (5.6%) were positive for HLA-B*57:01. Of the HLA-B*57 and HLA-B*57:01 negative patients, the median age was 40 years; 205 (53.2%) were male sex and 242 (62.9%) were Caucasians. Among the patients positive for allele HLA-B*57, the mean age were 38 years; 47 (45.6%) were male sex and 64 (62.1%) were Caucasians. Of the patients positive for allele HLA-B*57:01, the median age was 40 years; 17 (58.6%) were men and 15 (57.7%) were caucasian. An abacavir containing regimen was administerede to 68 patients during the study period, the HLA-B*57:01 alelle was found in 7 (10.3%) of these and the in Hypersensitivity reaction was clinically diagnosed in 4 of these patients, with a statistically significant incidence (p<0.001). / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Strangles is considered the main respiratory disease in horses. The etiologic agent is the bacterium Streptococcus equi subsp. equi (S. equi), responsible for approximately 30% of horse diseases worldwide notifications. The clinical signs of strangles are fever, nasal secretion and lymph node enlargement. The last one occurs due the incomplete phagocytosis of S. equi by defense cells because bacterial hyaluronic acid capsule and M protein (SeM). The epidemiology, the risk factors and the strangles control are poorly understood. The 5' end of the seM gene sequence has been used for isolate differentiation by characterization of the alleles. Therefore, this thesis aimed to study the prevalence of Streptococcus equi subsp. equi (S. equi) in healthy horses, the alleles frequency and the risk factors involved on equine adenitis. One thousand and ten nasal swabs were obtained from healthy horses from 341 farms. Twenty four horses were positive for S. equi, confirmed by PCR and DNA sequencing. The prevalence of S. equi per equine was 2.37%, and 20 farms were positive (5.86%). Risk factor analysis showed by confirming and quantifying statistically that: the number of agglomeration events that horses participate (RR: 1.6), the situation with food container shared (RR: 3.74) and the positive diagnosis for adenitis (RR: 3.20) are significant risk factors for Strangles. These results provide important epidemiological contribution to the equine industry and can give support for the disease control. In addition, the 5 'end of the gene seM was amplified by PCR and sequenced and allele characterized. It was found the same allele (SEM-61) in all the samples. These results support the hypothesis of natural selection of alleles apparently more suited to survive, persist and perpetuate in the population studied. / A adenite equina é uma doença infecto-contagiosa que acomete o trato respiratório superior, sendo uma das principais doenças respiratórias de equinos. O agente etiológico dessa enfermidade é o Streptococcus equi subespécie equi (S. equi), responsável por aproximadamente 30% das notificações em todo o mundo. Os principais sinais clínicos da adenite são febre, secreção nasal e enfartamento de linfonodos, que ocorre pela dificuldade de fagocitose do S. equi por células de defesa devido a presença da cápsula de ácido hialurônico e proteína M. O entendimento sobre a epidemiologia, a análise de fatores de risco para adenite equina e o controle dessa enfermidade ainda são limitados. Estudos moleculares demonstram diferenças na extremidade 5 da sequência do gene (seM) codificador da proteína M de S. equi. Esta região do gene já foi utilizada na diferenciação de isolados por meio da caracterização de diferentes alelos. Por tudo isso, essa tese objetivou obter resultados de prevalência, e também análise de fatores de risco para adenite equina através de um desenho experimental para coleta de suabes nasais. Foram obtidos 1.010 suabes nasais de equinos sadios em 341 fazendas, de onde foram identificados 24 equinos positivos para S. equi em isolamento, que posteriormente foram confirmados por PCR e sequenciamento de DNA. A prevalência estimada por equino foi de 2.37%, e 20 fazendas foram consideradas positivas (5.86%). Na análise de fatores de risco, foi comprovado e quantificado estatisticamente que: número de eventos de aglomeração que os equinos participam (RR:1.06), o ato de compartilhar recipiente de alimento (RR:3.74) e ter tido diagnóstico positivo para adenite (RR:3.20) são fatores de risco relevantes para adenite equina. Estes resultados oferecem contribuições epidemiológicas importantes para a indústria de equinos e pode apoiar o controle da doença. Em paralelo, a região 5 terminal do gene seM das 24 amostras positivas foi amplificada por PCR e sequenciada para caracterização de alelos, sendo identificado o mesmo alelo (seM-61) em todas as amostras. Esses resultados evidenciam a hipótese de seleção natural de alelos aparentemente mais adaptados a sobreviver, persistir e se perpetuar na população estudada.