The presented diploma thesis focuses on the use of plant growth promoting bacteria as an ecological alternative to conventional fertilizers. The incorporation of bacterial cells into hydrogel carriers is already a well-studied topic, but due to its disadvantages it has not yet found wider application in agriculture. This work offers a novel concept of encapsulating bacteria by gelation directly from the culture. This is achieved by crosslinking the bacterial alginate produced by the model microorganism Azotobacter vinelandii. Since this process was not described before, first its optimization was needed. Alginate production was determined gravimetrically, and its parameters were further characterized using available analytical methods – infrared spectroscopy to monitor structural parameters (monomer composition and the extent of acetylation), dynamic light scattering to characterize the size distribution and AF4-MALS-dRI to obtain the molecular weight. Bacterial PHB production was also investigated using gas chromatography and infrared spectroscopy. The second part of the work is focused on the optimization of the gelling process using bacterial alginate from the culture and CaCl2 as a crosslinking agent. Rheological experiments were used as a tool in understanding the viscoelastic properties of the prepared gels. Gelation was demonstrated within the first day after inoculation. Maximum production of alginate (1,9 ± 0,3) g/l was reached on the fourth day after inoculation. It was found that the addition of 5 g/l of calcium carbonate promotes the production of alginate. Nevertheless, further addition of CaCO3 (30 g/l) showed adverse effects on the molecular weight and is therefore not recommended. Production of PHB was confirmed by both FTIR and GC measurements, with a maximum yield of (23 ± 3) % CDW. Rheological testing confirmed that the product of the crosslinking was a gel. It was found that the crosslinker concentration plays an important role at time 0 min of the gelation, forming a denser network in the structure and causing higher rigidity. Using the highest studied concentration of CaCl2, the critical strain reached values of (5,0 ± 0,7) %. Finally, the incorporation of bacterial cells into the hydrogel was confirmed using fluorescence microscope.

Alginates are (1and4) linked linear copolysaccharides composed of B-D-mannuronic acid (M) and its C-5 epimer, a-L-guluronic acid (G). Several strategies to synthesize organically modified alginate derivatives have been reported, but almost all chemistries are performed in either aqueous or aqueous-organic media. The ability to react alginates homogeneously in organic solvents would open up access to a wide range of new chemistries and derivatives. However, past attempts have been restricted by the absence of methods for alginate dissolution in organic media. We therefore report a strategy to solubilize tetrabutylammonium (TBA) salts of alginic acid in polar aprotic solvents containing tetrabutylammonium fluoride (TBAF). Acylation of TBA-alginate was performed in DMSO/TBAF to get products with DSacetyl up to ~ 1.0. We further report that by using appropriate solvent conditions, placement of acyl groups can be controlled to achieve either random or M-selective substitution. Alginate acetates synthesized in an M-selective fashion were used to study the ability of these derivatives to form Ca-crosslinked hydrogels. Detailed structure-property analyses were performed to identify acetylation reaction conditions and product properties that may be ideal for hydrogel formation. Furthermore, alginate esters were synthesized via modification of carboxylate groups on the backbone. These derivatives dissolved in polar aprotic solvents without the need to add TBAF. A proof of concept study showed their utility in the solubility enhancement of the poorly water soluble flavonoid naringenin. / Ph. D.

Abstract Introduction: Patients with numerous crowns and bridges are at risk of developing secondary caries on cervical margins of the crowns. This recurrent decay accounts for 60% of the reasons for the replacement of restorations. Detection and treatment of subclinical lesions is important to prevent cavitation. An alginate impression material has been used to locate cariogenic bacteria in established carious lesions. Aims: An alginate impression technique was used to assess the level of Streptococcus mutans and Lactobacilli on the crown margins of the teeth of the restored group and control subjects. Conventional caries activity tests were also used to compare these two groups. Methods: Twenty control group subjects with no crowns and a mean DMFS of 16 and 20 the restored group patients with at least 10 crowns and a mean DMFS of 129 were included in the study. Impressions were taken with a hydrocolloid material mixed with culture broth, incubated and examined for the presence of S. mutans and Lactobacilli on the cervical margins. The results were compared using the two-sample t-test, chi-squared test and a generalized logistic regression analysis. Results: More S. mutans and Lactobacilli were cultured on impressions of the restored group than the control patients (p=0.01 and 0.002). A higher proportion of patients in the restored group had high concentrations of S. mutans and Lactobacilli on their teeth than subjects in the control group (p < 0.001). In the restored group, sixty six per cent of teeth in the posterior and 48% in the anterior segment were crowns. S. mutans and Lactobacilli were found in higher concentrations on the posterior than the anterior teeth of the restored group patients than the control patients (p = 0.016 and 0.047). Furthermore, more Lactobacilli were cultured from the saliva of the restored group than control subjects while the buffering capacity of plaque and the ability of saliva to neutralize acids were lower in the restored group than control group subjects. Conclusion: The impression technique showed that S. mutans and Lactobacilli accumulated in the posterior of the mouth and were associated with crowns indicating these particular sites are at risk.

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The use of polymeric biomaterials in regenerative medicine and drug delivery is a continually growing practice. Alginic acid (alginate) is widely used in these fields because of its beneficial properties from an engineering and mechanical perspective. Still, alginate has not yet been fully investigated from a biological perspective. For disciplines that anticipate in vivo use of their devices, it is crucial to understand the biological interactions between the device and the host. In this project, the in vitro and in vivo immunological effects of alginate are examined in two model systems: one with a protein antigen and one with a xenogeneic cell antigen. The former system is used as a proof of principle study for alginate's immunological effect on simple protein-based systems, similar to those found in protein/drug deli very applications and certain types of vaccines. This model uses bovine serum albumin (BSA) as the protein antigen. The latter system is used to demonstrate alginate's effect on more complex antigens, such as whole cells. Thus, Chinese hamster ovary (CHO) cells are used as the as the cell antigen. This model represents a system that may be found in tissue engineering applications, where whole cells are delivered with a biomaterial scaffold. Antibody production from blood serum indicated that alginate solution has adjuvant abilities while alginate microspheres do not. Thus, alginate solution possesses great potential in the field of vaccines. In addition, in vivo alginate challenges were found to have effects on second-set responses of splenocytes to in vitro alginate and antigen challenges. Splenocytes from alginate-injected mice were overall equally or less responsive to in vitro challenges than splenocytes without previous alginate immunization. Therefore, alginate solution may also have immunosuppressive effects, although the results from this project merely speculate on this possibility. Still, this ability would be helpful in overcoming current transplantation problems as well as certain tissue engineering hurdles. / Thesis / Master of Science (MS)

Les alginates, polysaccharides extraits des algues brunes, sont des copolymères à blocs linéaires formés d'unités mannuronates (M) et guluronates (G). Leur structure dépend de la source naturelle. La complexation de cations divalents ou trivalents (sauf Mg2+) par les fonctions carboxylates conduit à la formation d'un hydrogel. Pour approfondir l'étude de la formation des gels ionotropiques d'alginate, des hydrogels et des aérogels séchés en conditions supercritiques ont été caractérisés à plusieurs échelles par différentes techniques. L'analyse orbitalaire ab initio de petits complexes a montré la formation de liaisons covalentes fortes avec les métaux de transition alors que les alcalino-terreux ne mettent en jeu que des interactions électrostatiques. Selon le rapport M/G et la nature des cations, différents régimes structuraux ont pu être identifiés par des mesures SAXS (~10-200Å) : des gels fibrillaires ou formés d'agglomérats interconnectés. Les propriétés mécaniques des hydrogels et les surfaces spécifiques des aérogels correspondants sont directement reliées à ces morphologies. La présence simultanée de plusieurs métaux dans les gels peut induire des effets coopératifs dans la formation mais aussi dans les propriétés des matériaux. De nouvelles méthodes ont été mises au point pour contrôler la synthèse de gels hétéro-cationiques, en considérant les effets d'affinité.Sur la base de cette étude, des synthèses originales de matériaux fonctionnels nano-structurés ont été développées. Certains ont été construits directement dans le réseau d'alginate en exploitant les cations de gélification ; d'autres ont nécessité le sacrifice de la matrice pour former des oxydes simples ou mixtes nanocristallins. / Alginates, polysaccharides produced by brown algae, are linear block-copolymers formed by mannuronate (M) and guluronate (G) units. Their structure depends on the natural source. The coordination of divalent or trivalent cations (except Mg2+) with the carboxylate functions leads to the formation of a hydrogel. In order to get some insight in ionotropic alginate gel formation, hydrogels and supercritical dried aerogels were analysed through various characterizations at different scales. The ab initio molecular orbital analysis on small complexes revealed strong coordination-covalent bonds in the transition metal complexes, whereas only ionic interaction occurs between the alkaline-earth cations and the carboxylates. Depending on the M/G ratio and the nature of the cation, different structural regimes were identified by SAXS analysis (~10-200Å) : well-defined fibrillar gels or gels with multiple junction nature. The mechanical properties of the hydrogels and surface areas of the resulting aerogels are directly related to these morphologies. The concomitant presence of different metals in the gel can bring cooperative effect for the formation but also for the properties of the materials. New methods to control the synthesis of hetero-cationic gels were implemented, taking into account the affinity effects. On the basis of this study, we developed new nanostructured functional materials synthesis. Some were built directly in the alginate network using the gelling cations. Others needed to sacrifice the matrix to form nanocrystalline single or mixed oxides.

Les biofilms sont des édifices macromoléculaires qui résultent de l'adhérence de microorganismes à une surface. Ils sont constitués de cellules enchâssées dans un réseau d'exopolymères d'origine biologique qui forment une matrice extracellulaire. Les biofilms posent des problèmes technologiques et sanitaires dans de nombreux domaines, aussi bien agroalimentaire, médical, ou industriel. Comprendre les mécanismes de formation de ces structures est donc un enjeu majeur. Malgré une grande diversité de la structure des biofilms, de grands principes semblent en régir la composition. Ainsi, la présence de polysaccharides comme l'alginate et la cellulose joue un rôle majeur dans leur formation et dans la définition de leurs propriétés mécaniques. Si la présence de polymères protéiques comme les fibres amyloïdes semble avoir un caractère universel au sein des biofilms, leur rôle dans la formation de la matrice et dans ses propriétés mécaniques restait à définir. Lors de cette étude, nous avons caractérisé la structure et la composition de trois biofilms monobactériens issus de trois espèces différentes P. aeruginosa NK 125502, S. enterica CIP 58.58 et S. epidermidis CIP 53.124. Nous avons décrit la formation de fibres amyloïdes par différents peptides issus de protéines bactériennes impliquées dans la formation de biofilm et montré par différentes techniques qu'ils sont capables de former des fibres amyloïdes. Nous avons notamment identifié un peptide amyloïde, suggérant la présence de ce type de fibre au sein des biofilms de Staphylococcus, mais aussi plus généralement dans les biofilms des espèces exprimant une protéine de type Bap (Biofilm associated protein). Enfin, nous avons analysé les propriétés mécaniques de différentes matrices synthétiques à base d'alginate et de méthyl-cellulose, en présence et en absence de protéines et de peptides amyloïdes afin de mieux comprendre l'apport qu'a ce type de fibre sur les propriétés de ces structures. Ainsi, les fibres amyloïdes modifient les propriétés mécaniques des gels synthétiques, permettant d'augmenter la déformation sous contrainte. En conclusion, ce travail apporte de nouveaux éléments pour la compréhension du rôle des fibres amyloïdes dans le renforcement de la matrice du biofilm. La capacité à former des fibres amyloïdes par un peptide issu de la protéine Bap de S. epidermidis suggère que cette propriété est plus largement présente au sein de cette famille de protéines. Les travaux menés au cours de cette thèse, et l'ensemble des techniques utilisées, avec notamment la mise au point de l'observation de la biréfringence du rouge Congo par microscopie confocale permettront de développer les études sur cette famille de protéines amyloïdes ainsi que sur les matrices complexes de type biofilm / Biofilms are macromolecular structures which result from the adhesion of microorganisms to a surface. They consist of cells embedded in a network of exopolymers of biological origin which form an extracellular matrix. Biofilms pose technological and health problems in many industrial and medical domains. Understanding the mechanisms of formation of these structures is a major challenge. Despite a great diversity in the structure of biofilms, universal principles seem to govern their composition. Thus, the presence of polysaccharides such as alginate and cellulose plays a major role in their formation and in determining their mechanical properties. If the presence of protein polymers such as amyloid fibers seems to be universal within biofilms, their role in the formation and in the mechanical properties of the matrix remains to be defined. In this study, we characterized the structure and composition of monobacterial biofilms from three different species: P. aeruginosa NK 125502, S. enterica CIP 58.58 and S. epidermidis CIP 53124. We described the formation of amyloid fibers by different peptides from proteins involved in bacterial biofilm formation. Morover our results suggest the presence of this type of fiber within biofilms of Staphylococcus, but also more generally in biofilms of bacteria expressing a protein of the Bap family (Biofilm associated protein). Finally, we analyzed the mechanical properties of various synthetic matrices made of alginate and methyl-cellulose in the presence and absence of protein and amyloid peptides in order to better understand the contribution of this type of fiber on the properties of these matrices. Hence, amyloid fibers modify the mechanical properties of synthetic gels, by increasing the deformation under stress.In conclusion, this study provides new evidence for understanding the role of amyloïd fibers in the biofilm matrix strengthening. The formation of amyloid fibers by the Bap protein of S. epidermidis suggests the possibility of a general amyloid behavior in the Bap protein family. A new application of confocal laser scanning microscopy was developped: the use of the confocal microscope to image the birefringence of Congo red.

La fonctionnalisation des biomatériaux est une stratégie probante et prometteuse développée pour favoriser l’intégration de biomatériaux dans un organisme vivant. Le dépôt de films multicouches de polyélectrolytes est une méthode de fonctionnalisation de surfaces particulièrement adaptée au recouvrement d’implants. Ces surfaces modifiées pourront ainsi interagir avec leur environnement biologique. Au cours de ce travail de thèse, nous avons développé un nouveau revêtement, à base de composés naturels, capable de recouvrir plusieurs types de surfaces. De plus, ces revêtements originaux peuvent être utilisés pour orienter certains phénomènes cellulaires. Dans la première partie de ce travail de thèse, nous avons mis au point un nouveau système de films multicouches à base de collagène et d’alginate. La réticulation chimique avec la génipine, un agent naturel d’origine végétale (Gardenia Jasminoide), stabilise ces constructions pour une utilisation en conditions physiologiques. Les études d’adhérence et de prolifération de cellules endothéliales humaines ont montré que ces revêtements à base de constituants naturels sont des supports adéquats en vue d’applications biomédicales. Nous avons ensuite déposé des films collagène/alginate sur des implants en titane précédemment recouvert d’un gel microporeux en poly(acide lactique). Nous avons pu montrer que les films collagène/alginate favorisent la prolifération de cellules épithéliales, ce qui permettrait une meilleure intégration des implants. Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons développé une technique permettant d’obtenir des revêtements et des membranes à base de films multicouches collagène/alginate ayant des structures fibrillaires orientées. L’alignement fibrillaire s’obtient par simple étirement des substrats élastiques en poly(diméthyl siloxane) (PDMS) sur lesquels sont déposés les revêtements collagène/alginate. La déformation longitudinale du substrat induit un alignement préférentiel des fibrilles de collagène du revêtement. L’étude de l’influence du taux d’étirement sur l’alignement des fibres a montré qu’il était possible de moduler cet alignement. Enfin, nous avons observé que le comportement de différents types cellulaires (fibroblastes et astrocytes) est modifié par l’alignement fibrillaire. On note que les cellules s’alignent dans la même direction que les fibrilles de collagène. A l’évidence, l’organisation fibrillaire du revêtement conditionne la géométrie de l’étalement cellulaire. Les cellules s’allongent lorsque les fibrilles sont alignées. De plus, il apparaît que la direction des divisions cellulaires est guidée par la direction de l’alignement des fibrilles de collagène dans le revêtement étiré. Cela signifie que les cellules sont guidées par les fibrilles de collagène alignées. / Biomaterial functionalization is a promising strategy developed to favor material implantation in a living organism. The deposition of polyelectrolyte multilayer films is a useful functionalization technique to coat implants. These modified surfaces may then interact with their biological environment. In this work, we developed new collagen-based coatings and membranes, able to cover several kinds of substrates. Moreover, these original coatings can either promote cell proliferation or guide cell alignment.In the first part of our work, we developed a new polyelectrolyte multilayer assembly made of collagen and alginate. Chemical cross-linking with a natural agent, genipin (extracted from Gardenia Jasminoide), renders the films stable in physiological conditions. Human endothelial cells adhere and proliferate well on these collagen-based coatings. Then, we functionalized macroporous poly(lactic acid) gels-coated titanium implants with collagen/alginate multilayer films to favor epithelial cell proliferation. We showed that cells adhere and proliferate better on collagen/alginate-coated implants. This shows the potential suitability of collagen/alginate coatings for a better integration of biomaterials.In the second part of our work we developed a new technique in order to align the fibrillar structure of collagen/alginate multilayer films and membranes. The principle is simple and versatile. It consists in stretching collagen/alginate multilayer film coated on PDMS substrates. This longitudinal deformation leads to the alignment of the collagen fibrils in the coating. Cell adhesion and proliferation (fibroblasts, astrocytes) is modified due to fibrils alignment. We showed that cells align along the direction of the collagen fibrils. Obviously, the fibrillar organization of the coatings influences cell adhesion geometry. Cells stretch out along aligned fibrils. Furthermore, it appears that cell divisions direction is guided by the direction of the collagen fibrils alignment in the stretched coatings.

Dans le cas d'une tumeur pancréatique, la chirurgie d'exérèse est le traitement de première intention lorsqu'elle est possible. Les pancréatectomies sont des actes à haut risque, entraînant un taux de morbidité de 50%. L'une des complications les plus graves est l'apparition de fistules pancréatiques (FP) qui surviennent dans 15 à 20 % des cas, pour lesquelles il n'existe aucune solution de prévention. Cette thèse porte sur l'élaboration d'un biomatériau pour la prévention des FP. Le cahier des charges, défini avec l'équipe chirurgicale, nous a orienté vers un dispositif médical sous forme de pansement absorbant, présentant des propriétés mécaniques adaptées, ainsi qu'une résistance aux enzymes pancréatiques serait intéressant. Un biomatériau constitué de deux couches a été imaginé : 1) une matrice absorbante constituée d'un complexe polyélectrolyte (PEC) sous forme de film, 2) une couche supérieure imperméable permettant de limiter la diffusion des enzymes pancréatiques dans le milieu péritonéal ; afin de répondre aux spécifications demandées par l'équipe médicale. La première partie de ce travail a porté sur l'optimisation de la mise en forme de la matrice sous forme de film à partir de PEC d'alginate (ALG) et de chitosane (CHI) présentant différents ratio de polymères (ALG-CHI 50/50 et ALG-CHI 63/37). L'influence de la technique d'homogénéisation des PEC, sous ultra-turrax (UT) ou au Stephan (ST) a été étudiée sur les propriétés physico-chimiques des films obtenus. Les propriétés de biodégradation, de gonflement et de cytotoxicité sont principalement influencées par le ratio des polymères. En revanche, leurs structure et propriétés mécaniques sont essentiellement influencées par la technique d'homogénéisation utilisée lors de l'élaboration du PEC. Au vu de ces résultats, le choix de la matrice au contact de l'anastomose ou de la tranche pancréatique s'est arrêté sur le PEC ALG-CHI 63/37 UT. La deuxième partie de cette thèse a été consacrée à l'incorporation d'une couche imperméable à la surface supérieure du film. Deux polymères ont été testés : l'acide polylactique (PLA) et le polycaprolactone (PCL). Ils ont été incorporés après fonctionnalisation de la surface du film. La matrice ALG-CHI 63/37 UT recouverte de PLA présente une surface plus hydrophobe, des propriétés mécaniques adaptées, une bonne résistance aux enzymes pancréatiques tout en possédant des propriétés de gonflement intéressantes. Le biomatériau ainsi obtenu est un bon candidat qui répond au cahier des charges d'un pansement indiqué pour la prévention des fistules pancréatiques. / Resection surgery is the first-line treatment indicated for pancreatic tumor. The morbidity of this surgery is high with a complication rate around 50%. One of the most serious complications is the occurrence of pancreatic fistula (PF), which occurs in 15-20% of cases. To date, no biomaterial available on the market is indicated for the prevention of the onset of PF following pancreatectomy. This project focuses on the development of a biomaterial for the prevention of PF. Specifications identified by the surgical team oriented us to ward an absorbent dressing with sufficient mechanical properties and pancreatic enzymes resistance. A biomaterial made up of two layers was designed: 1) an absorbent matrix, in the form of a film, constituted by a polyelectrolyte complex (PEC), 2) an impermeable backing layer expected to limit the diffusion of the pancreatic enzymes into the peritoneal medium; to meet surgeons' specifications. The first part of this work focused on the optimization of the preparation of the matrix, composed of alginate (ALG) and chitosan (CHI) PECs films with different polymer ratios (ALG-CHI 50/50and ALG-CHI 63/37). The influence of the technique of homogenization of PEC, ultra-turrax (UT) or Stephan (ST) was studied on the physicochemical properties of the films. Biodegradation, swelling and cytotoxicity were shown to be mainly influenced by the ratio of polymers used. On the other hand, structure and mechanical properties are mainly influenced by the homogenization technique. With these results, the choice of the matrix to pancreatic application was set as the PEC ALG-CHI 63/37 UT. The second part of the present work was devoted to the incorporation of an impermeable backing layer on the upper film surface. Two polymers were evaluated: polylactic acid (PLA) and polycaprolactone (PCL). They were incorporated after the functionalization of the film surface. The PLA-coated ALG-CHI 63/37 UT matrix led to more hydrophobic surfaces, as well as adaptated mechanical properties and resistance to pancreatic enzymes with interesting swelling properties. The obtained biomaterial is a promising candidate responding to the specifications for a dressing indicated for the prevention of PF.

L'étude et le développement des procédés de fabrication de levures immobilisées en vue de la réalisation de fermentations de vins a débuté au milieu des années 80. Malgré les bénéfices potentiels que cette technologie pouvait apporter pour le secteur œnologique, peu de procédés d'immobilisation ont réussi à dépasser l'échelle laboratoire ou pilote et ceux qui sont arrivés à l'échelle industrielle n'ont pas eu le succès désiré pour des questions d'ordre technique ou économique. Le premier objectif de ce travail concerne la mise au point du procédé industriel en insistant sur les aspects les plus sensibles, et qui comme tels ont exigé des études complémentaires. Le deuxième objectif de ce travail vise à caractériser du point de vue cinétique et lorsque possible sensoriel, les fermentations avec les levures immobilisées pour la production de vins effervescents et pour la désacidification biologique de moûts. Le troisième et dernier objectif de ce travail consiste à évaluer l'utilisation de levures immobilisées pour la réalisation de la fermentation alcoolique en continu de moût. Pour cela on a fait appel à des fermenteurs continus à lit fixe et à lit fluidisé. / The study and development of yeast immobilization processes for wine fermentations started in the mid 80’s. Even though this technology could be of great benefit for the oenological sector very few process left the laboratory or pilot scale and those which arrived to industrial scale didn’t have the ambitioned success due to technical or economical constraints. The first goal of this work was to develop an industrial process for yeast immobilisation with emphasis on the most sensitive aspects which required further studies. The second objective of this work was to characterise the fermentation kinetics of immobilised yeasts cells during the production sparkling wines and during the deacidification of grape must. Whenever possible the wines produced were also characterised from a sensorial point of view. The third and last goal was to evaluate the use of immobilised yeast cells for continuous fermentation of grape must. For that we have used continuous fixed bed and fluidized bed fermenters.