Les translocations chromosomiques sont des événements cellulaires rares signatures de nombreux cancers, pouvant mener à l’expression de nouveaux gènes de fusion oncogènes ou à la dérégulation d’un oncogène existant. Cependant, le lien direct entre la formation de translocations et la tumorigenèse n’est pas toujours bien établi. Jusqu’à présent, la modélisation de translocations se limitait principalement à la surexpression du gène de fusion créé. Pour mieux comprendre leur contribution à l’oncogenèse, nous avons développé une nouvelle méthode pour induire des translocations oncogéniques de novo, afin de recréer plus fidèlement les premières étapes de la transformation cellulaire.Pour cela, nous nous appuyons sur la technologie des nucléases artificielles telles que les nucléases à doigt de zinc, les TALEN (TALE Nucleases) et le système CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) pour générer des cassures ciblées de l’ADN et induire la formation de remaniements chromosomiques. Nous nous sommes particulièrement concentrés sur l’induction de la translocation modèle t(2;5)(p23;q32) et du gène de fusion NPM-ALK, associés au Lymphome Anaplasique à Grandes Cellules (ALCL), dans divers modèles cellulaires. Nous avons ainsi mis en évidence des propriétés oncogéniques du gène de fusion NPM-ALK exprimé sous son promoteur endogène suite à la formation du réarrangement chromosomique. Cependant, l’induction de la translocation dans des lymphocytes T primaires suggère que cet événement ne suffit pas à lui seul à initier l’oncogenèse, et nécessite probablement un contexte génétique ou épigénétique favorable. / Chromosomal translocations are signatures of numerous cancers and lead to expression of fusion genes that act as oncogenes. However, the wealth of genomic aberrations found in cancer makes it challenging to assign a specific phenotypic change to a specific aberration. We set out to use genome editing with Zinc Finger Nucleases (ZFN), Tale Effector Nucleases (TALEN), and the CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) to induce de novo specific chromosomal translocations in human cells, thus generating new models to interrogate the contribution of tumor-related translocations in first steps of oncogenesis. We specially focused on Anaplastic Large Cell Lymphoma (ALCL) t(2;5) translocation and NPM-ALK consequent fusion gene. For the first time, we highlighted oncogenic properties for NPM-ALK fusion expressed under endogenous promoter. However, translocation induction in primary T cells suggests that t(2;5) is not sufficient to initiate ALCL oncogenesis, and likely requires favourable genetic or epigenetic or context.

Nutzergenerierte Geodaten werden für viele Anwendungen auch als alternative Quelle zu den amtlichen Daten genutzt. Das wohl populäreste Projekt, das solche Daten sammelt, ist OpenStreetMap (OSM), dessen umfangreiche Datenbank viele Typen geographischer Informationen abdeckt. Mit zunehmender Vollständigkeit werden diese Daten neben praktischen Anwendungen (Visualisierung, Routing, etc.) auch für die Beantwortung raumwissenschaftlicher Fragestellungen interessant. Das Leibniz-Institut für ökologische Raumentwicklung (IÖR) beschäftigt sich beispielsweise seit Jahren mit der Erfassung und Analyse der gebäudebasierten Siedlungsstruktur. Inwiefern der Gebäudedatenbestand von OSM für kleinräumige Analysen der Siedlungsstruktur genutzt werden kann, war bisher offen und wird mit dieser Studienarbeit, gemeinsam betreut von IÖR und dem Institut für Kartographie (TU-Dresden), beantwortet. In der Arbeit erfolgt ein quantitativer Vergleich der Gebäudedaten aus der OSM-Datenbank der mit Gebäudedaten der amtlichen Vermessung, im speziellen der Amtlichen Liegenschaftskarte (ALK) und des Amtlichen Topographisch-Kartographischen Informationssystems (ATKIS). Das Hauptaugenmerk liegt hierbei auf der Untersuchung von Gebäudepolygonen hinsichtlich der Vollständigkeit und Qualität der Gebäudepolygone. Im Rahmen einer Vollständigkeitsanalyse werden verschiedene Bezugsflächen verwendet, auf denen die vergleichenden Ergebnisse visualisiert werden. Für den objektbezogenen Vergleich zwischen den amtlichen und den freien Geodaten werden verschiedene Verschneidungsmethoden herausgearbeitet und hinsichtlich ihrer Aussagekraft bewertet. Stellvertretend für den Gesamtdatenbestand von Deutschland, wurde die Analyse auf ausgewählte Untersuchungsgebiete angewendet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Gebäudedaten des OSM-Projektes noch starke Defizite aufweisen, was die Vollständigkeit und die Lagegenauigkeit anbelangt. Unterschiede zeigen sich vor allem hinsichtlich der Gebäudevollständigkeit zwischen Agglomerationsräumen und ländlichen Regionen, die hauptsächlich auf unterschiedlich ausgeprägte Kartieraktivitäten der OSM-Datenerfasser zurückzuführen ist.:Zusammenfassung ............................................................................ i Abstract ............................................................................................ ii Abbildungsverzeichnis ...................................................................... v Tabellenverzeichnis .......................................................................... vi Abkürzungsverzeichnis ..................................................................... vii 1. Einleitung ...................................................................................... 1 1.1. Motivation der Arbeit .................................................................. 1 1.2. Aufbau der Arbeit ....................................................................... 2 2. Theoretischer Teil .......................................................................... 3 2.1. Web 2.0 und nutzergenerierte (Geo)Daten ................................ 3 2.2. OpenStreetMap Projekt .............................................................. 5 2.3. Qualitäts- und Vollständigkeitsuntersuchungen ......................... 8 3. Methodischer Teil ........................................................................... 14 3.1. Daten, deren Formate und Aufbau ............................................. 14 3.1.1. Amtliche Geodaten – Gebäudedaten aus ATKIS und ALKIS ..... 14 3.1.2. Nutzergenerierte Geodaten – OSM .......................................... 16 3.2. Eingesetzte Software für die Datenaufbereitung ........................ 20 3.3. Konzept der Vollständigkeitsanalyse .......................................... 22 3.3.1. Bezugsflächen ......................................................................... 22 3.3.2. Ansätze auf Basis von Bezugsflächen ...................................... 26 3.3.2.1. Gebäudeanzahl ..................................................................... 26 3.3.2.2. Flächenbilanz ........................................................................ 27 3.3.3. Objektbezogener Vergleich zweier Datensätze ....................... 27 3.3.3.1. Centroid-Methode ................................................................. 29 3.3.3.2. Überdeckungsgrad-Methode ................................................. 30 3.4. Nutzungsinformationen ............................................................... 31 3.4.1. Attributinformationen aus OSM ................................................ 31 3.4.2. Attributinformationen aus amtlichen Daten .............................. 32 3.4.3. Möglichkeit zur Analyse von Attributinformationen ................... 33 4. Praktischer Teil ............................................................................... 35 4.1. Untersuchungsgebiete ................................................................ 35 4.2. Benutzte Datensätze .................................................................. 38 4.2.1. Referenzdatensatz Nordrhein-Westfalen ................................. 38 4.2.2. Referenzdatensatz Sachsen .................................................... 39 4.2.3. Vergleichsdatensatz OSM ......................................................... 39 4.2.4. Bezugsflächen .......................................................................... 41 4.3. Vorverarbeitung .......................................................................... 42 4.4. Bearbeitungsschritte der Vollständigkeitsanalyse ....................... 44 4.4.1. Auf Basis von Bezugsflächen..................................................... 44 4.4.2. Objektbezogen ......................................................................... 50 4.5. Ergebnisse .................................................................................. 54 4.5.1. Überblicklicher Vergleich ........................................................... 54 4.5.2. Vergleich von Anzahl und Fläche auf Basis von Bezugsflächen 57 4.5.3. Objektbezogener Vergleich ...................................................... 59 4.5.3.1. Centroid-Methode ................................................................. 60 4.5.3.2. Überdeckungsgrad-Methode ................................................. 61 4.5.4. Zusammenfassender Vergleich nach Untersuchungsgebieten ..63 4.5.5. Visualisierungsoptionen ........................................................... 64 4.6. Auswertung und Ergebnisse der Attributanalyse ........................ 66 5. Zusammenfassung ......................................................................... 69 5.1. Fazit ............................................................................................ 69 5.2. Ausblick ....................................................................................... 71 Literaturverzeichnis ............................................................................ ix Anhang ............................................................................................... xv / User-generated geodata is used in various applications as an alternative solution to the authorative data source. The most popular project, collecting this kind of data, is OpenStreetMap (OSM). A lot of different types of geographical information are covered in this database. In fact of the increasing level of completeness, this data becomes besides practical cases (visualization, routing, etc.) more and more important for answering questions in spatial science. For many years the Leibniz Institute of Ecological Urban and Regional Development (IOER) deals with the analysis of the building related settlement structure. In what way the building data from OSM could be used for small-scale settlement structure analyses is open. This research paper, supervised by the IOER and the Institut of Cartography (TU Dresden), will answer this questions. This student research paper deals with the quantitative comparison between building data from the OSM-database and the authorative building data from the surveying authorities, especially the automated real estate map (ALK) and the Authorative Topographic-Cartographic Information System (ATKIS). The focus of this work is on the analysis of the polygons of buildings. They are examined according to their completeness and their positional consistency. As part of the analysis of completeness, several reference planes are used to visualize the comparative results. Within the geometrical comparison of buildings between authoritative and free geological data different intersection methods are applied and compared according to their significance. The anaylsis was implemented in selected investigation areas, representative for the german nationwide data set. The results illustrate a deficit in the field of building data from OSM, regarding to completeness and positional correctness. Main differences appear especially between urban agglomeration and rural areas. This could be explained by the different mapping behaviour of the members or the therefore required underlying data.:Zusammenfassung ............................................................................ i Abstract ............................................................................................ ii Abbildungsverzeichnis ...................................................................... v Tabellenverzeichnis .......................................................................... vi Abkürzungsverzeichnis ..................................................................... vii 1. Einleitung ...................................................................................... 1 1.1. Motivation der Arbeit .................................................................. 1 1.2. Aufbau der Arbeit ....................................................................... 2 2. Theoretischer Teil .......................................................................... 3 2.1. Web 2.0 und nutzergenerierte (Geo)Daten ................................ 3 2.2. OpenStreetMap Projekt .............................................................. 5 2.3. Qualitäts- und Vollständigkeitsuntersuchungen ......................... 8 3. Methodischer Teil ........................................................................... 14 3.1. Daten, deren Formate und Aufbau ............................................. 14 3.1.1. Amtliche Geodaten – Gebäudedaten aus ATKIS und ALKIS ..... 14 3.1.2. Nutzergenerierte Geodaten – OSM .......................................... 16 3.2. Eingesetzte Software für die Datenaufbereitung ........................ 20 3.3. Konzept der Vollständigkeitsanalyse .......................................... 22 3.3.1. Bezugsflächen ......................................................................... 22 3.3.2. Ansätze auf Basis von Bezugsflächen ...................................... 26 3.3.2.1. Gebäudeanzahl ..................................................................... 26 3.3.2.2. Flächenbilanz ........................................................................ 27 3.3.3. Objektbezogener Vergleich zweier Datensätze ....................... 27 3.3.3.1. Centroid-Methode ................................................................. 29 3.3.3.2. Überdeckungsgrad-Methode ................................................. 30 3.4. Nutzungsinformationen ............................................................... 31 3.4.1. Attributinformationen aus OSM ................................................ 31 3.4.2. Attributinformationen aus amtlichen Daten .............................. 32 3.4.3. Möglichkeit zur Analyse von Attributinformationen ................... 33 4. Praktischer Teil ............................................................................... 35 4.1. Untersuchungsgebiete ................................................................ 35 4.2. Benutzte Datensätze .................................................................. 38 4.2.1. Referenzdatensatz Nordrhein-Westfalen ................................. 38 4.2.2. Referenzdatensatz Sachsen .................................................... 39 4.2.3. Vergleichsdatensatz OSM ......................................................... 39 4.2.4. Bezugsflächen .......................................................................... 41 4.3. Vorverarbeitung .......................................................................... 42 4.4. Bearbeitungsschritte der Vollständigkeitsanalyse ....................... 44 4.4.1. Auf Basis von Bezugsflächen..................................................... 44 4.4.2. Objektbezogen ......................................................................... 50 4.5. Ergebnisse .................................................................................. 54 4.5.1. Überblicklicher Vergleich ........................................................... 54 4.5.2. Vergleich von Anzahl und Fläche auf Basis von Bezugsflächen 57 4.5.3. Objektbezogener Vergleich ...................................................... 59 4.5.3.1. Centroid-Methode ................................................................. 60 4.5.3.2. Überdeckungsgrad-Methode ................................................. 61 4.5.4. Zusammenfassender Vergleich nach Untersuchungsgebieten ..63 4.5.5. Visualisierungsoptionen ........................................................... 64 4.6. Auswertung und Ergebnisse der Attributanalyse ........................ 66 5. Zusammenfassung ......................................................................... 69 5.1. Fazit ............................................................................................ 69 5.2. Ausblick ....................................................................................... 71 Literaturverzeichnis ............................................................................ ix Anhang ............................................................................................... xv

Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) was discovered in 1994, as a chromosomal translocation, t(2;5)(p23;q35), often seen in Anaplastic Large Cell Lymphomas (ALCL). Since then ALK has been extensively studied in this disease as well as in different model organisms. Due to its expression pattern within the central and peripheral nervous system ALK has been implicated in neuronal development. This hypothesis has been further strengthened by studies from Drosophila which have shown Alk to have an important role in optic lobe development. A recently described ALK mouse knockout model do not indicate an essential role for ALK in development, although a potential role within the central nervous system was strengthened. This since ALK-/- animals has an increased number of progenitor cells in the hippocampus and display altered behavior. The overall aim of the studies included in this thesis was to elucidate the function of ALK in the mouse. As a first step toward this goal we conducted an analysis of ALK mRNA and protein expression patterns during development. The strong expression of ALK in neuronal structures supports a role for ALK in neuronal development during embryogenesis. To further investigate the function of ALK in a physiological context we have developed two different ALK knockout strains, the ALK Kinase knockout (KO) and the ALK exon1 KO. The only visible phenotype in these strains is a reduction of total body weight which is apparent in the ALK-/- population when compared to wild type littermates. This size difference seems to take place after birth and is not due to an alteration in food consumption. We have also extensively studied the ALK Kinase KO with respect to gross development, the gastrointestinal canal and the olfactory system. ALK displays a very distinct expression pattern within the gastrointestinal canal being confined to enteric neuron precursors during embryogenesis and enteric nerves in the adult tissue. From these studies we conclude that ALK is not needed for development and viability in mice although it does play a role in regulation of body weight via a presently unknown mechanism. In addition, we have investigated the relationship between the Drosophila and mouse ALK receptor by examining the ability of the Drosophila Alk ligand Jelly-Belly, Jeb, to activate mouse ALK. Using different in vivo and in vitro techniques, we have shown that activation of mouse ALK cannot be accomplished by Drosophila Jeb. From this study we draw the conclusion that during development ligands for the Drosophila and mouse ALK has diverged to a level at which they can no longer substitute for each other.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22729号 / 医博第4647号 / 新制||医||1046(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 武藤 学, 教授 伊達 洋至, 教授 小川 誠司 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Le gène ALK code pour un récepteur à activité tyrosine kinase exprimé principalement dans le système nerveux central et périphérique au cours du développement chez le mammifère. Ces informations font suspecter un rôle développemental du récepteur ALK bien que ses fonctions précises ne sont pas connues. De la même manière, ses ligands et les voies de signalisation qui lui sont associés demeurent mal caractérisés. En 2008, des mutations ponctuelles du gène ALK ont été identifiées dans des formes sporadiques et familiales de neuroblastome. Deux hotspots de mutation sont situés dans le domaine tyrosine kinase. Ces travaux de thèse ont permis d’étudier l’implication du gène ALK dans l’oncogenèse du neuroblastome sous des aspects cellulaires, génomiques et fonctionnels. L’étude de la régulation de l’activation et de l’adressage de la protéine ALK a révélé qu’à la différence des récepteurs sauvages, l’activation constitutive conduit à une rétention intracellulaire associée à une maturation incomplète des récepteurs mutés. Par ailleurs, la caractérisation complète du locus ALK dans le neuroblastome a mis en évidence une fréquence élevée de réarrangements chromosomiques. Ce travail a notamment identifié un réarrangement chromosomique conduisant à l’expression d’un variant du récepteur ALK tronqué pour une partie du domaine extracellulaire. Ce variant, associé à l’agressivité tumorale, est activé de façon constitutive et présente des propriétés oncogéniques. Enfin, l’analyse de souris knock-in exprimant les mutations AlkF1178L et AlkR1279Q a révélé un rôle majeur du gène Alk dans le développement du système nerveux sympathique. En effet, ces souris présentent une hyperplasie des ganglions sympathiques mise en place chez l’embryon et associée à une augmentation de la prolifération cellulaire à la naissance. Ce travail a aussi mis en évidence la coopération oncogénique in vivo entre les mutations du gène Alk et la surexpression du gène MYCN dans le neuroblastome. Les tumeurs générées chez les souris partageant ces deux altérations se développent après une courte période de latence et avec une pénétrance complète. L’analyse des tumeurs a mis en évidence des propriétés conférées aux tumeurs par les mutations du gène Alk. En effet, ces tumeurs expriment des marqueurs cholinergiques et montrent des signes de différenciation. Ces animaux permettent de mieux comprendre le rôle du gène ALK dans l’oncogenèse du neuroblastome et constituent de bons modèles d’étude préclinique des neuroblastomes dépendants de ALK. / The ALK protein is a receptor tyrosine kinase mainly expressed in the central and peripheral nervous system during the development in mammals. These informations suggest that the ALK receptor might have a developmental role even though its functions remain unknown. Ligands and signaling pathways associated to this receptor are also poorly characterized. In 2008, point mutations of the ALK gene have been identified in sporadic and familial cases of neuroblastoma with two main hotspots of mutation in the kinase domain. This thesis project allowed to study the involvement of the ALK gene in neuroblastoma oncogenesis under cellular, genomic and functional aspects.The study of ALK protein activation and subcellular localization revealed that the constitutive activation of the kinase domain lead to an intracellular retention and to a lack of glycosylation. The genomic characterization of the ALK locus pointed out the high frequency of chromosomal rearrangements in neuroblastoma cell lines. This work notably identified the expression of a chromosomal rearrangement leading to a truncated protein variant of ALK lacking a part of the extracellular domain. This variant, associated with the tumoral aggressiveness, is constitutively activated and harbor oncogenic properties. Finally, the analysis of the knock-in mice expressing the two AlkF1178L and AlkR1279Q mutations demonstrated that the ALK gene has a key role in the regulation of the developing sympathetic nervous system. Indeed, these mice have an hyperplasia of sympathetic ganglia set up during embryogenesis and associated with an increased neuroblast proliferation at birth. This work also described the oncogenic cooperation between ALK mutations and MYCN overexpression in neuroblastoma. Tumors, generated in mice sharing those two alterations, arise with a full penetrance and a short latency. Histological and transcriptomic analysis of tumors identified specific properties provided by ALK mutations. Indeed, these tumors express cholinergic markers and harbor signs of differentiation. Those animals allow to better understand the role of the ALK gene in neuroblastoma oncogenesis and constitute good preclinical models for ALK dependant neuroblastoma.

Les cellules tumorales circulantes (CTC) représentent un large champ de recherche susceptible de fournir des informations tant cliniques que fondamentales. Les CTC proviennent de tumeurs primitives ou métastatiques et représentent une population hétérogène de cellules très rares dans le flux sanguin. Leur caractérisation moléculaire est un défi technologique qui requiert des méthodes très sensibles et spécifiques. Dans les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC), les CTC ont un véritable intérêt car les biopsies tumorales ne permettent pas toujours de réaliser les analyses moléculaires nécessaires au choix du traitement. De plus, elles ne sont probablement pas représentatives de l’hétérogénéité tumorale.L’objectif de ma thèse a été de rechercher dans les CTC de patients atteints de CBNPC porteurs du remaniement de gène ALK, des anomalies génomiques connues pour être des biomarqueurs de sensibilité et de résistance aux thérapies ciblant cet oncogéne, ainsi qu’à caractériser les CTC porteuses de ces anomalies. La première partie du projet a consisté au développement d’une méthode d’hybridation in situ de l’ADN (fluorescent in situ hybridization, FISH) adaptée à un système d’enrichissement des CTC par filtration, la FA-FISH (filter adapted FISH) (brevet PCT/FR2011/052688). Nous avons ensuite développé une approche de microscopie semi-automatisée permettant la digitalisation et l’analyse de ces CTC enrichies par filtration (Pailler, BMC Cancer, 2016). Dans la seconde partie du projet, nous avons mis en œuvre cette méthode et montré pour la première fois qu’il est possible d’identifier le remaniement de gène ALK dans les CTC de patients porteurs de ce réarrangement dans la tumeur (Pailler, J Clin Oncol, 2013). Les CTC remaniées présentent un unique réarrangement de type break-apart, y compris chez des patients présentant exclusivement une autre forme de réarrangement dans la tumeur, et un phénotype mésenchymateux. Cette observation nous a amené à émettre l’hypothèse que ces CTC ont acquis des propriétés migratoires et d’invasivité, et pourraient résulter d’une forte sélection clonale. Nous avons ensuite étendu cette observation aux patients porteurs du remaniement ROS1 et rapporté pour la première fois la détection de ce remaniement dans des CTC (Pailler, Ann Oncol, 2015). Dans la troisième partie du projet, nous avons émis l’hypothèse que certaines sous-populations de CTC anormales pour le gène ALK, mesurées avant et à deux mois de traitement par le crizotinib, pourraient prédire l’évolution clinique des patients traités. Dans une cohorte élargie de patients, nous avons montré que l’évolution sous crizotinib du nombre de CTC présentant exclusivement des gains de copies natives du gène ALK est un biomarqueur « surrogate » d’efficacité du traitement pouvant permettre d’identifier les patients qui ont un risque élevé de progresser rapidement (Pailler, soumis). Finalement, dans la quatrième partie du projet, nous avons recherché dans des CTC des mutations de résistance aux inhibiteurs de ALK. Nous avons mis au point des technologies permettant de caractériser phénotypiquement, isoler et analyser moléculairement (séquençages ciblés et d’exomes) des CTC à l’échelle de cellule unique. Les expériences sur lignées cellulaires ont permis de valider les approches et les analyses d’échantillons de patients sont en cours.Dans ce travail, nous montrons qu’il est possible de caractériser des anomalies génomiques dans les CTC de patients porteurs du remaniement ALK à différentes étapes de leur maladie, et ainsi d’identifier des biomarqueurs de sensibilité et d’efficacité à une thérapie ciblée. Ce travail ouvre des perspectives sur la personnalisation des traitements qui pourraient reposer sur l’analyse génomique non invasive des CTC. Il apporte en outre des éléments nouveaux sur les caractéristiques biologiques des CTC chez ces patients, certaines étapes du processus métastatique et la diversité génomique de ces cancers. / Circulating tumor cells (CTCs) are a broad field of research which may provide both clinical and basic information. CTCs migrate from primitive or metastatic tumors and represent a heterogeneous population of very rare cells in the blood stream. The molecular characterization of CTCs is a technical challenge requiring highly sensitive and specific methods. Because tumor biopsies are invasive and in some cases associated with risk in non-small-cell lung cancer (NSCLC), CTCs may offer an attractive option to analyze tumor genomic alterations and detect molecular biomarkers. CTCs could provide a more comprehensive picture of the tumor content than single tumor biopsies.The aim of my thesis was to characterize genomic abnormalities in CTCs from ALK-rearranged NSCLC patients and identified biomarkers of sensitivity and resistance to targeted therapies. The first part of the project consisted in the development of a fluorescent in situ hybridization (FISH) method adapted to CTCs enriched by filtration, the FA-FISH (filter-adapted-FISH) (patent PCT/FR2011/052688). Then, we developed a method for the semi-automated microscopy of filtration enriched CTCs (Pailler, BMC Cancer, 2016). In the second part of my project, using this method, we provided the first proof-of-concept that ALK-rearrangement can be detected in CTCs of patients with ALK-rearranged NSCLC (Pailler, J Clin Oncol, 2013). We showed that CTCs from these patients harbor a unique ALK break-apart rearrangement, including patients presenting another form of rearrangement in the biopsy, and a mesenchymal phenotype. This suggests that these CTCs may arise from a clonal selection of tumor cells that have acquired invasive and migratory properties and possibly the potential to drive metastatic progression. Then, we characterized CTCs from patients with ROS1-rearranged NSCLC and reported for the first time the detection of ROS1-rearrangement in CTCs (Pailler, Ann Oncol, 2015). In the third part of the project, we evaluated whether CTCs with abnormal ALK-FISH patterns monitored under crizotinib (baseline and early sampling at 2 months) may inform on treatment benefit in a cohort of ALK-rearranged patients treated by crizotinib. In an extended cohort of patients, the dynamic change in the numbers of CTCs with a gain of ALK-native copies was associated with the progression-free survival and thus may be a surrogate biomarker for crizotinib efficacy (Pailler, submitted). These results show that the molecular analysis of CTCs performed under treatment could help to stratify patients at risk of early resistance to crizotinib. Finally, in the last part of my project, we sought to evaluate whether CTCs could be used for identifying resistance mutations to ALK inhibitors. We developed technologies to characterize, isolate and molecularly (targeted sequencing and exome sequencing) analyze CTCs at the single cell level. Experiments on cell lines allowed to validate these technical processes; Experiments on patient samples are ongoing.In this work, we characterize genomic abnormalities present in CTCs from ALK-rearranged patients at different stages of the disease and identify biomarkers of sensitivity and efficacy to targeted therapies. Our results provide new perspectives on the potential of CTCs for personalizing treatments in NSCLC patients. Furthermore, our findings may offer new insights on the biological characteristics of CTCs in ALK-rearranged patients, their overall role in the metastatic progression and the genomic diversity of these cancers.

Les cancers du poumon se placent au quatrième rang des cancers tous sexes confondus et constituent la première cause de mortalité par cancer pour l’homme et la troisième chez la femme. Le pronostic est sombre avec une survie relative globale estimée à 43% à 1 an et 14% à 5 ans. Les adénocarcinomes, les carcinomes épidermoïdes et les carcinomes à grandes cellules selon la classification OMS 2015 correspondent à 85% de ces cancers. Les adénocarcinomes pulmonaires ont été scindés en de multiples entités grâce aux progrès des techniques de biologie moléculaire ayant permis d’identifier différentes mutations (EGFR, RAS..) ou réarrangement chromosomique (EML4-ALK), à l’origine de ces tumeurs. Différentes thérapies ciblées ont pu ainsi être développées afin de contrecarrer ces anomalies tels que le crizotinib en cas de réarrangement EML4-Alk ou l’erlotinib en cas de mutation de l’EGFR. Chacun de ces sous-types tumoraux a une présentation clinique et une évolution qui lui est propre. Nous nous sommes particulièrement intéressés au réarrangement ALK, car la génération de néoépitopes dérivés de ce réarrangement pourrait induire une réponse immunitaire. Par ailleurs, il avait été montré dans des lymphomes qu’une translocation NPM-ALK induisait l’expression de PD-L1 via Stat 3. Or la liaison de PD-L1 à PD-1 exprimé par les lymphocytes T (LT) délivre un signal inhibiteur à ces cellules. Ce mécanisme d’échappement constitue une cible thérapeutique via des anticorps qui bloquent cette interaction. Le premier objectif de ce travail a consisté à caractériser la réponse immunitaire effectrice (LT-CD8) et les mécanismes régulant cette réponse (expression de PD-L1, de PD1, infiltration par des LT régulateurs, perte du CMH de classe 1) dans les adénocarcinomes du poumon avec un réarrangement ALK. Cette étude a été réalisée avec une nouvelle méthode de quantification des cellules immunes reposant sur une analyse multiparamétrique in situ fluorescente avec une analyse spectrale permettant de s’affranchir des problèmes de compensation de fluorescence. J’ai montré que les tumeurs du poumon avec un réarrangement ALK exprimaient plus fréquemment PD-L1 que les tumeurs non mutées ou présentant une mutation de l’EGFR. Si le nombre médian de lymphocytes T-CD8+, exprimant ou non PD1 ne différait pas entre les différents groupes, nous avons montré que les tumeurs ALK réarrangé présentaient, avec une fréquence plus grande, une expression de PD-L1 associée à un infiltrat LT-CD8+ total ou intratumoral ou CD8+PD1+ total ou intra-tumoral supérieurs à la médiane. Cette corrélation n’était pas retrouvée, ni dans les ADC EGFR muté ni dans les ADC non ALK, non EGFR, non KRAS. L’expression de PD-L1 associée à l’infiltration par les LT-CD8 exprimant PD-1 sont considérées comme des biomarqueurs de réponse à l’immunothérapie par des anti-PD-1/PDL-1. Cette caractérisation du microenvironnement des tumeurs du poumon avec un réarrangement ALK pourrait permettre de mieux comprendre le profil de réponse des patients à cette immunothérapie. La paroi alvéolaire du poumon est une surface muqueuse séparant l’organisme du monde extérieur. Or il est connu que la réponse immunitaire muqueuse n’est pas similaire à la réponse observée dans le sang aussi bien en termes de phénotype des cellules présentes dans ces deux compartiments que par le mode de génération et d’induction de ces cellules. Dans un premier travail de l’équipe nous avons montré que seule une vaccination par voie nasale (voie muqueuse) permettait le recrutement dans une tumeur de la sphère ORL ou du poumon, de LT anti-tumoraux et la régression de tumeurs muqueuses ORL et pulmonaires, contrairement à une vaccination par voie systémique (intramusculaire). Cette efficacité de la vaccination muqueuse était associée à l’induction de lymphocytes T résidents mémoires (Trm) dans les sites muqueux (poumon, ORL) caractérisés par l’expression des intégrines CD103 et CD49a. (...) / Lung cancer is the most common cause of cancer-related mortality worlwide and a therapeutic challenge. Approximately 5% to 6% of non-small cell lung carcinoma (NSCLC) have chromosomal rearrangements of the anaplastic lymphoma kinase (ALK) gene, which mainly involve the echinoderm microtubule–associated protein-like 4 (EML4) gene as a partner. Even if the ALK tyrosine kinase inhibitor (TKI), crizotinib, has been successfully developed in these patients, resistance invariably occurs leading to tumor relapse. The ALK rearranged protein is immunogenic, was shown to induce PD-L1 and highlight the potential of immunotherapy in this cancer. The first issue of our work was to set up an immunofluorescence multiplex platform to comprehensively analyse the tumor microenvironment of a retrospective cohort of 29 ALK positive ADC, compared to 27 EGFR mutated ADC and 25 wild type ADC. Mean number of total CD8+T cells expressing or not PD-1 and the ratio of CD8/regulatory T cells weren’t significantly different between the various subgroups. The percentage of tumor cells expressing PD-L1 were higher in the ALK positive ADC, than in the EGFR positive ADC or WT lung cancer. We found a significant correlation in ALK positive ADC between the number of total or intratumoral (intraT) CD8+ or PD-1+CD8+T and the expression of PD-L1 by tumor cells suggesting a possible role of adaptive immunity in the regulation of PD-L1 on these tumor cells. Furthermore, the percentage of patients displaying two criteria of clinical response (% PD-L1 on tumor cells and infiltration by intraT PD-1+CD8+ or CD8+T cells) was higher in the ALK positive ADC. According to our results, a subgroup of ALK rearranged lung ADC patients may represent good candidates to be treated by anti-PD-1/PD-L1 antibodies. The alveolar wall is a mucosal site in contact with the environment. Resident memory T cells (Trm) found most prominently at mucosal sites represent a new subset of long lived memory T cells that remain in tissue and do not recirculate. Due to their role in local immunity, strategies to elicit Trm after vaccination have been developed. We and others clearly showed that mucosal immunization were more efficient than the conventional systemic route (intramuscular, subcutaneous) to elicit Trm at the mucosal tumor site. Indeed, the mucosal route of immunization imprints T cells with a mucosal homing program defined by a profile of integrin and chemokine receptors promoting their homing to the site of initial activation. A correlation was observed between the ability to elicit these cells at the tumor site and the control of tumor growth. The second issue of this work was to characterize in a mouse model Trm after mucosal cancer vaccine administration and in human lung cancer. We first developed various original strategies (mucosal immunization, use of mucosal vector, modulation of TGF, parabiosis experiments) to elicit or inhibit Trm in a preclinical model of head and neck cancer. All these experiments converged to demonstrate that the induction of Trm are required for the control of tumor growth. In order to extrapolate this role of Trm in humans, we found that the number of Trm correlated with a better overall survival in lung cancer in multivariate analysis. The induction of Trm may represent a new surrogate biomarker for the efficacy of cancer vaccine.

L'oncogène ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) est une tyrosine kinase constitutivement active, impliquée dans divers cancers, tels que les lymphomes anaplasiques à grandes cellules (LAGC), ou certains carcinomes bronchiques. Ces tumeurs sont traitées par chimiothérapie, ce qui n'est pas un traitement optimal (30% de rechutes, abaissement de la qualité de vie). Dans ce contexte, de nombreux inhibiteurs spécifiques de la tyrosine kinase ALK tels que le Crizotinib ont été développés et ont prouvé leur efficacité à la fois dans des modèles in vitro, in vivo ainsi que chez les patients. Néanmoins, le succès de cette thérapie ciblée est limité par l'apparition de résistances. Il est donc essentiel de mettre au jour de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de contrecarrer ces résistances. Récemment, l'autophagie, un processus catabolique intracellulaire de dégradation lysosomale, a été proposée comme nouvelle cible thérapeutique dans le traitement des cancers résistants aux inhibiteurs de tyrosine kinase. Le premier objectif de mon projet de thèse a été de caractériser ce processus autophagique dans les LAGC ALK+, en réponse à différents traitements. Nous avons montré que (1) l'autophagie était activée dans des lignées de LAGC en réponse à l'inhibition de ALK, (2) que cette autophagie jouait un rôle cytoprotecteur dans ce modèle et (3) que les traitements par chimiothérapies de ces cellules n'induisaient pas de réponse autophagique. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés à la régulation potentielle de l'autophagie par les microARNs. Nous avons montré que plusieurs microARNs, dont le miR-7, étaient sous-exprimés en réponse au traitement par le Crizotinib et que la réexpression ectopique de ce miR-7 permettait une potentialisation de l'effet du Crizotinib, par l'induction d'autophagie cytotoxique dans notre modèle. Nous avançons également l'hypothèse que le " switch " autophagique de la cytoprotection à la cytotoxicité, que nous observons pourrait s'expliquer par la régulation de l'expression de plusieurs protéines cibles de miR-7 telles que Bcl-2 ou c-Raf. Ainsi, l'ensemble de nos résultats nous permettent de mieux comprendre le rôle et la régulation de l'autophagie induite en réponse à l'inhibition de ALK dans les LAGC ALK+, et pourrait à terme contribuer à l'amélioration des thérapies actuelles de divers cancers dépendants de l'oncogène ALK. / The ALK oncogene (Anaplastic Lymphoma Kinase) is a constitutively activated tyrosine kinase implied in various cancers including Anaplastic Large Cell Lymphomas (ALCL), or some lung adenocarcinomas. The current operative treatment is standard chemotherapy, which is not optimal (30% of relapses, low quality of life). In this context, new specific ALK inhibitors such as Crizotinib have been developed, and have showed their efficiency in vitro, in vivo and in patients. However, the emergence of resistant mutations has been described. Thus, the identification of alternative therapies targeting new pathways appears as mandatory to counteract those resistances. In this context, autophagy, an intracellular catabolic lysosomal process, has been described as a new therapeutic target in the treatment of cancers resistant to tyrosine kinase inhibitors. The first aim of my project was to characterize the autophagic process in ALK+ ALCL, upon different treatments. We showed that (1) autophagy was activated in ALK+ ALCL cell lines in response to ALK inhibition (2) that this autophagy played a cytoprotective role in our model and (3) that treatment with chemotherapies did not trigger an autophagic response. In a second part of the project, we focused on the potential regulation of autophagy by microRNAs. We showed that several microRNAs including miR-7 were down-regulated upon Crizotinib treatment and that ectopic re-expression of this miR-7 potentiates the effects of Crizotinib by induction of cytotoxic autophagy in our model. We hypothesized that this switch in the role of autophagy from cytoprotection to cytotoxicity observed in our model, could be explained by the regulation of several protein targets of miR-7 such as Bcl-2 or c-Raf. Altogether, these results enable a better understanding of the role and regulation of autophagy induced upon ALK inhibition in ALCL, and could in the longer term, contribute to improvement of current therapies of cancers involving the ALK oncogene.

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