Thesis (Ph. D.)--University of Hong Kong, 1996. / Includes bibliographical references (leaf 185-194).

Thesis (Ph.D.)--University of Hong Kong, 1996. / Includes bibliographical references (leaf 185-194). Also available in print.

published_or_final_version / Botany / Doctoral / Doctor of Philosophy

L’oxydase de l’acide 1-AminoCyclopropane Carboxylique (ACC Oxydase, ACCO) catalyse la formation de l’éthylène, hormone essentielle à la vie des plantes. L’ACCO catalyse l’oxydation de l’ACC en éthylène en présence de dioxygène et de deux électrons (fournis in vitro par l’ascorbate). L'activité de l'enzyme requière également, pour des raisons encore incomprises, la présence de CO2 sous la forme d'ions bicarbonates. Il s’agit d’une enzyme qui contient un ion fer(II) dans un environnement non-hémique au site actif. Etant donné l’importance de l’éthylène chez les plantes, l’ACCO, ainsi que les autres enzymes impliquées dans sa biosynthèse, ont été très étudiées durant les vingt dernières années. Cependant, peu d’études ont porté sur le rôle de l’ion métallique et le mécanisme d’action ou sur les surprenants processus d’inactivation subis par l’enzyme. L’ACCO est en effet une enzyme connue pour son instabilité. Nous avons tout d’abord entrepris une caractérisation physicochimique et biochimique de l’enzyme. Le matériel protéique utilisé a tout d’abord été analysé une coupure entre les résidus Ala 290 et Gly 291 a été observée au cours de la purification de l'enzyme. Puis, grâce à l'utilisation de techniques spectroscopiques, nous avons cherché à obtenir plus d'informations sur la fixation des substrats/cofacteurs au site actif. Enfin l’étude des mutants et des complexes modèles de l’ACCO a été réalisée afin de mieux comprendre le mécanisme catalytique et de rechercher de nouvelles activités. Nous nous sommes aussi intéressés aux mécanismes d’inactivation de l’ACCO. En présence des effecteurs en excès, cette inactivation se traduit par une fragmentation et une modification de charge. Lorsque la concentration en fer est limitée, aucune modification physique de l’enzyme inactive n’est observée et l'enzyme garde un contenu global en aminoacide et une conformation tridimensionnelle intègres. Des processus oxydatifs se déroulant directement au site actif de l’enzyme sont susceptibles d’engendrer une telle perte d’activité par l'oxydation d'un nombre limité d'acides aminés. Des études en spectrométrie de masse ont été entreprises et sont toujours en cours afin d'identifier les modifications responsables de la perte d'activité de l'enzyme.Enfin nous avons recherché d’éventuelles partenaires protéiques qui pourraient conférer à l’ACCO une meilleure stabilité. Des études préliminaires ont été entreprises et des données de microscopie suggèrent que l'ACCO est localisée près des membranes de la vacuole. / The 1-AminoCyclopropane Carboxylic acid oxidase (ACC Oxidase, ACCO) catalyzes the last step of the biosynthesis of the plant hormone, ethylene. ACCO catalyzes the oxidation of ACC into ethylene in the presence of dioxygen and two electrons (provided in vitro by ascorbate). Carbon dioxide (or bicarbonate ions) are also required for optimum activity. ACCO is an non-heme iron(II) containing enzyme. Given the importance of ethylene in plants, studies on ACCO, as well as on the other enzymes involved in its biosynthesis, have attracted much attention in the past two decades. However, few studies focus on the role of the metal ion and on the catalytic mechanism or the intriguing inactivation processes. ACCO is indeed known for its instability. We first purified and characterised the enzyme. During the purification, a cleavage between residues Ala 290 and Gly 291 was observed. Then, using spectroscopic techniques, we intended to get more information on cofactor's binding in the active site. Finally studies of mutants and model complexes of ACCO were performed in order to get a better understanding of the catalytic mechanism and to look for new activities.We were also interested in the inactivation processes of ACCO. In the presence of an excess of effectors, this inactivation resulted in fragmentation and in pI modification. When the concentration of iron is limited, no modifications of the inactive enzyme were observed. The inactive enzyme maintained its amino acid content and three-dimensional conformation. The loss of activity is therefore likely to derive from oxidative processes directly at the active site. Mass spectrometry experiments were initiated and are still under progress. Finally we were interested in identifying possible protein partners of ACCO that could provide a better stability. Preliminary studies were thus initiated and from microscopy results, ACCO was found located close to the vacuole membrane.

>Magister Scientiae - MSc / In an ever changing environment, plants are constantly challenged by various abiotic stresses such as salinity, which limits global crop production. This directly affects food availability for the global population, which is projected to increase to 9.5 billion by 2050, which in turn places great pressure on natural resources and food security. These environmental adversities induce the accumulation of reactive oxygen species (ROS) hydrogen peroxide, hydroxyl and superoxide radicals which cause severe oxidative damage to plants. The equilibrium between the production and detoxification of ROS is then dependent on the modulation of enzymatic and non-enzymatic antioxidants to achieve plant homeostasis. / 2024

Seed germination during unhospitable environmental conditions can be a major barrier to direct seeding efforts in dryland systems. In the sagebrush steppe, Artemisia tridentata Nutt. ssp. wyomingensis and Artemisia arbuscula are important shrub species that are being used in restoration, but seeding success is highly sporadic due to inter-annual and intra-seasonal weather variability. Altering and expanding the period of germination, as a form of bet-hedging, may improve plant establishment. Our objective was to determine if we could expand the period of germination using plant growth regulators (PGRs) applied in a conglomerated seed coating treatment. In a laboratory study, the seed was either left untreated, conglomerated separately with two concentrations of a germination inhibitor, abscisic acid (ABA), or with two different germination promoters, gibberellic acid (GA3) and 1-Aminocyclopropane carboxylic acid (ACC), a precursor to ethylene. Seeds were incubated in a loam soil at five constant temperatures (5-25 C) for approximately three months. Results indicate that seed treatments with PGRs can delay or speed germination. The greatest response to the seed treatments was observed at 5 C. For example, at this temperature PGRs delayed the time for 25% of the seeds to germinate by a maximum of 35 and 21 d and decreased this time by 5 and 25 d for A. t. ssp. Wyomingensis and A. arbuscula, respectively. Field studies are needed to determine if the bet-hedging strategy developed in this study will increase the likelihood that some seeds will germinate during periods that are more favorable for plant establishment.

Les cyclopropanes sont des motifs structuraux importants en chimie médicinale. Parmi les synthèses existantes du fragment aminocyclopropane, les réactions dérivées de la réaction de Kulinkovich, appliquées aux amides et aux nitriles, sont des méthodes simples d'accès. Cependant, il n'existe pas de version asymétrique efficace. Dans une première partie, l'étude de l'utilisation de complexes de titane optiquement actifs pour la préparation de spirolactames chiraux à partir de cyanoesters a été réalisée. Ce travail a permis de mettre au point une méthode d'évaluation rapide de ligands chiraux dont leur criblage a montré que les composés de la famille du Taddol fournissent les meilleurs excès énantiomériques. L'énantiosélectivité demeure cependant actuellement trop faible pour présenter un intérêt en synthèse. Dans une seconde partie, la synthèses de carbinamines tertiaires, un autre motif important, a été étudié à partir d'acylcyanhydrines et d'organométalliques. En particulier, la synthèse d'une bibliothèque d'acides aminés quaternaires a été entreprise à partir d'hydroxyamides. L'incorporation de deux organométalliques différents sur des acylcyanhydrines a été également effectuée conduisant à l'obtention d'hydroxyamides chiraux sous forme racémique. Enfin, l'emploi de réactifs organozinciques allyliques nous a permis d'accéder à de très bons rendements en produits de double addition. Ces hydroxyamides ont été ensuite valorisés comme précurseurs de plateformes multifonctionnelles pour la ligation chimique. / Cyclopropylamines are important scaffolds in medicinal chemistry. Among the syntheses of the aminocyclopropane moiety, the Kulinkovich-related reactions applied to amides and nitriles furnish straightforward access. However, no efficient asymmetric version has been published to date. In a first part, the study of optically active titanium complexes for the preparation of chiral spirolactams from cyanoesters has been undertaken. This work allowed us to setup a quick evaluation method for chiral ligands whose screening revealed that Taddol and its derivatives lead to the best enantiomeric excesses. However, the enantioselectivity remains too low for synthetic purposes. In a second part, the synthesis of tertiary carbinamines, another important scaffold, has been studied from acylcyanohydrins and organometallics. Notably, the synthesis of a quaternary aminoacids library was achieved. The incorporation of two different organometallics on acylcyanohydrins was also undertaken, leading to the preparation of chiral hydroxyamides in a racemic fashion. Lastly, very good yields in double addition products were obtained by using allylic organozinc reagents. The obtained hydroxyamides were used as precursors of polyfunctional linkers for the chemical ligation.

L'intensification des activités industrielles et les besoins en énergie font des hydrocarbures pétroliers (HP) un enjeu majeur mondial mais augmentent aussi considérablement les risques environnementaux dans divers écosystèmes. La phytoremédiation est une phytotechnologie qui a fait ses preuves en tant que solution verte pour faire face aux contaminations des sols par des HP. La phytoremédiation des sols contaminés par les HP repose principalement sur l’activité des communautés microbiennes associées aux racines des plantes au niveau de la rhizosphère, qui peuvent non seulement favoriser la croissance des plantes hôtes mais aussi augmenter leur tolérance à divers stress biotiques et abiotiques. Parmi les défis majeurs de la phytoremédiation des sols contaminés par les HP, on compte la forte toxicité de certains composés des HP qui entravent la croissance des plantes et par conséquent l’efficacité de la phytoremédiation. Cependant, la croissance des plantes peut être positivement stimulée par la présence de rhizobactéries favorisant leur croissance (PGPR) qui sont capables d'atténuer le stress des plantes par divers mécanismes. Dans cette thèse, un total de 438 bactéries PGPR dégradant les hydrocarbures pétroliers, ont été isolées de la rhizosphère et du sol de deux espèces de plantes, Salix purpurea et Eleocharis obusta, dans un site d'une ancienne raffinerie pétrochimique à Varennes, QC, Canada. Les isolats bactériens ont été classés en 62 genres, appartenant aux phylums Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes et aux sous-groupes Alpha-, Beta- et Gamma-Proteobacteria. De plus, cette collection de cultures contient 438 isolats bactériens avec de multiples caractéristiques de dégradation et de stimulation de croissance (PGPR), représentant une diversité fonctionnelle de dégradation des HP et de caractéristiques PGPR qui pourraient être utilisées dans la phytoremédiation assistée par les bactéries, des sols contaminés par les HP. Parmi ces 438 isolats bactériens, 50 isolats représentant une large diversité taxonomique, ont été sélectionnées pour une caractérisation approfondie supplémentaire concernant leur capacité à favoriser la croissance des plantes en présence de différentes concentrations de n-hexadécane (0%, 1%, 2%, 3%) dans des conditions contrôlées. Les résultats ont indiqué que les isolats bactériens Nocardia sp. (WB46), Pseudomonas plecoglossicida (ET27), Stenotrophomonas pavanii (EB31), Bacillus megaterium (WT10) et Gordonia amicalis (WT12) ont significativement augmenté la croissance des plantes cultivées dans 3% de n-hexadécane par rapport au traitement témoin. De plus, ces isolats possèdent plusieurs traits favorisant la croissance des plantes (PGPR) tels que l'activité 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) désaminase (ACCD), la production d'acide indole-3-acétique (IAA) et la fixation de l'azote. De plus, ces isolats étaient capables d'utiliser le n-hexadécane comme seule source de carbone et possédaient des gènes cataboliques liés à la dégradation des hydrocarbures tels que le gène de l'alcane monooxygénase (alkB), le cytochrome P450 hydroxylase (CYP153) et le gène de la naphtalène dioxygénase (nah1). Nocardia sp. isolate WB46, a été sélectionné pour le séquençage de son génome afin de déterminer sa diversité génétique et fonctionnelle relatives à la dégradation des HP et les potentiels PGPR. Les résultats ont indiqué que, sur la base des analyses du gène de l'ARNr 16S, l'hybridation ADN-ADN in silico (DDH) et l'identité moyenne des nucléotides (ANI), Nocardia sp. isolate WB46 représente une nouvelle espèce bactérienne. De plus, l'annotation fonctionnelle de son génome révèle que celui-ci contient de nombreux gènes responsables de la dégradation des hydrocarbures pétroliers tels que l'alcane 1-monooxygénase (alkB) et la naphtalène dioxygénase (ndo) ainsi que d'autres gènes liés à ses potentiels PGPR. En conclusion, la rhizosphère des espèces S. purpurea et E. obusta poussant dans un site fortement pollué par les HP représente un biotope diversifié et comprenant des bactéries PGPR avec de multiples potentiels de dégradation des HP. De plus, plusieurs isolats bactériens tels que Nocardia sp. (WB46), Pseudomonas plecoglossicida (ET27) et Stenotrophomonas pavanii (EB31) démontrent un potentiel d'utilisation comme bioinoculants pour de futures études de phytoremédiation à grande échelle. / Petroleum hydrocarbons (PHCs), as a result of intensification of industrial activities, are a global environmental issue especially in soil environments. Phytoremediation represents an ideal solution to tackle this global crisis. Phytoremediation of PHC-contaminated soils proceeds mainly through the activities of microbial communities that colonize the plant rhizosphere which might promote host plants growth and increase its tolerance to various biotic and abiotic stresses. A main challenge in phytoremediation of PHC-contaminated soils is the high toxicity of PHCs which hinder plant growth and reduce the efficiency of phytoremediation. However, plant growth may be positively stimulated by the presence of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) that are able to alleviate stresses in plants through various mechanisms. In this thesis, a total of 438 petroleum hydrocarbons degrading-PGPR bacterial isolates were recovered from the rhizosphere and the surrounding bulk soil of Salix purpurea and Eleocharis obusta plants from the site of a former petrochemical plant in Varennes, QC, Canada. Bacterial isolates were classified into 62 genera, belonging to the phyla Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes and the Alpha, Beta and Gamma-subgroups of Proteobacteria. Additionally, this culture collection holds 438 bacterial isolates with multiple degradative and PGP features, representing a rich reservoir of metabolically versatile PGPR-PHC degraders that could be used in holistic, bacterial-aided phytomanagement of PHC-contaminated soils. Among the above 438 bacterial isolates, 50 bacterial strains representing a wide phylogenetic range were selected for an additional in-depth characterization regarding their ability to promote plant growth under the presence of different concentrations of n-hexadecane (0%, 1%, 2%, 3%) under gnotobiotic conditions. Results indicated that bacterial isolates Nocardia sp. (WB46), Pseudomonas plecoglossicida (ET27), Stenotrophomonas pavanii (EB31), Bacillus megaterium (WT10) and Gordonia amicalis (WT12) significantly increased the growth of plants grown in 3% n-hexadecane compared with the control treatment. Additionally, these isolates possess several plant-growth-promoting (PGP) traits such as 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase (ACCD) activity, indole-3-acetic acid (IAA) production and nitrogen fixation. Also, these isolates were able to use n-hexadecane as sole source of carbon and have catabolic genes related to hydrocarbon degradation such alkane monooxygenase (alkB) gene, the cytochrome P450 hydroxylase (CYP153) and the naphthalene dioxygenase (nah1) gene. The isolate that showed the highest growth stimulation of plants grown in 3% n-hexadecane under gnotobiotic conditions, Nocardia sp. isolate WB46, was selected for de novo genome sequencing to unveil its genetic versatility and the mechanisms of PHCs biodegradation and PGP potentials. Results indicated that based on the 16S rRNA gene analyses, in silico DNA-DNA hybridization (DDH) and average nucleotide identity (ANI) Nocardia sp. isolate WB46 is a new species. Additionally, the functional annotation of the genome of Nocardia sp. isolate WB46 reveals that its genome contains many genes responsible for petroleum hydrocarbon degradation such as alkane 1-monooxygenase (alkB) and naphthalene dioxygenase (ndo) as well as other genes related to its PGP potentials. In conclusion, S. purpurea and E. obusta growing in a site highly polluted with PHCs are rich reservoir of diverse PGPR with multiple PHC-degradation and PGP potentials. In addition, several bacterial isolates such as Nocardia sp. (WB46), Pseudomonas plecoglossicida (ET27) and Stenotrophomonas pavanii (EB31) demonstrate potential for use as bioinoculants in future large-scale phytoremediation studies.

Ce mémoire présente trois approches différentes vers la synthèse du 3–(trans–2–nitrocyclopropyl)alanine, un intermédiaire synthétique de la hormaomycine. Cette molécule naturelle démontre d’intéressantes activités biologiques et pharmacologiques. Il est intéressant de souligner que ce dérivé donne facilement accès au 3–(trans–2–aminocyclopropyl)alanine, unité centrale de la bélactosine A. Ce composé naturel possédant lui aussi d’intéressantes propriétés biologiques, plusieurs études relationnelles structures-activités menant à des dérivés plus actifs de cette molécule ont été entreprises, démontrant l’intérêt toujours présent de synthétiser de façon efficace et optimale ces dérivés cyclopropaniques. Une méthodologie développée au sein de notre groupe de recherche et basée sur une réaction de cyclopropanation intramoléculaire diastéréosélective sera mise à profit afin d’élaborer une nouvelle voie de synthèse aussi élégante qu’efficace à la construction du 3–(trans–2–nitrocyclopropyl) alanine. En utilisant un carbène de rhodium généré soit par la dégradation d’un dérivé diazoïque, soit par la formation d’un réactif de type ylure d’iodonium, une réaction de cyclopropanation diastéréosélective permettra la formation de deux autres centres contigus et ce, sans même utiliser d’auxiliaire ou de catalyseur énantioenrichis. Ensuite, un réarrangement intramoléculaire précédant deux réactions synchronisées d’ouverture de cycle et de décarboxylation permettront l’obtention du composé d’intérêt avec un rendement global convenable et en relativement peu d’étapes. De cette manière, la synthèse formelle de la bélactosine A et de l’hormaomycine a été effectuée. Cette synthèse se démarque des autres par l’utilisation d’une seule transformation catalytique énantiosélective. / This master’s thesis presents three different approaches toward the synthesis of 3–(trans–2–nitrocyclopropyl)alanine, a key constituent of the natural product hormaomycin. This unusual compound demonstrates interesting biological and pharmaceutical activity. It is noteworthy that this unique amino acid can be readily converted to the corresponding 3–(trans–2–aminocyclopropyl)alanine, the central core of belactosin A, a natural compound exhibiting interesting biological properties. Efficient syntheses of these aminocyclopropane derivatives are of current interest since several structure-activity relationships in syntheses of belactosin A and hormaomycin analogues are currently under study in an effort to discover enhanced biological activity. A methodology developed in our research group based on a diastereoselective intramolecular cyclopropanation reaction will be used to elaborate a unique and elegant pathway to the synthesis of the 3–(trans–2–nitrocyclopropyl)alanine. By using a rhodium carbene generated either by the degradation of a diazoic derivative or by the formation of the corresponding iodonium ylide, a diastereoselective cyclopropanation reaction can be applied in the concerted elaboration of two chiral centers needed in the desired aminocyclopropanes, avoiding in this way the utilisation of chiral reagents. Following this key sequence, an intramolecular rearrangement followed by synchronous ring–opening/decarboxylation reactions will permit a convenient formation of the desired product in an acceptable overall yield and in few ensuing steps. In this manner, the formal synthesis of the hormaomycin and the belactosin A can be achieved. This synthesis is unique since it involves only one asymmetric step in the whole synthetic process.

Ce mémoire présente trois approches différentes vers la synthèse du 3–(trans–2–nitrocyclopropyl)alanine, un intermédiaire synthétique de la hormaomycine. Cette molécule naturelle démontre d’intéressantes activités biologiques et pharmacologiques. Il est intéressant de souligner que ce dérivé donne facilement accès au 3–(trans–2–aminocyclopropyl)alanine, unité centrale de la bélactosine A. Ce composé naturel possédant lui aussi d’intéressantes propriétés biologiques, plusieurs études relationnelles structures-activités menant à des dérivés plus actifs de cette molécule ont été entreprises, démontrant l’intérêt toujours présent de synthétiser de façon efficace et optimale ces dérivés cyclopropaniques. Une méthodologie développée au sein de notre groupe de recherche et basée sur une réaction de cyclopropanation intramoléculaire diastéréosélective sera mise à profit afin d’élaborer une nouvelle voie de synthèse aussi élégante qu’efficace à la construction du 3–(trans–2–nitrocyclopropyl) alanine. En utilisant un carbène de rhodium généré soit par la dégradation d’un dérivé diazoïque, soit par la formation d’un réactif de type ylure d’iodonium, une réaction de cyclopropanation diastéréosélective permettra la formation de deux autres centres contigus et ce, sans même utiliser d’auxiliaire ou de catalyseur énantioenrichis. Ensuite, un réarrangement intramoléculaire précédant deux réactions synchronisées d’ouverture de cycle et de décarboxylation permettront l’obtention du composé d’intérêt avec un rendement global convenable et en relativement peu d’étapes. De cette manière, la synthèse formelle de la bélactosine A et de l’hormaomycine a été effectuée. Cette synthèse se démarque des autres par l’utilisation d’une seule transformation catalytique énantiosélective. / This master’s thesis presents three different approaches toward the synthesis of 3–(trans–2–nitrocyclopropyl)alanine, a key constituent of the natural product hormaomycin. This unusual compound demonstrates interesting biological and pharmaceutical activity. It is noteworthy that this unique amino acid can be readily converted to the corresponding 3–(trans–2–aminocyclopropyl)alanine, the central core of belactosin A, a natural compound exhibiting interesting biological properties. Efficient syntheses of these aminocyclopropane derivatives are of current interest since several structure-activity relationships in syntheses of belactosin A and hormaomycin analogues are currently under study in an effort to discover enhanced biological activity. A methodology developed in our research group based on a diastereoselective intramolecular cyclopropanation reaction will be used to elaborate a unique and elegant pathway to the synthesis of the 3–(trans–2–nitrocyclopropyl)alanine. By using a rhodium carbene generated either by the degradation of a diazoic derivative or by the formation of the corresponding iodonium ylide, a diastereoselective cyclopropanation reaction can be applied in the concerted elaboration of two chiral centers needed in the desired aminocyclopropanes, avoiding in this way the utilisation of chiral reagents. Following this key sequence, an intramolecular rearrangement followed by synchronous ring–opening/decarboxylation reactions will permit a convenient formation of the desired product in an acceptable overall yield and in few ensuing steps. In this manner, the formal synthesis of the hormaomycin and the belactosin A can be achieved. This synthesis is unique since it involves only one asymmetric step in the whole synthetic process.