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Amphioxus (Branchiostoma floridae) cholinesterase 2 (ChE2) hydrolyzes acetylthiocholine (AsCh) almost exclusively. We constructed a homology model of ChE2 on the basis of Torpedo californica acetylcholinesterase (AChE) and found that the acyl pocket of the enzyme resembles that of Drosophila melanogaster AChE, which is proposed to be comprised of Phe330 (Phe290 in T. californica AChE) and Phe440 (Val400), rather than Leu328 (Phe288) and Phe330 (Phe290), as in vertebrate AChE. In ChE2, the homologous amino acids are Phe312 (Phe290) and Phe422 (Val400). To determine if these amino acids define the acyl pocket of ChE2 and its substrate specificity, and to obtain information about the hydrophobic subsite, partially comprised of Tyr352 (Phe330) and Phe353 (Phe331), we performed site-directed mutagenesis and in vitro expression. The aliphatic substitution mutant F312I ChE2 hydrolyzes AsCh preferentially but also butyrylthiocholine (BsCh), and the change in substrate specificity is due primarily to an increase in kcat for BsCh; Km and K ss are also altered. F422L and F422V produce enzymes that hydrolyze BsCh and AsCh equally due to an increase in kcat for BsCh and a decrease in kcat for AsCh. Our data suggest that Phe312 and Phe422 define the acyl pocket. We also screened mutants for changes in sensitivity to various inhibitors. Y352A increases the sensitivity of ChE2 to the bulky inhibitor ethopropazine. Y352A decreases inhibition by BW284c51, consistent with its role as part of the choline-binding site. Aliphatic replacement mutations produce enzymes that are more sensitive to inhibition by iso-OMPA, presumably by increasing access to the active site serine. Y352A, F353A and F353V make ChE2 considerably more resistant to inhibition by eserine and neostigmine, suggesting that binding of these aromatic inhibitors is mediated by π-π or cation-π interactions at the hydrophobic site. Our results also provide information about the aromatic trapping of the active site histidine and the inactivation of ChE2 by sulfhydryl reagents.

Thesis (Ph. D.)--University of Oregon, 2000. / Typescript. Includes vita and abstract. Includes bibliographical references (leaves 96-105). Also available for download via the World Wide Web; free to University of Oregon users.

The amphioxus Hox cluster is often viewed as “archetypal” for the chordate lineage. Here we present a descriptive account of the 448kb region spanning the Hox cluster of the amphioxus Branchiostoma floridae from Hox14 to Hox1.We provide complete coding sequences of all 14 previously described amphioxus sequences and describe a detailed analysis of the conserved non-coding regulatory sequence elements. We find that the posterior part of the Hox cluster is so highly derived that even the complete genomic sequence is insufficient to decide whether the posterior Hox genes arose by independent duplications or whether they are true orthologs of the corresponding gnathostome paralog groups. In contrast, the anterior region is much better conserved. The amphioxus Hox cluster strongly excludes repetitive elements with the exception of two repeat islands in the posterior region. Repeat exclusion is also observed in gnathostomes, but not protostome Hox clusters. We thus hypothesize that the much shorter vertebrate Hox clusters are the result of extensive resolution of the redundancy of regulatory DNA following the genome duplications rather than the consequence of a selection pressure to remove non-functional sequence from the cluster.

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L’induction neurale est le processus au travers duquel les cellules ectodermiques de l’embryon deviennent neurales. De nombreuses études sur les mécanismes contrôlant ce processus on été réalisées mais du fait de sa complexité, de nombreuses questions restent sans réponse. Au cours de ce travail de thèse, je me suis intéressé à l’étude de l’induction neurale sous une perspective évolutive en étudiant ce processus chez le céphalocordé amphioxus, l’un des plus proches parents des vertébrés. J’ai pu mettre en évidence que, comme les vertébrés, l’amphioxus possède un organisateur. J’ai également confirmé une conservation du rôle des voies de signalisation BMP et FGF respectivement dans l’induction de l’épiderme et la régionalisation du tissu neural. Cependant, au contraire des vertébrés, le signal FGF ne semble pas être un acteur prépondérant de l’induction neurale. Au contraire, un rôle important de la voie de signalisation Activine/Nodal a été mis en évidence.Les résultats obtenus soutiennent d’une part la conservation de certains aspects de ce mécanisme chez tous les chordés, et suggèrent d’autre part l’implication de certains acteurs comme la voie Activine/Nodal jusque là inconnue chez les vertébrés. La position phylogénétique de l’amphioxus et la conservation globale de ce processus entre les céphalochordés et les vertébrés nous permettent de suggérer que l’ancêtre des chordés formait du tissue neurale au travers des mécanismes mis en évidence dans cet étude. Ces résultats nous permettent également de proposer de nouvelles études chez les vertébrés visant à établir un rôle putatif de la voie Activine/Nodal au cours de ce processus, rôle jusque la complètement inconnu. / Neural induction is the process through which embryonic ectodermal cells become neural. Many studies on the mechanisms controlling this process have been made, but because of its complexity, many questions remain unanswered. In this thesis, I have focused my interest on the study of neural induction in an evolutionary context studying this process in the cephalochordate amphioxus, one of the closest relatives of vertebrates. I have highlighted that amphioxus, as vertebrates, possesses an organizer. I have demonstrated a conservation of the role of BMP and FGF signals in the induction of the epidermis and the regionalization of neural tissue respectively. However, in contrast to vertebrates, FGF signal does not appear to be a major player in neural induction. Instead, an important role of Activin/Nodal signaling pathway has been demonstrated. These results support, first, the conservation of several aspects of this mechanism in all chordates, and second, they suggest the involvement of the Activin/Nodal signaling in this process, something previously unknown in vertebrates. The phylogenetic position of amphioxus and the overall conservation of this process between cephalochordates and vertebrates allow us to suggest that the ancestor of chordates formed its neural tissue through mechanisms highlighted in this study. These results also allow us to propose new studies in vertebrates for establishing a putative role of the Activin/Nodal signaling during this process, a role previously completely unknown.

L'apparition de nouvelles structures telles que la crête neurale, les placodes et le mésoderme crânien a été essentielle pour l'émergence de la tête des vertébrées. Fait intéressant, le mésoderme de la tête des vertébrés n'est pas segmenté alors qu'il est supposé que le mésoderme de l'ancêtre de tous les chordés était totalement segmenté. De même le corps du le céphalochordé amphioxus est entièrement segmenté. Des travaux menés par l'équipe ont montré le rôle central du signal FGF dans la formation des somites les plus antérieures chez l'amphioxus. Afin de mieux comprendre le rôle de ce signal pour la formation de ces somites, nous avons réalisé une étude transcriptomique comparative par RNA-seq. Cette analyse a mis en évidence plusieurs gènes que sont impliqués dans la somitogenèse et la myogenèse et sous le contrôle du signal FGF. Nous avons pu montrer grâce à des analyses fonctionnelles que ER81/Erm/PEA3 et Six1/2 ont un rôle majeur dans la formation des somites les plus antérieures chez l'amphioxus. Inversement, Pax3/7 est impliqué dans la formation des somites postérieures. Cette cascade de régulation est semblable à celle observée lors de la somitogenèse pour les muscles du tronc chez les vertébrés, mais diverge de la cascade de gènes contrôlant la formation des muscles de la tête chez les vertébrés. Tous ces résultats supportent l'hypothèse selon laquelle le changement de fonction du signal FGF durant le développement précoce a été une étape clé pour la perte des somites antérieures, libérant ainsi les contraintes dans la partie antérieure de l'embryon et permettant dans un second temps l'acquisition des muscles de la tête chez l'ancêtre commun des vertébrés. / A central question in Evo-Devo is to understand the origin of the vertebrates’ head. The appearance of new structures such as the neural crest, placodes and a cranial mesoderm were essential for the appearance of the head in the vertebrates. Interestingly, it is supposed that the ancestor of all chordates was completely segmented. Remarkably, the cephalochordate amphioxus is completely segmented in the full length of its body as the hypothetical ancestor of all chordates. Moreover, it has been showed that the FGF signal plays a central role in the formation of the anterior-most somites of amphioxus. Thus, in order to understand the downstream signaling pathway under the control of the FGF signal for the formation of the anterior-most somites in amphioxus, we performed a comparative RNA-seq analysis. This analysis revealed several vertebrates orthologues genes playing roles in somitogenesis or myogenesis and under the control of the FGF signal. Furthermore, functional analysis revealed that ER81/Erm/PEA3 and Six1/2 plays majors roles in the formation of the anterior-most somites in amphioxus. Conversely, Pax3/7 is involved in the formation of the posterior somites. This regulatory cascade resembles that for the control of trunk somitogenesis in vertebrates and diverges from the gene cascades controlling the formation of the vertebrate head muscles. Altogether, our results strengthen the hypothesis that changes in the FGF function during early development were instrumental for the loss of anterior somites, releasing developmental constraints in the anterior part of the embryo and allowing a secondary acquisition of head muscles in the ancestor of vertebrates.

L'une des caractéristiques les plus frappantes des animaux multicellulaires, aussi appelés les métazoaires, est leur étonnante diversité morphologique. Des études de type phylogénétique ont permis de mettre en relation cette abondance et cette variété observées au sein des formes de vie animale avec des différences au niveau de processus moléculaires, cellulaires, tissulaires et organiques. Parmi ces différences, celle affectant les programmes de développement apparaît comme un aspect clé de la diversité des métazoaires. Les programmes de développement reposent entre autres sur la mise en œuvre de communications entre cellules, ou entre milieu environnant et cellules, et ces communications sont assurées au niveau moléculaire par le déploiement de cascades d'activités protéiques nommées les voies de signalisation. Une des voies de signalisation essentielles au cours du développement de nombreux métazoaires est la voie de l'acide rétinoïque (AR). Le fonctionnement et les rôles de cette voie pendant le développement animal ont fait l'objet de nombreuses recherches, ces travaux ayant aboutis à des découvertes majeures. Néanmoins des analyses supplémentaires restent requises afin de mieux comprendre l'histoire évolutive de cette voie, du métabolisme de l'AR à la transmission de son signal, en passant par l'identification de ses gènes cibles, ses interactions avec d'autres voies de signalisation, et ses fonctions au cours du développement, le tout au sein du règne animal. Dans ce contexte, étudier cette voie chez un métazoaire tel que le céphalochordate amphioxus, qui possède une voie de signalisation de l'AR équivalente à celle des vertébrés, mais avec une redondance moléculaire moindre, représente une étape importante pour identifier l’architecture et les fonctions ancestrales de cette voie parmi les chordés.Chez l’amphioxus, la voie de signalisation de l'AR est étudiée depuis plus de 20 ans, mais peu de choses sont encore connues sur la régulation de la biodisponibilité de l'AR pendant le développement et sur la nature de ses gènes cibles et du réseau régulateur qu’ils définissent. Le but de mon travail de thèse a par conséquent été d’étudier ces deux aspects fondamentaux de la voie de signalisation de l'AR chez l'amphioxus. Au cours de mon projet de recherche, j’ai utilisé comme modèle d’étude l'amphioxus européen, Branchiostoma lanceolatum, pour lequel j’ai également mis en œuvre de nombreuses améliorations du système de culture ainsi que développer des techniques d’analyses in vivo, comme la microinjection d'ARNm dans des œufs. / One of the most striking features of multicellular animals, the metazoans, is their amazing morphological diversity. Even though phylogenetic research has made remarkable progress towards revealing how the abundance and variety of animal life forms relates on the molecular, cellular, tissue, and organismal level, the alteration of developmental programs has been revealed as a key aspect in this process. During development, a rather limited number of signaling pathways has been shown to be instrumental for generating metazoan diversity. The retinoic acid (RA) signaling pathway is one of these instrumental signaling cascades. A significant amount of time and work has been used to characterize the functions and roles of RA signaling during development, although further work is required to better understand the evolutionary history of the RA signaling network, from metabolism to signal transduction passing by the interactions with other signaling cascades and its developmental functions and how they evolve with time. In this context, model organisms with representative, vertebrate-like RA signaling cascades, such as the cephalochordate amphioxus, will be an important case-study in order to identify the blueprint of an ancestral RA network.The amphioxus RA signaling pathway was initially studied about 20 years ago, even though not much is known about the bioavailability of RA during development. Moreover, the target genes of the RA signaling pathway and their hierarchical relationship during amphioxus development represent an interesting open question. Therefore, this work aimed at providing a detailed description of two fundamental aspects of the RA signaling pathway during amphioxus development: (1) the regulation of the bioavailability of RA in the developing embryo and (2) the target genes under the control of the RA signaling pathway together with their hierarchical regulatory relationship. To address these questions, the European amphioxus, Branchiostoma lanceolatum, was used as a model system.During my research project, not only these questions were fundamental, but also the implementation of amphioxus as a reliable model system and thus the establishment of multiple aquaculture improvements as well as in vivo techniques, such as the microinjection of mRNAs into amphioxus eggs. Furthermore, to characterize the bioavailability of RA during development of amphioxus, I focused on the study of the enzymes that mediate the catabolism of RA endogenously, the CYP26 subfamily proteins. I thus described the evolutionary diversification of CYP26 genes in deuterostomes as well as their expression, their function and the mechanisms that govern the feedback loop controlled directly by RA during amphioxus development.Additionally, to shed light on the target genes under the control of the RA signaling pathway during amphioxus development, I combined pharmacological treatments using retinoid-specific drugs with two different techniques of high throughput sequencing: RNAseq, that revealed the entire RNA profile and thus the genes being expressed at a given moment in time, and ATACseq (assay for transposase-accessible chromatin) that provided a global overview of accessible regions of the chromatin (i.e. open chromatin regions). By combining the data obtained by these techniques, I revealed a new set of genes that are under the control of the RA signaling pathway as well as new potential regulatory loops driving RAR-mediated expression. Moreover, I established a framework to characterize gene hierarchies during development that can be widely applied to other signaling pathways and organisms.

Le système nerveux est responsable de l’interconnexion interne des animaux multicellulaires. Il leur permet en effet d’intégrer les activités physiologiques de leurs différentes composantes en une seule entité fonctionnelle, capable d’interagir avec son environnement. L’évolution et le développement des systèmes nerveux complexes comptent parmi les questions les plus fascinantes de la recherche en biologie. Afin de mettre en place une diversité de types de cellules neurales et de connexions neurales, les animaux métazoaires ne déploient qu’un nombre étonnamment réduit de signaux développementaux. C’est l’intermodulation dynamique de ces signaux qui va pouvoir induire un patron spatial d’identités et de comportements cellulaires distincts. L’acide rétinoïque (AR) est une petite molécule diffusible dérivée de la vitamine A qui contribue à la mise en place des axes du système nerveux central des vertébrés et est un régulateur crucial de la différentiation neuronale. D’autre part, il a été montré que les signaux à l’AR affectaient le phénotype de neurotransmetteurs exhibé par des sous-populations neuronales et jouent des rôles divers dans la morphogenèse du système nerveux périphérique issu des placodes crâniennes et des cellules des crêtes neurales. Néanmoins, bien que le rôle de l’AR dans la régionalisation du système nerveux central ait été étudié de manière extensive, nous en savons beaucoup moins au sujet de l’action de l’AR sur le développement du système nerveux périphérique, sur l’établissement des différentes identités de neurotransmetteurs, ou quant à comment ces fonctions ont évolué. Bien qu’initialement considéré comme spécifique aux vertébrés, un volume croissant de données indique désormais que l’AR serait impliqué dans le développement du système nerveux de divers taxons, tels que les cnidaires, les mollusques gastropodes ainsi que les cordés invertébrés. En particulier, l’amphioxus, céphalocordé dont l’évolution est lente, est connu pour posséder un système de signalisation à l’AR semblable à celui des vertébrés. Le génome de l’amphioxus présente un haut degré de conservation de sa synténie par rapport à celui des vertébrés et exhibe relativement peu de pertes ou de duplications indépendantes de ses gènes développementaux. Par conséquent, l’embryogenèse ainsi que la morphologie de l’amphioxus ressemble par bien des points à celles des vertébrés, ce qui facilite l’identification des traits ancestraux et dérivés et en fait donc un modèle approprié à la recherche comparative. Cette étude vise à fournir une description détaillée de différentes populations neurales au sein du système nerveux périphérique de l’amphioxus et d’explorer les rôles joués par l’AR dans ce processus. À cette fin, des analyses d’expression de gènes et d’immunohistochimie ont été utilisées, en vue d’identifier les différentes sous-populations de progéniteurs et les différents types de cellules neurales. De plus, les niveaux de signaux à l’AR ont été altérés pharmacologiquement à différents stades de développement de l’amphioxus, pour déterminer leurs effets sur la formation des populations neurales identifiées, ainsi que sur les patrons de prolifération et d’apoptose. Les résultats inclus dans ce travail révèlent la présence de différentes populations de cellules neurales chez l’amphioxus et mettent en lumière leur vraisemblable relation phylogénétique avec les structures leur correspondant chez les vertébrés. Par ailleurs, différents rôles contexte-dépendants de la signalisation à l’AR on été documentés, incluant la mise en place de frontières discrètes dans le système nerveux central et l’ectoderme de l’embryon d’amphioxus, et la régulation du développement des progéniteurs neuraux tardifs dans le système nerveux périphérique de manière spécifique à leur type cellulaire. / The nervous system provides internal interconnection to multi-cellular animals. It enables them to integrate the physiological activities of their different components into one functional entity that can successfully interact with its environment. The evolution and development of complex nervous systems is one of the most fascinating questions of biological research. In order to generate a diversity of neural cell types and neural connections, metazoan animals deploy a surprisingly small number of instructive developmental signals, which crosstalk in a dynamic manner to induce a spatial pattern of cell identities and behaviors.Retinoic acid (RA) is a small diffusible signaling molecule derived from vitamin A that contributes to the axial patterning of the vertebrate central nervous system and functions as a crucial regulator of neuronal differentiation. Moreover, RA signals have been shown to affect the neurotransmitter phenotype of specific neuronal subsets and play distinct roles during the morphogenesis of the peripheral nervous system from cranial placodes and neural crest. However, while the role of RA signaling in the regionalization of the central nervous system has been extensively studied, much less is known about its actions in cranial placodes and neural crest derivatives, in the establishment of different neurotransmitter identities, or how these functions might have evolved.Albeit initially believed to be vertebrate-specific, a growing body of evidence now implicates RA signaling in the nervous system development of various distant taxa, such as cnidarians, gastropod mollusks and invertebrate chordates. In particular, the slow evolving cephalochordates, commonly called amphioxus, are known to possess a vertebrate-like RA signaling system. The amphioxus genome has retained a high degree of synteny with vertebrate genomes and exhibits relatively little losses or independent duplications of developmental genes. Accordingly, amphioxus embryogenesis and morphology also display remarkable similarity with vertebrates, which allows the identification of ancestral as well as newly derived traits and makes these animals attractive models for comparative research.This study aims at providing a detailed description of the development of different neural cell populations in the central and peripheral nervous system of amphioxus and explores the roles played by RA signaling during this process. To this end, gene expression analyses and immunohistochemistry were used, in order to identify distinct subsets of neural progenitors and neural cell types. Furthermore, RA signaling levels were manipulated pharmacologically at different stages of amphioxus development, to assess their effects on the formation of identified neural cell populations as well as on proliferation and apoptosis patterns. The results presented in this work reveal the presence of distinct neural cell populations in amphioxus and highlight their likely phylogenetic relationships with corresponding structures in other chordates. In addition, several context-dependent functions of RA signaling were documented, which include the generation of discrete boundaries in the central nervous system and ectoderm of amphioxus embryos as well as the cell type-specific regulation of late neural progenitor development in the peripheral nervous system. The observed roles of RA signaling in the amphioxus neural tube and peripheral nervous system correspond well to those reported for the vertebrate hindbrain and cranial placodes, supporting the current hypothesis of a close evolutionary relationship between these structures and suggesting that the involvement of RA signals in their development is a conserved feature of chordates.

DANS L'ETUDE DES PROCESSI D'EVOLUTION DU DEVELOPPEMENT, LES FACTEURS DE TRANSCRIPTION SONT IMPORTANTS CAR ILS REGULENT L'EXPRESSION GENIQUE AU COURS DU DEVELOPPEMENT. PARMI CES FACTEURS, LES RECEPTEURS NUCLEAIRES (RNS) ONT UN STATUT PARTICULIER CAR LEUR ACTIVITE EST REGULEE PAR UN LIGAND. DURANT MA THESE, JE ME SUIS INTERESSEE A L'EVOLUTION DES RNS CHEZ LES CHORDES (TELS QUE LES VERTEBRES, LES TUNICIES ET L'AMPHIOXUS) EN ETUDIANT DEUX RNS PARTICULIERS : LES RECEPTEURS AUX OESTROGENES (ER) ET AUX HORMONES THYROÏDIENNES (TR), CHEZ L'AMPHIOXUS BRANCHIOSTOMA FLORIDAE. AINSI, J'AI ETUDIE LE ROLE DE TR DANS L'EVOLUTION DE LA METAMORPHOSE CHEZ LES CHORDES. BIEN QUE LA PLUPART DES CHORDES METAMORPHOSENT, LES MODIFICATIONS MORPHOLOGIQUES CORRESPONDANTES SONT TRES VARIABLES D'UNE ESPECE A L'AUTRE. CETTE VARIABILITE MORPHOLOGIQUE SE REFLETE-TELLE DANS LE DETERMINISME MOLECULAIRE DE LA METAMORPHOSE ? CE DERNIER EST ENCORE MAL CONNU EN DEHORS DES MODELES VERTEBRES CLASSIQUES CHEZ QUI LA METAMORPHOSE EST INDUITE PAR LA FIXATION DES HORMONES THYROÏDIENNES (HTS) SUR TR. PAR DES APPROCHES BIOINFORMATIQUES ET BIOCHIMIQUES, J'AI ETABLI QUE LE PROTOCHORDE AMPHIOXUS PRODUIT DES HTS PAR UNE VOIE METABOLIQUE HOMOLOGUE A CELLE DES VERTEBRES. J'AI ALORS MONTRE QUE LES HTS REGULENT LA METAMORPHOSE DE L'AMPHIOXUS, EN MODULANT L'ACTIVITE DE TR, COMME CHEZ LES VERTEBRES. J'AI AINSI PROPOSE QUE LA CONSERVATION DU DETERMINISME MOLECULARE (LE COUPLE TH/TR) DE LA METAMORPHOSE CHEZ LES CHORDES EN REVELE L'HOMOLOGIE, ALORS QUE LES AUTRE PARTIES DE LA VOIE DE REGULATION ONT ETE MOINS CONSERVEES AU COURS DE L'EVOLUTION ET EXPLIQUENT LA DIVERSITE MORPHOLOGIQUE QUE L'ON OBSERVE DE NOS JOURS.