Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2016-08-02T11:48:25Z No. of bitstreams: 1 2011 - Wellington Oliveira da Cruz.pdf: 7968929 bytes, checksum: 9dd68ee567386fa437d5f3438c9db428 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T11:48:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011 - Wellington Oliveira da Cruz.pdf: 7968929 bytes, checksum: 9dd68ee567386fa437d5f3438c9db428 (MD5) Previous issue date: 2011-09-16 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior, CAPES. / CRUZ, Wellington Oliveira. Characterization of Alphitobius diaperinus (Coleoptera, Tenebrionidae) ?-amylase: Effect of Different Birds Diet and Inhibitors from Phaseolus vulgaris. 2011. 50 p Disserta??o (Mestrado em Qu?mica, ?rea de Concentra??o Bioqu?mica). Instituto de Ci?ncias Exatas, Departamento de Qu?mica, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Serop?dica, RJ, 2011. Alphitobius diaperinus known as mealworm of poultry litter, is one of the main poultry pests. It uses high protein and carbohydrates substrate of birds as a food source, colonizing all the production area finding a favorable environment for its proliferation. This insect causes sanitary and economic problems, affecting not only healthy and growth of the poultry but also acting as a microorganisms transmitter like bacterias, protozoas and virus. In this work it was identified an ?-amylase activity in crude extracts of A. diaperinus larvae and adults. This enzyme is responsible for starch degradation used as a energy source extremely important for survival of many insects. The ?-amylase was partially purified by ammonium sulfate precipitation (25-75%) in a chromatographic Sephadex column G (50-80), polyacrylamide gel revealed only one band with molecular weight of approximately 30 kDa, its purity was confirmed by the method of enzyme activity assay dinitrosalicylic 3.5-alkaline (DNS) was increased 7.2 times when compared with the crude extract. The ?-amylase assays presented a maximum activity at a pH 5.0 and pH 5.6 and an optimal activity temperature of 50 ? C. The maximum activity of ?-amylase A. diaperinus was achieved in the presence of 0.02 mM CaCl2, and inhibited by increasing this reaction concentration. The enzymatic activity of A. diaperinus ?-amylase was significantly inhibited by amylase inhibitor ?-AIs (lectin-like inhibitor) of Phaseolus vulgaris, suggesting that this inhibitors can be used as an important tool in biological control and development of these pests by reducing the digestion reducing amylase activity which plays an important role in the starch digestion / CRUZ, Wellington Oliveira. Caracteriza??o de ?-amilase de Alphitobius diaperinus (Coleoptera, Tenebrionidae): Efeito de Diferentes Ra??es de Aves e dos Inibidores de Phaseolus Vulgaris. 2011. 50 p Disserta??o (Mestrado em Qu?mica, ?rea de Concentra??o Bioqu?mica). Instituto de Ci?ncias Exatas, Departamento de Qu?mica, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Serop?dica, RJ, 2011. Alphitobius diaperinus, conhecido como cascudinho de cama avi?ria, ? uma das principais pragas av?colas. Ele utiliza o substrato das aves rico em prote?nas e carboidratos como fonte de alimento, colonizando toda a ?rea de produ??o, encontrando um ambiente favor?vel para sua prolifera??o. Este inseto causa problemas sanit?rios e econ?micos, afetando a sa?de e o crescimento das aves e atuando tamb?m como transmissor de microrganismos tais como baact?rias, protozo?rios e v?rus. Neste trabalho foi identificada a presen?a de uma ?-amilase no extrato bruto de larvas e adultos de Alphitobius diaperinus. Esta enzima digestiva ? respons?vel pela degrada??o de amido utilizado como combust?vel na obten??o de energia, sendo extremamente importante para sobreviv?ncia de muitos insetos. A ?-amilase foi parcialmente purificada por precipita??o em sulfato de am?nio (25-75 %) em coluna cromatogr?fica Sephadex G (50-80), revelando em gel de poliacrilamida uma ?nica banda com peso molecular de aproximadamente 30 KDa. Sua pureza enzim?tica foi confirmada atrav?s de ensaio de atividade pelo m?todo 3,5-dinitrosalic?lico alcalino (DNS), observando-se um aumento de 7.2 vezes em rela??o ao extrato bruto. A ?-amilase ensaiada apresentou uma atividade m?xima em pH 5.0 e pH 5.6 e uma temperatura de atividade ?tima de 50?C. A atividade m?xima da ?-amilase de A. diaperinus foi alcan?ada na presen?a de 0.02 mM de CaCl2, e inibida com o aumento da concentra??o deste reagente. A atividade enzim?tica da ?-amilase de A. diaperinus, foi significativamente inibida pelo inibidor ?-AIs, (inibidores tipo lectina) de Phaseolus vulgaris, sugerindo que estes podem ser utilizados como importantes ferramentas biol?gicas no controle e desenvolvimento de A. diaperinus atrav?s da redu??o da atividade digestiva destas pragas devido a atua??o desses inibidores sobre a a??o catalisadora de amilases, enzimas fundamentais para a digest?o de amido

This study has assessed the effects of pulse type and processing (soaking and cooking) on antinutritional factors (α-amylase inhibitor, trypsin inhibitor, chymotrypsin inhibitor, lectins, phytic acid and oxalates) in a wide range of Canadian pulses, using soybean as a control. The contents of these antinutrients in Canadian pulses varied widely, but the levels were generally lower than those found in soybean. Analysis of variance indicated that both pulse type and processing had significant effects (P < 0.0001) on the investigated seeds. Soaking markedly decreased the contents of α-amylase inhibitor, trypsin inhibitor, chymotrypsin inhibitor, lectins and oxalates, but had no impact on phytic acid. Cooking of presoaked seeds appeared to be more effective; all proteinaceous antinutrients (α-amylase inhibitor, trypsin inhibitor, chymotrypsin inhibitor and lectins) were decreased by 80 – 100%, and significant reductions in phytic acid content (11 – 39%) were observed for all pulses, except common beans and soybean. / February 2016

Inibidores de alfa amilase de feijão (Phaseolus vulgaris) foram caracterizados. O inibidor da variedade Jalo apresentou peso molecular de 50kDa (por filtração em gel), ponto isoelétrico de 4,75 e 9,6% de carboidratos. O inibidor da variedade Argentino apresentou peso molecular de 48kDa, ponto isoelétrico de 4,90 e 7,6% de carboidratos. Ambos inibidores apresentaram pH ótimo de interação com alfa amilase pancreática de porco de 5,0 e, a pH 6,9, a complexação com a mesma enzima se deu na proporção de 1:1. Esses resultados, mais a composição de aminoácidos, indicaram que as características desses inibidores são semelhantes às de outros já purificados de diferentes variedades de feijão. As principais diferenças entre o IA do Jalo e do Argentino, foram observadas através de termogramas, do teor de carboidratos e dos ensaios imunológicos. Além disso, são sintetizados entre 20 e 30 dias após a floração, sendo que o processo ocorre simultaneamente ao da síntese das proteínas de reserva do grão. Inibidores purificados das variedades Jalo, Argentino e Rico 23, em diferentes fases do desenvolvimento, indicaram ausência de grandes alterações estruturais durante esse processo. / &#945;-amylase inhibitors of bean (Phaseolus vulgaris) were characterized. The amylase inhibitor from Jalo had molecular weight of 50 kDa (by gel filtration), an isoeletric point of 4.75 and a carbohydrate content of 9.6%. Argentino presented molecular weight of 48 kDa, an isoeletric point of 4.90 and a carbohydrate content of 7.6%. The optimum pH for inhibition of porcine pancreatic &#945;-amylase for both inhibitors was about 5.0 and they formed 1:1 stoichiometric complex. These results and the amino acid composition indicated that these inhibitors have characteristics similar to others already purified from beans. They were synthesized between 20 and 30 days after anthesis and this process occurred simultaneously to the storage proteins synthesis. Purified inhibitors from seeds in different phases of development indicated lack of great structural changes during this process.

Inibidores de alfa amilase de feijão (Phaseolus vulgaris) foram caracterizados. O inibidor da variedade Jalo apresentou peso molecular de 50kDa (por filtração em gel), ponto isoelétrico de 4,75 e 9,6% de carboidratos. O inibidor da variedade Argentino apresentou peso molecular de 48kDa, ponto isoelétrico de 4,90 e 7,6% de carboidratos. Ambos inibidores apresentaram pH ótimo de interação com alfa amilase pancreática de porco de 5,0 e, a pH 6,9, a complexação com a mesma enzima se deu na proporção de 1:1. Esses resultados, mais a composição de aminoácidos, indicaram que as características desses inibidores são semelhantes às de outros já purificados de diferentes variedades de feijão. As principais diferenças entre o IA do Jalo e do Argentino, foram observadas através de termogramas, do teor de carboidratos e dos ensaios imunológicos. Além disso, são sintetizados entre 20 e 30 dias após a floração, sendo que o processo ocorre simultaneamente ao da síntese das proteínas de reserva do grão. Inibidores purificados das variedades Jalo, Argentino e Rico 23, em diferentes fases do desenvolvimento, indicaram ausência de grandes alterações estruturais durante esse processo. / &#945;-amylase inhibitors of bean (Phaseolus vulgaris) were characterized. The amylase inhibitor from Jalo had molecular weight of 50 kDa (by gel filtration), an isoeletric point of 4.75 and a carbohydrate content of 9.6%. Argentino presented molecular weight of 48 kDa, an isoeletric point of 4.90 and a carbohydrate content of 7.6%. The optimum pH for inhibition of porcine pancreatic &#945;-amylase for both inhibitors was about 5.0 and they formed 1:1 stoichiometric complex. These results and the amino acid composition indicated that these inhibitors have characteristics similar to others already purified from beans. They were synthesized between 20 and 30 days after anthesis and this process occurred simultaneously to the storage proteins synthesis. Purified inhibitors from seeds in different phases of development indicated lack of great structural changes during this process.

Não consta resumo na publicação. / An &#945;-amylase inhibitor purified from black beans (Phaseolus vulgaris L.) prevents the utilization of starch either in normal or diabetic rats during short-time starch loading tests. It causes hypoglycaemia and alters accordingly the serum insulin and non esterified fatty acids levels. These effects are dose dependent and doses higher than 31 mg of the inhibitor can promote the complete smoothing on serum glucose level. The existence of starch in the presence of the inhibitor in the intestine doesn\'t alter the secretion or production of &#945;-amylase by the pancreas.

Não consta resumo na publicação. / An &#945;-amylase inhibitor purified from black beans (Phaseolus vulgaris L.) prevents the utilization of starch either in normal or diabetic rats during short-time starch loading tests. It causes hypoglycaemia and alters accordingly the serum insulin and non esterified fatty acids levels. These effects are dose dependent and doses higher than 31 mg of the inhibitor can promote the complete smoothing on serum glucose level. The existence of starch in the presence of the inhibitor in the intestine doesn\'t alter the secretion or production of &#945;-amylase by the pancreas.

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:38:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cibeli May Villalba.pdf: 4939252 bytes, checksum: 5a6b5eaea0352844ad9868a7a9b79f0b (MD5) Previous issue date: 2012-03-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Proteins are the most abundant biomolecules in living organisms; they are present in all parts of a cell. They have different functions; their structural study is important because it brings greater insight into its functions and allows us to understand how they interact to each other and with the other molecules. Protein structures can be studied experimentally especially by the X-ray diffraction technique and computationally by homology modeling. Thus, in this work, structural studies were made with the alpha-amylase inhibitor from rye (Secale cereale), which inhibits the activity of amylase and then can be used in the treatment of Diabetes mellitus, obesity, pest control, amongst other applications. Through chromatographies, two different inhibitors could be separated, namely A2 and B2, which were crystallized, but did not show a minimum X-ray diffraction quality. Thus, a structural study was performed with data from a twinned crystal previously obtained, yet current refinement programs can now deal with such data. The structure was refined and compared with the alpha-amylase inhibitor 0.19 from wheat. Then, structural studies were also performed for the YchF GTPase and enolase from Trypanosoma cruzi; both have been studied with the possibility of being used as a target in the treatment of Chagas' disease. Initially, trials to express heterologously and to purify them for crystallization trials were performed; yet those were unsuccessful, a computational work was pursued, in which alignments and homology modelling for both proteins were made. The computational work was continued for Trypanosoma cruzi enolase,in which comparisons with the Homo sapiens enolase to seek and plan inhibitors for the former, through literature and data bank searches, were made; thus, docking of these was performed, which pointed more favorable binding energies for the substrates, phosphoenolpyruvate (PEP) and 2-phosphoglycerate (PG2), for the inhibitor phosphonacetohydroxamate (PAH) and for the compound coded ZINC25695689 from the ZINC (ZINC Is Not Commercial) data bank. Also, from the experimental position of the PAH inhibitor (deposited in the PDB, code 2PTZ), the interaction energies for these searched and planned molecules were estimated,through the AMBER molecular dynamics program, and, apparently, the presence of a chlorine atom conveniently bound to the inhibitor could promote an improvement of the interaction energy. / As proteínas são as biomoléculas mais abundantes nos seres vivos, estando presentes em todas as partes de uma célula. Elas possuem diferentes funções no organismo; seu estudo estrutural é importante, pois traz maior conhecimento sobre suas funções e possibilita entender como interagem entre elas e com outras moléculas. A estrutura de proteínas pode ser estudada experimentalmente principalmente por meio da técnica de difração de raios X e computacionalmente por meio da modelagem por homologia. Sendo assim, realizaram-se neste trabalho estudos estruturais com o inibidor de alfa-amilase do centeio (Secale cereale), que inibem a atividade amilásica e que podem ser utilizados em tratamento de Diabetes mellitus, obesidade, controle de pragas, entre outros usos. Por meio de cromatografias, puderam-se separar dois diferentes inibidores, denominados A2 e B2, que foram cristalizados, mas não apresentaram mínima qualidade de difração de raios X. Assim, realizou-se um estudo estrutural com dados de difração obtidos anteriormente para um cristal geminado, dada a possibilidade atual dos programas de refinamento de tratarem este problema. A estrutura foi refinada e comparada com o inibidor de alfa-amilase 0,19 do trigo. Em sequência, estudos estruturais também foram realizados para a proteína YchF da família das GTPases e para a enolase de Trypanosoma cruzi; ambas vêm sendo estudadas com a possibilidade de serem usadas como alvo no tratamento da doença de Chagas. Inicialmente tentou-se expressá-las de maneira heteróloga e purificá-las para a realização de ensaios de cristalização; com o insucesso disto, partiu-se para um trabalho computacional em que se fizeram alinhamentos e modelos por homologia para as duas proteínas. O trabalho computacional foi continuado para a enolase de Trypanosoma cruzi, comparando-a com a enolase de Homo sapiens para se buscar e planejar inibidores para a primeira, por meio de pesquisa na literatura e em bancos de dados; assim, fez-se a alocação ("docking") destes, obtendo-se energias de ligação mais favoráveis para os substratos, fosfoenolpiruvato (PEP) e 2-fosfoglicerato (PG2), para o inibidor fosfonacetohidroxamato (PAH) e para o composto codificado ZINC25695689 do banco de dados ZINC (ZINC Is Not Commercial). Também, a partir da posição experimental do inibidor PAH (depositada no PDB, código 2PTZ) estimaram-se as energias de interação para as moléculas pesquisadas e planejadas, através do programa de dinâmica molecular AMBER e, aparentemente, a presença de um átomo de cloro convenientemente ligado ao inibidor poderia promover melhoria da energia de interação.