O presente trabalho, teve como objetivo, dar continuidade ao estudo apresentado na forma de dissertação de mestrado, utilizando a complexona EDTA, totalmente \"neutralizada\". na forma de Y4-. Na titulação de íons metálicos, a hidrólise acentuada deste ânion, Y4-, causa um aumento marcante de pH após o ponto estequiométrico. Esta variação de pH pode ser acompanhada potenciometricamente, utilizando um eletrodo de vidro, ou visualmente com um indicador ácido/base como a fenolftaleina, em substituição a indicadores metalocrômicos. Uma série de parâmetros foram considerados na preparação do reagente, sua armazenagem e padronização bem como os problemas ligados a percentagem de \"neutralização\". Vários equilíbrios foram considerados no desenvolvimento de um programa em linguagem BASIC, para interpretar a curva teórica da titulação de Mg2+ com EDTA \"tetraneutralizado\", na qual participam também espécies como MgHY-, antes do ponto estequiométrico. Um método complexométrico rápido e preciso foi desenvolvido com este titulante para determinar Mg2+ e SO42- simultaneamente (este por método indireto para o excesso de íons Ba2+) com viabilidade para ser aplicado em água do mar e em concentrados salinos. O método mostrou-se adequado, também, para a determinação da mistura Ca2+ e Mg2+, em substituição ao método clássico com tampão e indicador metalocrômico, eriocromo T. / This thesis has the purpose to give continuity to a former study from the master dissertation, about the use of the complexon EDTA, totally \"neutralized\", as the species Y4-. During the titration of metallic cations the marked hydrolysis of the y4- anion causes a marked pH increase after the stoichiometric point. This change of pH can be followed potentiometrically with the glass electrode or by visual end point indication by on acid/base indicator as phenolphtalein instead of metalochromic indicators. A serie of parameters were considered in the preparation of the titrant, its storage and standardization as well as problems related with the percent neutraIization\". Equilibria were considered and used in a computer program in BASIC language in order to interpret the theoretical titration curve. The species MgHY- was found in significant contribution before the end point. A fast and precise complexometric method was developed with this titrant for Mg2+ and SO42- simultaneously (this last by titration of excess of standard Ba2+ solution). The method has been found adequate to determine mixture of Ca2+ and Mg2+ instead of the classic method which uses a buffer and eriochrome T as indicator.

Los alérgenos y contaminantes alimentarios representan uno de los problemas de salud pública más extendidos del mundo. El monitoreo de posibles contaminantes resulta importante para la protección del consumidor así como también para controlar el cumplimiento de las regulaciones internacionales de etiquetado. La seguridad alimentaria sólo puede ser asegurada a través de la implementación de sistemas de control de calidad a lo largo de toda la cadena de producción desde la materia prima hasta el consumidor final. En este contexto, la disponibilidad de métodos rápidos, confiables y altamente sensibles resulta imperativo para su utilización como alarma en la detección de contaminantes, permitiendo una respuesta inmediata. Actualmente se dirigen grandes esfuerzos al desarrollo de metodologías simples, selectivas y económicas para la detección in situ de diferentes analitos en matrices complejas. En esta tesis se han desarrollado y evaluado nuevas estrategias inmunoanalíticas para la seguridad alimentaria, basadas en la integración de micro y nanopartículas así como bionanopartículas modificadas. Dos analitos de diferentes tamaños y características fueron estudiados como modelo: por un lado la gliadina, como alérgeno proteico, y por otro, la Salmonella, como ejemplo de patógeno alimentario. Se evaluaron diferentes formatos de inmunoensayo (competitivo y sándwich, directo e indirecto), aprovechando las ventajas del uso de partículas magnéticas como soporte sólido. Los resultados obtenidos fueron evaluados tanto por detección óptica como electroquímica, utilizando magneto inmunoensayos o inmunosensores, respectivamente. En todos los casos, las señales fueron obtenidas mediante conjugados con la enzima peroxidasa como marcadores ópticos o electroquímicos, analizando tanto el desempeño analítico como el efecto matriz a través de muestras alimentarias dopadas. En el caso de la integración de partículas magnéticas para la detección de gliadina, se desarrolló una estrategia competitiva que permitiera tanto la detección de la proteína nativa como también de fragmentos hidrolizados durante la producción de alimentos. Se obtuvieron excelentes límites de detección (del orden de μg L-1), muy por debajo de los 20 mg kg-1 establecidos por las regulaciones europeas para alimentos libres de gluten. Adicionalmente se lograron excelentes valores de recuperación al analizar muestras alimentarias dopadas como leche y cerveza libre de gluten. También se evaluó por otro lado, la integración en los inmunoensayos de bionanomateriales como los bacteriófagos, utilizando el P22 como modelo para la detección de Salmonella. Se diseñaron bionanopartículas híbridas a través de i) la inmovilización de bacteriófagos sobre micro y nanopartículas magnéticas, y ii) la modificación de la cápside con marcas de biotina. Los fagos altamente biotinilados obtenidos fueron empleados tanto para la marcación de bacterias, al unirse con marcadores fluorescentes, ópticos o electroquímicos conjugados a estreptavidina, así como para la captura al ser acoplados a partículas magnéticas modificadas con estreptavidina. Las bionanopartículas fueron caracterizadas mediante numerosas técnicas, como métodos de cultivo microbiológico, electroforesis, microscopía confocal de fluorescencia, así como microscopías electrónicas de barrido y transmisión. En todos los casos, se desarrollaron estrategias no competitivas integrando los fagos como marca o elemento bioreconocimiento. Se logró una considerable reducción del tiempo de detección de 3 a 5 días necesarios en las técnicas microbiológicas clásicas, a tan sólo 2-4 hs. Adicionalmente, se alcanzaron límites de detección excepcionales, lográndose detectar por debajo de 102 CFU mL-1 de Salmonella en muestras de leche, y tan sólo 1 CFU en 25 mL luego de 6 hs de preenriquecimiento. Por último, cabe destacar que en todos los casos se obtuvo mejor sensibilidad y menor efecto matriz utilizando detección electroquímica. En consecuencia, los biosensores desarrollados resultan en una herramienta prometedora para aplicaciones dentro del campo alimentario debido a su capacidad de detección rápida e in situ, así como también la facilidad de miniaturización y compatibilidad para producción en masa. / Food allergens and food contaminants represent an important health problem worldwide. Tracking and tracing of hazard-free food production chains has become important due to consumer-safety concerns and to fulfill international labeling regulations. Food safety can only be ensured through the enforcement of quality-control systems throughout the entire food chain from the incoming raw materials until the final consumer. In this context, the availability of rapid, reliable and highly sensitive methods is mandatory for their use as an “alarm” to rapidly detect potential contaminants and take an immediate action. Therefore, great efforts are directed towards the development of simple, selective and cost-efficient methodologies for the on-site detection of different target analytes in complex food samples. This dissertation addresses a comprehensive study and assessment of novel and rapid immunoanalytical strategies in different formats by the integration of micro and nanoparticles as well as hybrid bionanoparticles for food safety. Two analytes of different sizes and characteristics (single and multivalence targets) affecting food safety, were selected as a model: the small proteic allergen gliadin and the food-borne pathogen Salmonella. Different immunoassay formats were assessed (competitive and sandwich, direct and indirect) taking advantage of the outstanding features of magnetic micro and nanoparticles as solid support. The results obtained with the novel strategies were evaluated by a dual detection through optical and electrochemical readouts, using magneto immunoassays or magneto immunosensing approaches, respectively. In all cases the signals were obtained by a horseradish peroxidase (HRP) conjugate as the enzymatic optical and electrochemical reporter and the matrix effect and analytical performance were evaluated using spiked food samples. Regarding the integration of magnetic particles in the detection of food allergens such as gliadin, a competitive approach was developed to detect not only the native protein, but also the small gliadin fragments, being thus valid for both non-treated and hydrolyzed foodstuff. Excellent detection limits (in the order of μg L-1) were achieved, much lower than the EC recommendation of 20 mg kg-1 for glutenfree food. Furthermore the matrix effect, as well as the performance of the assays was successfully evaluated using spiked gluten-free foodstuffs, such as skimmed milk and gluten-free beer, obtaining excellent recovery values. The integration of bionanomaterials as bacteriophages into the immunoassays was also explored, using P22 bacteriophage as a model to detect Salmonella. Hybrid bionanoparticles were designed and evaluated by i) immobilizing the bacteriophages on magnetic micro and nanoparticles and ii) modifying the phage capsid proteins with biotin tags. The highly biotinylated bacteriophages were applied for bacterial tagging when coupled to fluorescent, optical or electrochemical streptavidin-conjugated reporters, as well as for bacteria capturing when attached to streptavidin-modified magnetic particles. The novel hybrid bionanoparticles were extensively characterized through a wide range of techniques, such as microbiological culturing methods, electrophoresis, confocal fluorescence microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. In all cases, non-competitive approaches were developed by integrating the bacteriophages both for the biorecognition and tagging of Salmonella Thyphimurium. All the strategies were able to considerably reduce the time of the bacteria detection from the 3-5 days required in the conventional microbiology techniques, to as low as 2-4 h. In addition, outstanding limits of detection were achieved, being able to detect below 102 CFU mL-1 of Salmonella in milk samples, and as low as 1 CFU in 25 mL after 6 h pre-enrichment. Finally, it should be pointed out that better sensitivity and lower matrix effect were achieved with the electrochemical detection. As a result, the developed biosensing devices are promising tools for food safety applications due to their rapid and on-site testing capability as well as the compatibility with miniaturization and mass fabrication technologies.

En la actualidad, está ampliamente aceptado en Europa que la investigación y la innovación son factores clave para reforzar la capacidad industrial y las perspectivas de negocios. La tecnología es necesaria para abordar los problemas del mundo, pero también lo es la investigación, que permite la aparición de tecnologías innovadoras. Por lo tanto, invertir en investigación e innovación es esencial para el desarrollo de soluciones para los desafíos sociales, como por ejemplo la seguridad alimentaria. En este contexto, surge el término KETS (Key Enabling Technologies), que permite unificar diferentes campos de la ciencia, tales como la nanotecnología, los materiales avanzados y la biotecnología, entre otros. Esto indica una clara convergencia de la tecnología en el desarrollo de nuevas soluciones. Por ejemplo, con el fin de ofrecer soluciones en seguridad alimentaria, la investigación en química analítica no está solamente basada en el desarrollo de estrategias para obtener información cualitativa y cuantitativa sobre la composición y naturaleza de las sustancias, sino que ésta ha convergido en un campo de investigación más aplicado y multidisciplinar, formando alianzas entre diferentes áreas de conocimiento a través de la ciencia. Esta nueva concepción abre la posibilidad de crear nuevos principios analíticos, procedimientos de detección automatizados o in-situ, así como sondas de detección específica o nuevos dispositivos sensores. La presente Tesis doctoral es el resultado de dicho carácter multidisciplinar de la química analítica, y con el objetivo de proporcionar soluciones a problemas relacionados con la seguridad alimentaria, se ha desarrollado un nuevo dispositivo sensor en base a conocimientos de química analítica pero también de biotecnología, microbiología y materiales avanzados. Por ello, el primer apartado de este trabajo pretende ser una introducción general sobre la inocuidad de los alimentos y su importancia a nivel mundial, haciendo especial énfasis en los patógenos alimentarios emergentes responsables de los principales brotes y la contribución de la tecnología de los biosensores como factor conductor para el desarrollo de nuevas metodologías para la detección de bacterias transmitidas por los alimentos mediante técnicas de multiplexado. Además, se discutirá también la integración de nuevos materiales con dimensiones nano/micrométricas en biosensores electroquímicos, destacando algunas de las ventajas de las partículas magnéticas: i) su capacidad para preconcentrar las bacterias presentes en muestras complejas mediante una reacción inmunológica ii) us uso como plataforma para el bioreceptor en los dispositivos de biosensores iii) o como soporte para la inmovilización magnética en la superficie de un electrodo de trabajo por atracción magnética. Los métodos de detección para seguridad alimentaria actuales han permitido un avance significativo en relación al desarrollo de métodos rápidos y sensibles, en los que la implementación de bioensayos con capacidad de multiplexado es una de las tendencias emergentes. Sin embargo, se han descrito pocas estrategias basadas en biosensores electroquímicos para la detección simultánea de bacterias en alimentos. Por esta razón, en el presente trabajo se propone desarrollar un biosensor electroquímico que detecte simultáneamente Salmonella enterica, Listeria monocytogenes y Escherichia coli, basado en el uso de partículas magnéticas. Las estrategias presentadas en esta Tesis doctoral se basan por un lado en un reconocimiento electroquímico inmunológico, que proporciona la detección de las células bacterianas, y por otro un reconocimiento genético, que permite la detección del ADN bacteriano. Estas dos estrategias se combinan con un paso de separación inmunomagnética que da lugar a la captura y preconcentración de las bacterias a partir de muestras de alimentos. Así, se ha realizado un estudio de las partículas magnéticas de diferentes tamaños (micro y nanométrica), para después efectuarse la separación inmunomagnética de S. enterica, L. monocytogenes y E. coli. Además, se han comparado posteriormente las dos estrategias para la detección de Salmonella, usándose como modelo muestras leche. Finalmente, se describe una estrategia de PCR multiplexada combinada con un magneto-genosensor electroquímico usando partículas magnéticas de sílice para la detección simultánea de S. enterica, L. monocytogenes y E. coli. / Nowadays, it is widely recognised in Europe that research and innovation are key factors to reinforce the industrial capacities and business perspectives. We need technology to address world´s problems, but we also need research to develop innovative technologies. Therefore, investing in research and innovation is essential to develop solutions for societal challenges, as for instance Food Safety. In this context, it comes out the term KETs (Key Enabling Technologies) to unify different fields across science, such as Nanotechnologies, Advanced materials, Biotechnology, among others. This indicates a clear convergence of technologies to address new solutions. For instance, analytical chemistry research is not only based anymore on the development of strategies to obtain qualitative and quantitative information about the composition and nature of substances. In order to provide solutions in food safety, analytical chemistry research has been converging into a more applied and multidisciplinary research field, forming alliances between different fields across science. This opens the possibility for the creation of new analytical principles, automated or in-situ detection procedures, as well as specific detection probes or new sensing devices. This Dissertation is a result of the multidisciplinary character of analytical chemistry. The aim of providing solutions to problems related to food safety bonds different science fields as analytical chemistry, biotechnology and advanced materials for the development of a new sensing device. Therefore, it is intended to give a general introduction about food safety and its importance worldwide, with special focus on the emerging foodborne pathogens responsible for the main outbreaks and the contribution of biosensors technology as the driver factor for the development of new methodologies for foodborne bacteria detection with multiplexing capabilities. Furthermore, the integration of new materials with nano/micrometer dimensions on electrochemical biosensors will be also discussed, highlighting some advantages of the use of magnetic particles: i) preconcentration of the bacteria from complex samples through an immunological reaction, ii) as a platform for the biorecognition element in the biosensing devices iii) as a support for the magnetic immobilisation on the surface of a working electrode under magneto-actuation. The current state of art for detection methods for food safety shows a significant progress relative to the development rapid and sensitive methods, in which the implementation of bioassays with multiplexing capabilities is one of the emergent trends. However, few approaches based on electrochemical biosensors for the simultaneous detection of foodborne bacteria have been reported. For this reason, it is proposed to develop an electrochemical biosensor for the simultaneous detection of Salmonella enterica, Listeria monocytogenes and Escherichia coli, based on the use of magnetic particles. The strategies presented in this Dissertation are based on electrochemical magneto-immuno and genosensing, in which electrochemical magneto-immunosensing provides the detection of whole bacterial cells, whereas the electrochemical magneto-genosensing provides the detection of the bacterial DNA. These two strategies are combined with an immunomagnetic separation step to capture and preconcentrate bacteria from food samples. Hence, a study of different magnetic particles with micro and nanometer sizes will be achieved for the immunomagnetic separation of S. enterica, L. monocytogenes and E. coli. Afterwards, electrochemical magneto-immuno and genosensing will be compared for the detection of Salmonella in milk, as a model. Finally, triple-tagging multiplex PCR combined with an electrochemical magneto-genosensor using silica magnetic particles as a platform will be reported for the simultaneous detection of S. enterica, L. monocytogenes and E. coli.

En els últims anys, el camp dels sensors i bionsensors ha experimentat un desenvolupament exponencial degut a una combinació de diferents factors. Per una banda, existeixen noves tècniques per a la construcció de microdispositius, i per altra, a les bones característiques intrínseques que aquests dispositius presenten, com son la robustesa, la selectivitat, el baix cost i la rapidesa de resposta. Aquestes característiques els fan molt adequats per a la monitorització de molts paràmetres en camps tan diversos com el mediambiental, el mèdic, l’industrial, etc. Els elèctrodes selectius d’ions (ESIs) són sensors electroquímics que, degut al potencial electrostàtic de la seva membrana quan aquesta està en contacte amb una solució, permeten analitzar quantitativament l’analit al que és selectiva aquesta membrana. La selectivitat ve conferida per una espècie química (ionòfor) que interacciona de forma selectiva amb l’analit a determinar. La consistència física de la membrana, factor que defineix la viabilitat pràctica del sensor, ve determinada pel material emprat en la construcció d’aquesta, habitualment un polímer. Fins al moment, el material polimèric més emprat en la construcció d’ESIs de membrana de portador mòbil ha estat el policlorur de vinil (PVC). Una de les limitacions d’aquest polímer és que la incorporació de material biològic per a la construcció de biosensors no és fàcil degut a l’ús de dissolvents orgànics (normalment tetrahidrofurà). Les proteïnes (enzimes, anticossos) no es dissolen bé en aquests dissolvents, i se n’alteren les propietats, fet que dificulta abastament l’ús del PVC per a la construcció d’aquest tipus de dispositius. En el treball d’investigació presentat en aquesta tesi, s’estudien polímers alternatius al PVC per a la construcció de quimiosensors i biosensors potenciomètrics. Concretament, polímers amb sofre com la polisulfona i la poli(èterètercetona) sulfonada (SPEEK) que, per les seves característiques, s’han considerat que poden ser bons candidats alternatius. S’ha decidit estudiar el SPEEK perquè és un material que, a més de presentar bones característiques físiques per a la construcció de membranes potenciomètriques, té grups amb càrrega negativa que probablement afectaran la resposta del sensor. Així, s’han construït elèctrodes per a un catió (amoni) i per a un anió (nitrat). En tots dos casos la resposta ha estat raonablement correcta, però especialment positiva per a l’ió nitrat ja que la repulsió electrostàtica provocada pels grups sulfònics del polímer ha reduït l’efecte interferent dels anions estudiats. També s’ha estudiat la polisulfona que, a més de subministrar bones membranes potenciomètriques amb ionòfors convencionals per als quimiosensors, permet incorporar material d’origen biològic en l’etapa final de preparació de les membranes mitjançant el procés de precipitació del polímer per inversió de fase des d’una solució aquosa on es troben les biomolècules. D’aquesta manera no en surten malmeses i, per tant, mantenen la seva activitat. Aquesta tècnica no és viable amb el PVC i representa una gran millora en la construcció de biomembranes potenciomètriques. Com a analit model a l’hora de fabricar un quimiosensor per a anions s’ha escollit el nitrat i com a analit model per als cations, el dial.lil dimetil amoni (DADMAC). Aquest últim es va seleccionar per un requeriment d’una empresa química per a una aplicació industrial. Concretament, es volia desenvolupar un sensor per a la determinació de la concentració residual d'aquest monòmer en reaccions industrials de polímers carregats en solució. Finalment, per la major robustesa i temps de vida del ESI amb matriu de PVC, aquest és el que finalment s’ha aplicat en planta. S’han desenvolupat biosensors potenciomètrics amb membranes de polisulfona on s’han incorporat proteïnes dins la membrana polimèrica. Les proteïnes seleccionades són metal·lotioneïnes que són presents a tots els éssers vius i que presenten una elevada capacitat complexant d’ions metàl·lics. Així, per una banda s’han estudiat aquestes metal·lotioneïnes com a ionòfors, i s’ha desenvolupat un elèctrode selectiu de plata per demostrar-ne la viabilitat. Per altra banda, també s’ha construït un biosensor on aquestes proteïnes fan el paper d’agents reconeixedors de les pròpies proteïnes. Aquest darrer estudi obre una nova via pel que fa al disseny de biomembranes potenciomètriques compactes que permetrà desenvolupar sensors potenciomètrics capaços de reconèixer biomolècules carregades sense cap reacció bioquímica. / Over the last years, the field of sensors and biosensors experimented an exponential development due to the combination of several factors. On the one hand, new manufacturing technologies for microdevices have appeared and, on the other hand, the intrinsic characteristics of sensors and biosensors such as robustness, selectivity, low cost and quick response have boosted their development. These characteristics make sensors and biosensors suitable for a wide range of fields such as, inter alia, environmental, medical or industrial. Ions selective electrodes (ISEs) are electrochemical sensors, which by reason of the membrane electrostatic potential when it contacts with the solution, allow the quantitative analysis of an analyte for which the membrane is selective. This selectivity is conferred by a chemical species (ionophore) which interacts selectively with the analyte. The membrane physical consistency, which is the key factor that determines the practical viability of the sensor, is determined by the material used for its construction, usually a polymer. Up to now, polyvinyl chloride (PVC) has been the most common polymeric material used for the construction of ISE membranes of the mobile carrier type. However, one of the limitations of this polymer is the difficulty to incorporate biologic material to generate biosensors. This is due to the use of organic dissolvent - usually tetrahydrofuran. Proteins, enzymes and antibodies, do not solve properly in those organic solvents and they also suffer alterations on their characteristics. Thus, the use of PVC for such devices is not feasible. The research performed for this Ph.D. thesis is aimed at identifying alternative polymers to PVC in order to create potentiometric biosensors and quimiosensors. In particular, the thesis studies polymers containing sulfur such as polysulfone (PS) and sulfonated poly (ether ether ketone) (SPEEK) since both offer appropriate characteristics to achieve this purpose. SPEEK has been chosen – besides its good physical characteristics for potentiometric membranes- because it bears negatively charged groups, which are likely to influence on the response of the sensor. Two different paradigmatic electrodes have been built: one for a cationic analyte (amonium) and one an anionic analyte (nitrate). In both cases the results have achieved reasonably satisfactory results, especially for the anion-ISE since the electrostatic repulsion due to the sulfonic groups of the polymer reduces the interference effects. Polysulfone has also been tested as a potential candidate for making ISEs. Along with its suitability to construct potentiometric membranes with conventional ionophore for quimiosensors as carriers, this polymer also allows the incorporation of biological material in the final stage by precipitating the polymer through an inversion phase process. This process precipitates the polymer in an aqueous solution containing the desired biomolecules. By these means, biomolecules do not suffer any alteration and do maintain their biochemical activity. This option is not feasible with PVC and represents a great improvement in the construction of potentiometric membranes. Nitrate was chosen as a model analyte for making an anion quimiosensor whereas diallyldimethylammonium (DADMAC) was selected for the cation one. The latter compound was chosen following the requirement of a chemical company to conduct industrial applications, in particular for the determination of residual concentration of this monomer in industrial reactions. Following the analysis, in this case an electrode made with PVC was made on the basis of its robustness and improved life span, properties which are crucial for industrial purposes. Potentiometric biosensors have also been developed using polysulfone as matrix by studying the incorporation of proteins inside the polymeric membrane. The proteins of choice were metallothioneins, a group of proteins that can be found in every living being and which show a high affinity for metallic ions. Accordingly, a silver selective electrode was developed first to prove the feasibility of this strategy and, secondly, a biosensor was made where the metallothioneins act as detecting agent for proteins of the same family. This study provides new opportunities to design compact potentiometric biosensors since it would allow the recognition and quantification of charged biomolecules without any biochemical reaction.

En la presente disertación han sido tratados el problema de la hipersensibilidad dental y los procesos remin/demin. También han sido desarrolladas nuevas herramientas científicas para la evaluación de la eficacia de los productos dirigidos a la hipresensibilidad y a la prevención de la creación de caries dentales. Además, se han diseñado y llevado a cabo varios experimentos para investigar el estado del tejido dental mediante espectroscopia FTIR sin y con la fuente de sincrotrón. Con el objetivo de desarrollar el material oclusivo adecuado y determinar su eficacia; la porosidad de la dentina debe ser determinada. En la presente tesis doctoral ha sido desarrollada una nueva metodología para la evaluación de la eficacia del tratamiento de la hipersensibilidad dental. Este estudio se ha presentado en la primera parte del trabajo y se basa en la metodología de los discos dentinarios (dentin disc model). Los especímenes tratados con los agentes desensibilizantes han sido observados mediante la Espectroscopia Electrónica de Barrido (SEM). Las imágenes obtenidas han sido analizadas por un algoritmo automático de segmentación, desarrollado para ser usado mediante el software de MATLAB, el cual calcula el número y el área de los túbulos abiertos. Dicho método es una herramienta adecuada para que tanto científicos, como compañías privadas puedan llevar a cabo la supervisión y asistencia de los procesos remineralizantes de los tejidos dentales, o bien para el desarrollo de los nuevos productos focalizados en el problema de la hipersensibilidad dental. Las siguientes partes de la disertación se han enfocado en el problema de los procesos desmineralizantes del tejido dental. En la segunda parte de la tesis doctoral se presenta la implementación de una nueva técnica, la de Hyper Spectral Imaging (HSI) para la evaluación de la eficacia del tratamiento remineralizante. Para el análisis de los dientes humanos antes y después de la remineralización, se ha utilizado principalmente el Hyper Spectral Imaging que implementa dos tipos de cámaras de Infrarrojo Cercano (NIR) (161 y 256 canales); y como método complementario la Microscopía Confocal de Raman (CRM). Los resultados obtenidos han sido detalladamente analizados mediante una rutina de MATLAB desarrollada especialmente para analizar ese tipo de imágenes. El coeficiente de correlación y la técnica de MCR (Multivariate Curve Resolution) han sido utilizados para recabar la información necesaria de los espectros adquiridos. Gracias a su simplicidad, el método puede convertirse en una poderosa herramienta para obtener información sobre los efectos del tratamiento remineralizante aplicado sobre el tejido dental. Durante el proceso de evaluación del nuevo producto dental, ese tipo de información puede ayudar a decidir si el producto es eficaz y compararlo con otros agentes del mismo tipo. En la tercera parte de la presente tesis doctoral la Elipsometría de Infrarrojo (IRSE) y la Elipsometría con la radiación de Sincrotrón han sido escogidos para la determinación de las constantes ópticas del tejido dental humano. Los especímenes dentales han sido tratados con el producto remineralizante y analizados mediante la Elipsometría IR con la radiación de Sincrotrón. Posteriormente, una serie de experimentos y simulaciones han sido llevados a cabo para obtener una muestra de referencia adecuada para la interpretación de los datos obtenidos en el sincrotrón. En la última parte, se han estudiado los cambios de la estructura del esmalte humano y de la dentina producidos por el proceso de la remineralización. Los espectros de varios puntos de los especímenes dentales han sido comparados mediante la técnica FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy). Los datos obtenidos han sido interpretados aplicando el Análisis de Componentes Principales (PCA) y la deconvolución de los espectros (curve-fitting). Los resultados han sido comparados con las muestras de referencia de hidroxiapatita, fluorapatita y las consideradas en la bibliografía científica. / In presented dissertation a problem of hypersensitivity and remineralization/demineralization problem is treated. A novel, scientific tools for the evaluation of the efficacy of products targeting the hypersensitivity or caries creation were proposed. Moreover, experiments implementing FTIR spectroscopy as well as synchrotron techniques for the dental tissue investigation were performed. In order to design a proper sealing material and to investigate its efficacy, the porosity of the dentine has to be determined. In the present dissertation a novel methodology for the evaluation of the efficacy of the hypersensitivity treatment has been developed. It is presented in the first part of the work and is based on the dentin disc model methodology. Specimens treated with a desensitizing agent were observed under Scanning Electron Microscope (SEM) and the resulting images were analyzed by the MATLAB automatic segmentation algorithm developed to calculate the number and area of the open tubuli. The present method is a suitable scientific tool that will allow scientists and private companies the in vivo monitoring and assistance on the development of new remineralising agents. The comparison of three commercial toothpastes presented in this work showed a successful application of the developed methodology and proved it to be suitable for that kind of comparative studies. The proceeding parts of the presented dissertation were focused on the problem of the demineralization and opposite-remineralisation processes of teeth. In the second part of presented PhD thesis a novel approach implementing the Hyper Spectral Imaging (HSI) technique for the evaluation of the efficacy of the remineralising treatment is presented. Hyper Spectral Imaging (HSI) with two types of NIR cameras (161 and 256 channels) and confocal Raman microscopy (CRM) as a complementary technique were applied for analysis of teeth before and after application of different remineralizing agents. Obtained results were carefully analyzed and compared by the implementation of a MATLAB routine that used the correlation coefficient and MCR data analysis in order to obtain necessary information from the acquired spectra of dental samples. Taking into consideration the simplicity of the presented method it can be a powerful tool to obtain basic information about the performed treatment. In the process of the evaluation of a new dental product, this kind of information can lead to the decision whether to continue the development of the product or to proceed with another, more promising approach. In the third part of the presented dissertation the Infrared Spectroscopic Ellipsometry (IRSE) and synchrotron ellipsometry is proposed for the determination of the optical constants of human dental tissues. Human teeth were treated with the remineralising agent and analyzed with the synchrotron IR ellipsometer. Furtherly, a series of experiments and simulations were performed in order to obtain the most suitable reference sample for the interpretation of the obtained synchrotron data. In the last – fourth part, structural changes in the human enamel and dentin induced by the remineralization process were investigated. The spectra from various points proceeding from different locations of the tooth were compared and studied by the FTIR technique. Obtained data were interpreted applying Principal Component Analysis (PCA) and curve-fitting procedures. Obtained results were compared to the reference hydroxyl and fluorapatite powders and scientific literature.

En el marc d’aquesta tesi s’han desenvolupat tres biosistemes analítics integrats que mostren: 1) la millora substancial que suposa realitzar un procés d’integració, encara que aquest sigui parcial, en el rendiment analític de les metodologies proposades; 2) com la miniaturització, en diferents graus, permet augmentar de forma significativa la robustesa, la sensibilitat o la selectivitat dels sistemes proposats; i 3) noves solucions a la problemàtica comuna dels biosensors i biosistemes analítics consistent en la pèrdua d’activitat de l’element biològic. El primer treball descriu la construcció d’un biosensor amperomètric per a glucosa basat en un biocompòsit de grafit i resina epoxi. L’enzim glucosa oxidasa (GOD) i la sal orgànica conductora tetratiafulvalé-tetracianoquinodimetà (TTF·TCNQ) s’incorporen al compòsit per formar un biosensor renovable. S’avaluen diferents proporcions grafit/TTF·TCNQ/GOD per tal d’optimitzar el sensor pel que fa a les seves prestacions analítiques i posteriorment integrar-lo en un sistema d’anàlisi per injecció en flux (FIA), amb una cel·la dissenyada especialment a tal efecte. Els millor resultats en la determinació de glucosa en begudes refrescants s’obtenen amb una composició de 5% de GOD, 76% de polímer, 9.5% de grafit i 9.5% de TTF·TCNQ. El segon treball descriu el disseny, construcció i avaluació d’un analitzador miniaturitzat basat en la tecnologia de ceràmiques verdes (Low temperature co-fired ceramics, LTCC) per a la determinació de pesticides, que integra una etapa de pretractament mitjançant dos mescladors tridimensionals i un sistema de detecció amperomètrica per mesurar el producte de una reacció d’inhibició enzimàtica. El sistema de detecció s’integra de forma monolítica a la plataforma de fluídica, i consisteix en dos làmines de platí com a elèctrodes de treball i auxiliar, i d’un elèctrode de referència serigrafiat. El sistema és caracteritzat i avaluat satisfactòriament per la determinació de carbofuran a nivell nanomolar. Per últim, es descriu un mètode ultrasensible per determinar toxicitat deguda a pesticides en un lab-on-a-chip de vidre mitjançant la inhibició de l’enzim acetilcolinesterasa immobilitzat sobre partícules magnètiques. S’optimitzen la introducció de forma reproduïble d’una quantitat controlada de partícules modificades amb l’enzim al canal del xip i la seva captura en una zona determinada mitjançant l’ús d’un camp magnètic extern. Aquest procediment permet de forma fàcil i altament reproduïble la renovació del material biosensor després de cada determinació. S’avaluen o optimitzen el potencial de treball per a la detecció selectiva de tiocolina en un elèctrode platí, la reproductibilitat i sensibilitat en la detecció de tiocolina, el voltatge del flux electroosmòtic i el temps de la reacció d’inhibició. S’aconsegueix la determinació del pesticida carbofuran (un dels pesticides carbamats més tòxics) a nivell nanomolar. / Three integrated analytical biosystems have been developed within the scope of this thesis, showing: 1) the substantial improvement in the analytical performance of the proposed methodologies thanks to the Integration process; 2) how miniaturisation provides significant increases of the robustness, sensitivity and selectivity of the proposed systems; and 3) new solutions to the loss of activity of the biological element of biosensors and analytical biosystems. The first work describes how an amperometric glucose biosensor based on graphite and non-conducting epoxy resin biocomposite was constructed. Glucose oxidase (GOD) and the tetrathiafulvalene-tetracyanoquinodimethane (TTF•TCNQ) conducting organic salt were incorporated into the bulk of the composite to form a renewable biosensor. Several graphite-TTF•TCNQ ratios (w/w) were studied in order to select the best biosensor to be integrated in a FIA system for the automated detection of glucose. The optimal amount of GOD in the composite was studied as well. The selection was based on the analytical response of the electrodes. Best results were obtained by an electrode whose composition was 5% GOD, 76% polymer, 9.5% graphite and 9.5% TTF•TCNQ. An especially designed flow amperometric cell was constructed so that the biosensor could be integrated into a FIA system and glucose in beverage samples could be determined. In the second work the design, construction and evaluation of a miniaturized analyser for pesticides determination that integrates a pre-treatment stage, based on two three-dimensional mixers or reactors, and an amperometric detection system to measure the product of an enzymatic inhibition reaction are presented. The detection system was monolithically integrated in the microfluidic platform and it consisted of a screen-printed reference electrode and two platinum sheets, acting as auxiliary and working electrodes, which were embedded within the ceramic structure. The miniaturized system was characterized and successfully evaluated by determining carbofuran at nanomolar level. Finally, in the third work an ultrasensitive method to determine toxicity due to pesticides in a glass lab-on-a-chip by means of enzymatic inhibition of acetylcholinesterase immobilised on magnetic beads is described. The reproducible insertion of a controlled amount of enzyme-coupled magnetic beads inside the chip channel and their immobilisation in a capture region with the aid of a magnetic field has been optimised. This procedure enables the easy renewal of the biosensing material after each determination in a highly reproducible manner. Several operational parameters such as the working potential for the selective detection of thiocholine (TCh) on a platinum disc electrode, the TCh detection reproducibility and sensitivity, the electroosmotic flow driving voltage and the inhibition time were also evaluated or optimised. The detection of carbofuran (one of the most toxic carbamate pesticides) has been achieved down to the nanomolar level.

Este trabajo se centra principalmente en la mejora de las propiedades de los sensores y/o biosensores utilizando nanotubos de carbono y nanopartículas metálicas como plataformas de electrodo. Después de haber considerado varios ejemplos de la literatura, para alcanzar este objetivo se ha decidido integrar las nanopartículas metálicas en la superficie de los nanotubos de carbono para conseguir las ventajas de las propiedades de los dos materiales; por esta razón se han ensayado diversos procedimientos de síntesis de la literatura, y éstos han sido adaptados y optimizados. Esta primera etapa del trabajo tuvo como objetivo encontrar un protocolo sintético fácil y rápido para generar un material nano-híbrido y ha terminado con un protocolo de síntesis eficaz que calificaríamos “one-pot” ya que permite tener el material final deseado sin etapas de purificación intermedias. Por supuesto, el protocolo tiene que modificarse ligeramente dependiendo de las nanopartículas metálicas deseadas. Los materiales nano-híbridos obtenidos se han caracterizado, especialmente a través de microscopía electrónica de transmisión (TEM), pero también a veces con microscopía electrónica de barrido (SEM), después de cada síntesis para verificar si el protocolo estaba funcionando. El siguiente paso ha sido la prueba del material nano-híbrido, aplicándolo a la superficie de un electrodo de epoxy-grafito (mayormente utilizado en nuestro laboratorio) o un electrodo serigrafiado (SPE) para la detección de una biomolécula, tirosina. La prueba mostró resultados notables (Artículo 1), con una clara mejora de la capacidad de detección y la sensibilidad del material nano-híbrido contra el electrodo serigrafiado sin modificación o la modificación con sólo los nanotubos de carbono (sin nanopartículas metálicas). Después de este éxito se prepararon otros materiales nano-híbridos con diferentes nanopartículas metálicas; el objetivo era experimentar en un sistema multi electrodos utilizado en nuestro laboratorio, la lengua electrónica, que se utiliza para la resolución de mezclas de analitos. Un sistema de lengua electrónica no es sólo un conjunto de sensores (que se explicará mejor en la introducción de este trabajo), sino que también necesita una etapa de procesamiento de datos ya que los analitos que participan en el proceso suministran señales similares, por lo que se necesita una interpretación quimiométrica avanzada (en nuestro caso con redes neuronales artificiales). Con el objeto de recoger nuevas variantes, en este caso la utilización de biosensores enzimáticos, parte de este trabajo se ha llevado a cabo en la Universidad de Lund (Suecia), en colaboración con el grupo del Prof. Lo Gorton; de esta manera se ha podido aplicar la parte de procesamiento informático sin tener que preocuparse también de la optimización de los electrodos, ya que en ese grupo ya se habían optimizado los biosensores que podrían ser utilizados para nuestro propósito. Esta colaboración dio lugar a un resultado interesante (Artículo 3 - manuscrito) en los que hemos sido capaces de construir una proof-of-concept de una innovadora lengua bio-electrónica usando variaciones de una enzima específica (celobiosa deshidrogenasa - CDH) como elemento de detección que nunca se había construido antes. El último paso de este trabajo ha sido la integración de los materiales nano-híbridos sintetizados en los sensores para la lengua electrónica utilizada en nuestro laboratorio. Los objetivos de la lengua electrónica han sido los azúcares presentes en bagazo de caña utilizado para la producción de biocombustibles. Los resultados recogidos y la buena predicción del sistema de lengua electrónica han sido excelentes y han sido publicados recientemente (artículo 2), y enseñan una proof-ofconcept de un sistema de trabajo para la resolución de mezclas de azúcares. / This work is mainly focused on the improvement of the properties of sensors and/or biosensors using carbon nanotubes and metal nanoparticles as electrode platform. After having gone through a good amount of literature examples, to reach this goal it has been decided to embed the metal nanoparticles on the carbon nanotubes surface to be able to take advantage of both material properties; for this reason, various synthetic procedures from the literature has been tested, modifying and optimizing them. This first step of the work was aimed to find a facile and quick synthetic protocol to generate a nano-hybrid material and it ended with an effective one-pot synthetic protocol that allows having the final desired material without intermediate purification steps. Of course the protocol has to be slightly modified depending on the desired metal nanoparticles. The obtained nano-hybrid materials have been characterised, especially through transmission electron microscopy (TEM) but also some time with scanning electron microscopy (SEM), after every synthesis to verify if the protocol was working. The next step has been a test of the nano-hybrid material, applying it to the surface of an epoxy graphite electrode (largely used in our lab) or a screen-printed electrode (SPE) for the detection of a biomolecule, Tyrosine. This test showed remarkable results (Article 1) with a clear improvement of the detection ability and sensitivity of the nano-hybrid material against the bare screen-printed electrode or the modification with only carbon nanotubes (without metal nanoparticles). After this success few different nano-hybrid materials have been prepared with different metal nanoparticles with the objective to try them in an electrode array system commonly used in our lab, the electronic tongue system, used for the resolution of mixtures of analytes. An electronic tongue system is not just an array of sensors (this would be better explained in the Introduction of this work), but it also needs a step of data processing since the analytes involved in the process supply very similar results; for this, an advanced chemometric treatment is needed, (in our case using Artificial Neural Networks). With the aim of gathering new variants, in this case the use of enzymatic biosensors, part of this work has been carried out at the Lund University (Sweden) in collaboration with the group of Prof. Lo Gorton; in this way, the computer processing part could be applied without having to worry also of the electrode optimization, since in that group they already had optimized biosensors that could be used for our purpose. This collaboration resulted in an interesting outcome (Article 3 – manuscript) where we have been able to build as a proof-ofconcept a novel bio-electronic tongue with variation of a specific enzyme (cellobiose dehydrogenase – CDH), a sensing element never used before in this manner. The last step of this work has been the integration of the synthesised nano-hybrid materials in the sensors for the electronic tongue used in our lab. The targets of the electronic tongue have been the sugars present in sugarcane bagasse used for the production of bio-fuels. The results collected and the goodness of prediction of the electronic tongue system have been satisfactory and they have been recently published (Article 2), showing a proof-of-concept of a working system for sugar mixtures resolution.

Obtener una alta calidad en la industria farmacéutica es un reto constante que requiere un estricto control y supervisión de los productos manufacturados. La tecnología analítica de procesos (PAT, Process Analytical Technology) propone que esto puede lograrse de una manera óptima y sistematizada mediante el control de calidad en diferentes etapas de manufactura (materias primas, intermedios y producto acabado). La simplicidad y rapidez de la espectroscopía de infrarrojo cercano (NIRS, Near Infrared Spectroscopy) junto con el análisis quimiométrico de datos multivariables ha demostrado su eficacia para la determinación de propiedades físicas y composición química de productos farmacéuticos, y su uso en esta industria se ha incrementado considerablemente en los últimos años. El objetivo de esta Tesis es el desarrollo de métodos NIR para el control de calidad en la industria farmacéutica. Para ello, se propusieron y optimizaron nuevas estrategias de diseño y selección del conjunto de calibración y la mejora de las estrategias de modelado NIR, basado en conceptos como el conocimiento del producto y comprensión del proceso de acuerdo con la filosofía de trabajo PAT. La Tesis consiste en tres casos de estudio de diferentes formulaciones farmacéuticas sólidas. En el primer estudio se evalúan diferentes metodologías para la construcción del conjunto de calibración, y también se propone un nuevo modo de cálculo y adición del espectro. Se evaluó la idoneidad de dichas estrategias para la cuantificación de un principio activo (API, active pharmaceutical ingredient) presente a baja concentración (10 miligramos por gramo). Los principales resultados mostraron la eficacia de esta nueva metodología para el control de calidad de un granulado farmacéutico (producto acabado), y demostró una sobresaliente capacidad en términos de robustez y simplicidad experimental en comparación con otras estrategias evaluadas. El segundo estudio consiste en la optimización del proceso de selección de factores relevantes en la implementación de una metodología novedosa para la preparación del conjunto de calibración. Para ello se calcularon modelos para el control de calidad de una formulación en sus tres etapas de fabricación: polvo, núcleos y comprimidos recubiertos. De los resultados obtenidos en este estudio se confirmó la idoneidad del concepto de espacio del modelo definido por los estadísticos T2 Hotelling y residuales Q para la identificación de muestra anómalas (dentro/fuera del espacio), y para la selección objetiva de los factores a utilizar en la construcción conjunto de calibración. También se corroboró la eficacia del método NIR propuesto para el control de calidad en variadas etapas del proceso. El tercer caso de estudio aborda una problemática en la industria farmacéutica que concierne al análisis NIR de muestras sólidas con tendencia a la segregación de sus componentes. En este estudio se evalúa el área efectiva de escaneado espectral y la representatividad de la porción de muestra analizada. También se propone una alternativa eficaz de análisis por NIR para este tipo de muestras basada en la adquisición de espectros de muestras en movimiento. Los resultados obtenidos en este trabajo confirman la influencia del área escaneada con la representatividad de la muestra analizada y esto, a su vez, a la capacidad predictiva de los modelos de calibración. Este estudio resalta la importancia de la optimización del área de escaneado de superficie previo cálculo del modelo, ya que se confirmó como estos factores influyen en los estadísticos de predicción de los métodos NIR propuestos. Este trabajo presenta una alternativa eficaz para el control de calidad de muestras heterogéneas o con tendencia a segregación. Los métodos propuestos en cada uno de los casos de estudios fueron evaluados de acuerdo con las directrices internacionales y europeas, y representan una contribución a la iniciativa PAT y el desarrollo de metodologías NIR en base a su mejora mediante un mejor conocimiento del producto y una mayor comprensión del proceso. / Accomplish high quality in the pharmaceutical industry is a constant challenge that require strict control and supervision not only from final products but also from all manufacturing steps according to process analytic technologies (PAT) initiative. In recent years, the simplicity and expeditiousness of near infrared spectroscopy (NIRS) together with chemometrics data analysis have substantially fostered its use for the determination of pharmaceutical´s physical and chemical properties. The subject of this thesis is the development of NIR methodologies useful for the quality control for the pharmaceutical industry, proposing and optimizing mainly new strategies for the selection and design of the calibration set and improving NIR methodologies based on product knowledge and process understanding. The thesis consists in three cases of study where different solid pharmaceutical formulations were evaluated. In the first study a new methodology for constructing the calibration set is proposed and its suitability for quantifying an API present in low concentration (10 mg.g-1) was evaluated by comparison with two methodologies broadly known. The main results showed the efficiency and suitability of the calculation ad addition of process spectra methodology for the quality control of a pharmaceutical granulate (final product). This methodology showed an outstanding performance in terms of robustness and operational simplicity in comparison with the other evaluated strategies. The second study consists in the optimization of a novel methodology through the incorporation of statistical parameters for the selection of important factors used, and three calibration models were calculated for the quality control of a formulation in its three manufacturing steps: powder, cores and coated tablets. Based on the results obtained with this study the model space concept was established defined by Hotelling’s T2and Q-residuals statistics for outlier identification – inside/outside the defined space – in order to select objectively the factors to be used in the calibration set construction. Also the efficacy of the proposed methodology for stepwise pharmaceutical quality control was confirmed. This work represented a contribution for the field as a guideline for the implementation of this easy and fast methodology in the pharma industry. A third study case addresses a concern in the pharmaceutical industry regarding samples with tendency of segregation and its analysis by using NIR spectroscopy. In this study the effective scanned area and the sample representativeness is evaluated, and an effective alternative based on spectra acquisition on moving samples is proposed. The results obtained in this work confirmed the influence of the scanned area with the representativeness of the analyzed sample and this, in turn, the performance of the calculated calibration models. This study highlights the importance of the optimization of the surface scanned area since the quality of the methodologies to be developed depends strongly on this factor. This work presents an effective alternative for quality control on samples with tendency to segregate. The proposed methods were evaluated according to the European and international guidelines and represent a contribution to the PAT initiative and the development of NIR methodologies based on its improvement by a better product knowledge and process understanding.

Los (bio)materiales compuestos conductores ((bio)compósitos) han sido en los últimos años, una interesante alternativa en el desarrollo de (bio)sensores amperométricos debido especialmente, a su capacidad de integrar varios materiales de diferente naturaleza, y formar un nuevo material con propiedades físicas, mecánicas y eléctricas muy distintas a los materiales originales que lo constituyen. Los (bio)sensores desarrollados con estos materiales presentan diferentes ventajas analíticas respecto a los conductores puros, que les proporcionan un alto valor añadido como por ejemplo, versatilidad, durabilidad, facilidad de regeneración superficial y de integración, funcionalidad como reservorio de material biológico, etc. Las propiedades eléctricas de los (bio)compósitos y, por tanto, su aplicabilidad analítica, están drásticamente influenciadas por la naturaleza de las partículas conductoras que lo forman, así como, de la cantidad y distribución espacial de las mismas en la matriz del (bio)compósito. Una de las características electroquímicas más importantes que poseen estos materiales, es la similitud en su comportamiento electroquímico respecto a (bio)sensores desarrollados con haces de microelectrodos. La presencia de áreas conductoras separadas por áreas no conductoras en la superficie del electrodo, mimetiza la distribución más o menos ordenada de microelectrodos separados entre sí por un aislante eléctrico. Las características de respuesta de los haces de microelectrodos dependen fundamentalmente, de las dimensiones y separación entre sí de los microelectrodos. De manera, que una apropiada optimización de la separación de las partículas conductoras y de su distribución interna en los (bio)compósitos desarrollados permitiría mejorar la eficacia analítica de los (bio)sensores basados en (bio)compósitos. En el trabajo de investigación presentado en esta tesis, se han implementado un conjunto de técnicas instrumentales que, aplicadas de forma estratégica y sistemática, han permitido la caracterización y optimización de la composición de (bio)materiales compuestos basados en grafito y resina epoxy (Epotek H77), permitiendo el desarrollo de (bio)sensores amperométricos más eficaces. Se ha mejorado la estabilidad y reproducibilidad de la señal, y se ha disminuido los límites de detección de forma significativa aumentando la relación señal/ruido. En primer lugar, se ha caracterizado el material compuesto de partida en función de la composición de grafito-resina presente en el mismo. Se han utilizado diferentes técnicas de caracterización que permiten obtener información de las propiedades eléctricas, electroquímicas y morfológicas del material. Se han construido electrodos compósitos de diferentes composiciones y se han caracterizando usando las técnicas de espectroscopia electroquímica de impedancias, voltamperometría cíclica, microscopia de fuerza atómica con punta conductora, microscopia electrónica de barrido, microscopia láser confocal y amperometría hidrodinámica. La utilización de estas técnicas ha permitido estudiar, el efecto que la incorporación de un tercer elemento de carácter biológico, en el material compuesto, tiene sobre la distribución espacial de las partículas conductoras que forman el biocompósito. La eficacia de estas técnicas ha quedado demostrada en la optimización de la composición (16%-17%) de un biosensor de glucosa modelo, donde la eficacia de la respuesta analítica ha sido superior a los biosensores con un contenido de grafito estándar (20%). Los nuevos criterios de optimización, han sido aplicados a biosensores basados en (bio/inmuno)compósitos, que presentan un interés relevante en aplicaciones analíticas. La respuesta analítica de los nuevos biosensores optimizados, se ha comparado con biosensores basados en el mismo tipo de (bio/inmuno)compósito que contienen un 20% de grafito, y que pueden encontrarse en la bibliografía. Concretamente, se han estudiado un biosensor de acetilcolinesterasa, aplicado a la determinación de pesticidas por inhibición enzimática, y un inmunosensor de inmunoglobulina G aplicado a la determinación indirecta de un antígeno, mediante la detección del correspondiente anticuerpo marcado. En los dos casos, se han obtenido mejoras significativas en la respuesta analítica después de la optimización de la composición del (bio/inmuno)compósito. / The conducting (bio)composites have been in the last years an interesting alternative in the development of amperometric (bio)sensors due to their great capability of integrating different kind of materials and due to the creation of a new material with different physical, mechanical and electrical properties from the originals compounds. The developed (bio)sensors with these materials present different analytical advantages regarding to a pure conductive material, for example, versatility, durability, easy surface regeneration and integration, functionality as a biological material reservoir, etc. The electrical properties of the biocomposites and, therefore, their analytical applicability are directly influenced by the conducting particles nature and the amount and spatial distribution of them inside the biocomposite. One of the most important electrochemical properties of these materials is the similarity of their electrochemical behaviour regarding to a microelectrode array. The presence of conducting areas separated by non-conducting areas on the electrode surface simulates imitate more or less an orderly distribution of microelectrodes separated by an electric insulated. The response characteristics of a microelectrode array depend on the dimensions and the separation between the microelectrodes. So, an appropriate optimization of the distance between the conducting particles and their inner distribution of the developed (bio)sensors will allow improving the analytical efficiency of (bio)sensors based on (bio)composites. In the work presented in this thesis, it has been implemented a group of instrumental techniques that, systematically applied, have allowed the characterization and optimization of (bio)composite materials composition based on graphite and epoxy resin (Epotek H77) and the development of a more efficient amperometric (bio)sensors. This efficiency has become in an improvement of the stability and signal reproducibility and, specially, an increase of the signal-to-noise ratio which has allowed decreasing the detection limits. Firstly, it has been characterized the initial composite material as function of the graphite-resin composition present on it. It has been used different characterization techniques that allow obtaining information about the electric, electrochemical and morphological properties of the material. It has been constructed composite electrodes with different compositions and it has been characterized using electrochemical impedance spectroscopy, cyclic voltammetry, current sensing atomic force microscopy, scanning electronic microscopy, confocal microscopy and hydrodynamic amperometry techniques. The use of these techniques has allowed studying the effect of incorporating a third biological compound on the composite material has on the spatial distribution of the conducting particles of the composite. The efficiency of these techniques has been demonstrated in the composition optimization (16%-17%) of a glucose model biosensor, where the analytical response efficiency is higher compared to biosensors with the standard graphite proportion (20%). The new optimization criteria have been applied to composite electrodes based on alternative biological compounds, and the analytical response of the optimized compositions was compared to the one obtained from biosensors with the standard graphite proportions (20%), reported on the literature. Concretely, it has been studied a biosensor with acetylcholinesterase, applied to pesticide determination by means of enzymatic inhibition, and an immunosensor of immunoglobulin G applied to the indirect determination of an antigen by means of the detection of their corresponding labeled antibody. In both cases, it has been obtained an improvement of the analytical response after the composition optimization of (bio/immune)composite.

En els últims anys, a causa de la necessitat de diàgnostics ràpids i de millores en sensat, s’han utilitzat nous elements de reconeixement en biosensors. Un tipus d’aquests nous elements de reconeixement són els aptàmers. Els aptàmers són cadenes sintètiques de ADN o ARN les quals són seleccionades in vitro i tenen la capacitat d’unir-se a proteïnes, ions, cèl.lules, fàrmacs i lligands de baix pes molecular, reconeixent les seves molècules diana amb alta afinitat i especificitat. Diversos biosensors basats en aptàmers, també anomenats aptasensors, han sigut desenvolupats recentment. D’entre totes les tècniques de transducció utilitzades en biosensors, l’Espectrocòpia Electroquímica d’Impedància ha sigut àmpliament emprada como a eina per caracteritzar la superficies de sensors i estudiar esdeveniments en el biosensat en la superficie d’elèctrodes. La característica més important que presenta aquesta tècnica és que no requereix cap espècie marcada per a la transducció, per tant, aquesta tècnica de detecció pot utilitzar-se per dissenyar protocols de detecció directa sense marcatge, evitant assajos més cars i laboriosos. El principal objectiu d’aquesta tesi doctoral va ser el desenvolupament d’aptasensors utilitzant la tècnica electroquímica d’impedància esmentada anteriorment. Per a això, diferents tipus d’elèctrodes van ser utilitzats, tals com elèctrodes de compòsit grafit-epoxi, elèctrodes de biocompòsit grafit-epoxi modificats amb molècules d’avidina i elèctrodes comercials serigrafiats de nanotubs de carboni de paret múltiple. El treball es va dividir principalmente en dues parts d'acord amb la detecció de dues proteïnes diferents. La primera part es va focalitzar en la detecció de trombina. Primer de tot, es van comparar i avaluar diversos aptasensors de detecció directa sense marcatge basat en diferents tècniques d'immobilització dels aptàmers, tals com: adsorció física humida, afinitat avidina-biotina i enllaç covalent mitjançant activació electroquímica de la superfície de l'elèctrode i mitjançant inserció electroquímica. Posteriorment, els elèctrodes de biocompòsit van ser comparats com a plataformes en genosensat i aptasensat. Amb la finalitat d'amplificar el senyal impedimètric obtingut utilitzant elèctrodes de biocompòsit, un protocol sàndwich va ser emprat incloent nanopartícules d'or modificades amb estreptavidina i tractament amplificador de plata. La segona part de l'estudi es va basar en la detecció de citocrom c. Primerament, es va realitzar un simple aptasensor de detecció directa sense marcatge per a la detecció d'aquesta proteïna utilitzant la tècnica d'immobilització d'adsorció física humida. Finalment, i amb l'objectiu d'amplificar el señal impedimètric, es va desenvolupar un assaig tipus sándwich híbrid d’aptàmer i anticòs utilitzant elèctrodes serigrafiats de nanotubs de carboni de paret múltiple. D'aquesta manera, la tesi explora i compara una àmplia gamma de procediments d'immobilització, l'ús de detecció directa sense marcatge o nanomaterial modificat amb biomolècules en diferents protocols directes o d'amplificació, i l'ús de reconeixement directe i sándwich per amplificar la sensibilitat i/o la selectivitat de l'assaig. / In the recent years, due to the need for rapid diagnosis and improvements in sensing, new recognition elements are employed in biosensors. One kind of these new recognition elements are aptamers. Aptamers are synthetic strands of DNA or RNA which are selected in vitro and have the ability to bind to proteins, ions, whole cells, drugs and low molecular weight ligands recognizing their target with high affinity and specificity. Several aptamer-based biosensors, also called aptasensors, have been recently developed. Among all the transduction techniques employed in biosensors, Electrochemical Impedance Spectroscopy has widely used as a tool for characterizing sensor platforms and for studying biosensing events at the surface of the electrodes. The important feature presented by this technique is that it does not require any labelled species for the transduction; thus, this detection technique can be used for designing label-free protocols thus avoiding more expensive and time-consuming assays. The main aim of this PhD work was the development of aptasensors using the electrochemical impedance technique previously mentioned for protein detection. For that, different types of electrodes were used, such as Graphite Epoxy Composite electrodes (GECs), Avidin Graphite Epoxy Composite electrodes (AvGECs) and commercial Multi-Walled carbon nanotubes screen printed electrodes (MWCNT-SPE). The work was divided in two main parts according to the detection of the two different proteins. The first part was focused on thrombin detection. First of all, different impedimetric label-free aptasensors based on several aptamer immobilization techniques such as wet physical adsorption, avidin-biotin affinity and covalent bond via electrochemical activation of the electrode surface and via electrochemical grafting were developed and evaluated. Then, AvGECs electrodes were compared as a platform for genosensing and aptasensing. With the aim to amplying the obtained impedimetric signal using AvGECs, an aptamer sandwich protocol for thrombin detection was used including streptavidin gold-nanoparticles (Strep-AuNPs) and silver enhancement treatment. The second part of the study was based on cytochrome c detection. Firstly, a simple label-free aptasensor for the detection of this protein using a wet physical adsorption immobilization technique was performed. Finally, with the goal to amplify the impedimetric signal, a hybrid aptamer-antibody sandwich assay using MWCNT-SPE for the detection of the target protein was carried out. In this way, the thesis explores and compares a wide scope of immobilization procedures, the use of label-free or nanocomponent modified biomolecules in different direct or amplified protocols, and the use of direct recognition and sandwich alternatives to enhance sensitivity and/or selectivity of the assay