Foram desenhados três pares de primers, sendo um deles dirigido ao gene que codifica uma proteína periplasmática da Brucella (BP26) e dois outros dirigidos para a região interespaçadora entre os gene 16S e 23S do RNA ribossômico (ITS). Com os primers acima, foram padronizadas três PCRs, potencialmente capazes de detectar qualquer espécie de Brucella e denominadas PCR-ITS1, PCR-ITS2 e PCR-BP26. Soluções de DNA de sangue de cão livre de Brucella foram contaminadas com quantidades decrescentes de DNA de B. canis (RM6/66) e, então, submetidas às PCRs descritas anteriormente. Para a avaliação das PCRs quanto à capacidade de detecção de Brucella spp. em sangue de animais naturalmente infectados, foram utilizadas 75 amostras de sangue de cães provenientes de canis comerciais onde foram registrados casos clínicos sugestivos de infecção por Brucella. As 75 amostras de sangue de cães foram colhidas com anti-coagulante (citrato de sódio) por punção da veia jugular. As amostras foram separadas em duas alíquotas, uma das quais (2 ml) foi submetida ao isolamento e identificação bacteriológica e a outra alíquota (1ml), às PCRs. O DNA total das amostras de sangue foi extraído por método baseado em digestão com proteinase K, SDS e CTAB seguido de purificação com fenol e clorofórmio. Considerando os resultados da PCR de melhor desempenho (PCR-ITS1), entre as 35 amostras positivas pelo isolamento bacteriano, 30 (85,71%) foram positivas pela técnica de PCR, enquanto entre as 40 amostras negativas pelo cultivo bacteriológico, 11 (27,5%) foram positivas pela PCR. A PCR-ITS1 foi capaz de detectar um mínimo de 3,78fg de DNA bacteriano misturado a 450ng de DNA de cão, o que representa, teoricamente, a massa genômica de 1,26 bactérias. Pela aparente superior capacidade de classificar animais positivos que o método de cultura bacteriológica, a PCR-ITS1 parece ser uma técnica promissora para o diagnóstico direto da brucelose em cães. / Three pair of primers were designed against Brucella genetic sequences. Two of them were directed to 16S-23S rRNA interspacer and the other was directed to a periplasmatic protein coding gene (BP26). Three PCRs assays named PCR-ITS1, PCR-ITS2 and PCR-BP26, each one putatively capable of amplifying DNA from any Brucella species were tested using the aforementioned primers. Nucleic acid extracts from whole-blood from naïve dogs were spiked with decreasing amounts of B. canis (RM6/66) DNA and the resulting solutions were tested by PCR. The capability of the PCRs to amplify Brucella spp. genetic sequences from naturally infected dogs was evaluated by using 75 whole-blood samples from dogs raised in commercial kennels were clinically affected animals have already been detected with signs suggestive of Brucella infection. The whole-blood samples were collected with sodium citrate as anti-coagulant by venal puncturing the jugular vein. The samples were split into two aliquots, one of them (2mL) being submitted to bacterial isolation and identification and the remaining sample (1mL) to PCR. The DNA from whole-blood was extracted by using proteinaseK, SDS and CTAB following phenol-chloroform purification. Considering the results from the PCR with the best performance (PCR-ITS1), within 35 isolation positive samples, 30 were positive by PCR. Within 40 isolation negative samples, 11 were positive by PCR. PCR-ITS1 was capable of detecting as few as 3.78fg of bacterial DNA mixed to 450ng of host DNA. Theoretically, 3.78fg of Brucella DNA represents the total genomic mass of 1.26 bacterial cells. The superior ability of PCR-ITS1 on classifying positive animals suggest that PCR-ITS1 is a promising tool for the direct detection of canine brucellosis.

Com o objetivo de se conhecer a situação epidemiológica da brucelose bovina no Estado de Santa Catarina, o mesmo foi subdividido em cinco áreas epidemiológicas. Para o planejamento amostral foi utilizada a amostragem aleatória sistemática. Além do cálculo da prevalência da brucelose bovina, foi realizada a caracterização epidemiológica das propriedades em cada uma das cinco áreas e verificada a possibilidade de agrupamento de algumas delas de acordo com as semelhanças existentes. Para o estudo foram colhidas amostras de soro de 7756 animais e questionários epidemiológicos foram aplicados em 1579 propriedades. As prevalências de focos e de animais soropositivos para brucelose bovina no Estado de Santa Catarina foram 0,02% (0,00-0,15%) e 0,06% (0,01-0,40%), respectivamente. Nas áreas 1 e 2, a prevalência de focos foi de 0,00% (0,00-1,23%); na área 3 foi de 0,00% (0,00-0,93%), na área 4 foi de 0,34% (0,00-1,86%) e na área 5 foi de 0,00% (0,00-1,26%). Em relação à prevalência de animais soropositivos para brucelose bovina, com exceção da área 4, cuja prevalência foi de 0,89% (0,13-5,76%), as demais áreas tiveram prevalência de 0,00% (0,00-0,00%). A maioria das propriedades das cinco áreas possui criação extensiva e bovinos mestiços, utiliza ordenha manual e não utiliza inseminação artificial. Com exceção da área 5, cuja maioria é de exploração leiteira, as demais são predominantemente de exploração mista. A área 3, que possui a maior mediana de produção diária de leite (7,5 litros), é a única cuja maioria das propriedades fazem o resfriamento do leite. A área 1 é a que possui maior mediana do número de bovinos (16 bovinos por propriedade). De acordo com as análises realizadas, sugere-se que as áreas 3 e 4 sejam agrupadas. / For this study Santa Catarina has been divided in five epidemiological areas in order to know the epidemiological situation of bovine brucellosis in this state. Systematic random sampling was used for the sampling design. The prevalence of bovine brucellosis was determined as well as the epidemiological characterization of the farms in each of the five areas, and the possibility of grouping some of them according to existent similarity was tested. Serum samples of 7756 animals were collected and an epidemiological survey using questionnaires was carried out in 1579 farms. The prevalence of positive holdings and animals for bovine brucellosis in Santa Catarina state were 0,02% (0,00-0,15%) and 0,06% (0,01-0,40%), respectively. In areas 1 and 2, the prevalence of positive holdings was 0,00% (0,00-1,23%); in area 3 it was 0,00% (0,00-0,93%), in area 4 it was 0,34% (0,00-1,86%) and in area 5 it was 0,00% (0,00-1,26%). Regarding prevalence of serum-positive animals for bovine brucellosis, all areas had prevalence 0,00% (0,00-0,00%), except area 4, which had prevalence 0,89% (0,13-5,76%). Most of the farms of five areas raise the animals extensively, grow mixed-breed cattle, make use of manual milking and do not use artificial insemination. The great majority of the areas develop mixed exploration except area 5 in which most farms grow dairy cattle. Area 3, which has the highest median of dairy milk production (7,5 liters), is the only one where the cooling of the milk is practiced in most of the farms. Area 1 has the highest median of number of bovine (16 bovines per farm). According to the analysis developed, it is suggested that areas 3 and 4 be grouped

A técnica de PCR, utilizando-se \"primers\" desenhados a partir do gene que codifica uma proteína imunogênica de 31 KDa de Brucella abortus, foi empregada na detecção de Brucella spp. em 300 amostras de produtos lácteos clandestinos apreendidas em municípios dos Estados de São Paulo (SP) e de Minas Gerais (MG). Foram analisadas 49 amostras de queijo minas frescal e 18 de queijo meia-cura provenientes de MG, e 92 amostras de queijo minas frescal, 33 amostras de queijo meia-cura e 108 amostras de leite cru provenientes de SP. O isolamento bacteriano foi tomado como referência, porém não se isolou Brucella spp. de nenhuma das amostras cujos cultivos mostraram-se contaminados com outros gêneros bacterianos. Pela PCR foi observado que 37 amostras de queijo foram positivas: 29/141 (20,56 %) das amostras de queijo minas frescal e 8/51 (15,68%) das amostras de queijo meia-cura. Todas as amostras positivas na PCR para Brucella spp. foram confirmadas como sendo da espécie Brucella abortus pela técnica de PCR utilizando-se \"primers\" espécie-específicos. Foi instituída a reação de hemi-nested PCR para a diferenciação da cepa em B19 ou campo tomando-se como base a deleção genética de 702 pb existente na cepa vacinal B19. A padronização da técnica permitiu que todas as cepas de Brucella spp. fossem diferenciadas, revelando que 30 (81,08%) amostras eram B19 e 7 (18,92%) eram cepas de Brucella abortus de campo. A concordância estimada entre as técnicas de PCR e do cultivo microbiológico através do indicador Kappa foi considerada baixa (K = 0) devido ao não isolamento do microrganismo. / A PCR assay using primers designed based on the gene that encodes a 31 KDa immunogenic protein from Brucella abortus was used in the detection of Brucella spp. in 300 samples of illegal dairy products obtained in cities of the states of São Paulo (SP) and Minas Gerais (MG), Brazil. A total of 49 samples of minas frescal cheese and 18 samples of meia-cura cheese from MG were analyzed, besides 92 samples of minas frescal cheese, 33 samples of meia-cura cheese and 108 samples of raw milk from SP. Although bacterial isolation was used as reference, Brucella spp. was not isolated from any samples in which culture was contaminated by other genera of bacteria. PCR showed that 37 samples were positive for Brucella spp.: 29/141 (20,56 %) of the minas frescal cheese samples and 8/51 (15,68%) of the meia-cura cheese samples. All positive samples for Brucella spp. were confirmed as Brucella abortus by PCR using species-specific primers. Hemi-nested PCR was used for the differentiation between B19 and field strains, based on the genetic deletion of 702 pb in the vaccinal strain. Standardization of the technique enabled the differentiation of all Brucella spp. strains, showing that 30 of them (81,08%) were B19 and 7 (18,92%) of them were Brucella abortus field strains. Estimated agreement between PCR and microbiological culture as determined by Kappa indicator was considered to be poor (K = 0) due to the absence of isolation of the microorganism.

A técnica de PCR, utilizando-se \"primers\" desenhados a partir do gene que codifica uma proteína imunogênica de 31 KDa de Brucella abortus, foi empregada na detecção de Brucella spp. em 300 amostras de produtos lácteos clandestinos apreendidas em municípios dos Estados de São Paulo (SP) e de Minas Gerais (MG). Foram analisadas 49 amostras de queijo minas frescal e 18 de queijo meia-cura provenientes de MG, e 92 amostras de queijo minas frescal, 33 amostras de queijo meia-cura e 108 amostras de leite cru provenientes de SP. O isolamento bacteriano foi tomado como referência, porém não se isolou Brucella spp. de nenhuma das amostras cujos cultivos mostraram-se contaminados com outros gêneros bacterianos. Pela PCR foi observado que 37 amostras de queijo foram positivas: 29/141 (20,56 %) das amostras de queijo minas frescal e 8/51 (15,68%) das amostras de queijo meia-cura. Todas as amostras positivas na PCR para Brucella spp. foram confirmadas como sendo da espécie Brucella abortus pela técnica de PCR utilizando-se \"primers\" espécie-específicos. Foi instituída a reação de hemi-nested PCR para a diferenciação da cepa em B19 ou campo tomando-se como base a deleção genética de 702 pb existente na cepa vacinal B19. A padronização da técnica permitiu que todas as cepas de Brucella spp. fossem diferenciadas, revelando que 30 (81,08%) amostras eram B19 e 7 (18,92%) eram cepas de Brucella abortus de campo. A concordância estimada entre as técnicas de PCR e do cultivo microbiológico através do indicador Kappa foi considerada baixa (K = 0) devido ao não isolamento do microrganismo. / A PCR assay using primers designed based on the gene that encodes a 31 KDa immunogenic protein from Brucella abortus was used in the detection of Brucella spp. in 300 samples of illegal dairy products obtained in cities of the states of São Paulo (SP) and Minas Gerais (MG), Brazil. A total of 49 samples of minas frescal cheese and 18 samples of meia-cura cheese from MG were analyzed, besides 92 samples of minas frescal cheese, 33 samples of meia-cura cheese and 108 samples of raw milk from SP. Although bacterial isolation was used as reference, Brucella spp. was not isolated from any samples in which culture was contaminated by other genera of bacteria. PCR showed that 37 samples were positive for Brucella spp.: 29/141 (20,56 %) of the minas frescal cheese samples and 8/51 (15,68%) of the meia-cura cheese samples. All positive samples for Brucella spp. were confirmed as Brucella abortus by PCR using species-specific primers. Hemi-nested PCR was used for the differentiation between B19 and field strains, based on the genetic deletion of 702 pb in the vaccinal strain. Standardization of the technique enabled the differentiation of all Brucella spp. strains, showing that 30 of them (81,08%) were B19 and 7 (18,92%) of them were Brucella abortus field strains. Estimated agreement between PCR and microbiological culture as determined by Kappa indicator was considered to be poor (K = 0) due to the absence of isolation of the microorganism.