A antracnose, doença causada por fungos do gênero Colletotrichum, é uma das doenças mais importantes em muitas plantas cultivadas. Nas cucurbitáceas, como pepino, chuchu, melão e melancia, a antracnose é muito freqüente e causa prejuízos bastante elevados. O agente causal é o Colletotrichum lagenarium, que apresenta como sinonímias C. orbiculare e C. gloeosporioides f. sp. cucurbitae. O presente trabalho visa caracterizar cultural, morfológica e patogenicamente, e identificar molecularmente, os isolados de C. lagenarium, obtidos de plantas da família Cucurbitaceae. Os isolados foram obtidos através de isolamento de tecidos de plantas que apresentavam sintomas de antracnose. A caracterização cultural envolveu a avaliação do crescimento micelial, esporulação, coloração da colônia, topografia da colônia, formação de setores, presença e coloração de massa conidial. A caracterização morfológica compreendeu a avaliação das formas e dimensões dos conídios e apressórios. A caracterização patogênica envolveu a avaliação da virulência de todos os isolados em inoculações cruzadas com pepino, melão, melancia, abóbora e chuchu, além da avaliação do período de incubação, do período latente e do índice de crescimento da lesão. A identificação molecular compreendeu a análise de PCR, utilizando “primer” específico para C. lagenarium, para auxílio na identificação da espécie. Quanto à caracterização cultural, os isolados apresentaram uma variabilidade muito grande quanto à cor e topografia da colônia e formação de setores, contudo, quando analisada a coloração de massa micelial, nos isolados em que esta se fez presente, a coloração não apresentou grandes variações. Apesar da grande variação encontrada nos índices de crescimento micelial diário entre os isolados, não existiu grande variação para cada isolado quando se alterou o meio de cultivo. A esporulação não apresentou correlação com o crescimento micelial, e não constituiu um bom parâmetro para caracterização, devido à variação que apresentou tanto entre os isolados, quanto entre os meios de cultivo. Os conídios apresentaram formatos cilíndrico, clavado e levemente curvo, com dimensões variando de 2,25 a 6,38µm de largura e 5,34 a 15,73µm de comprimento. Os apressórios apresentaram os formatos globoso, clavado e lobado, com dimensões variando de 5,54 a 8,68µm de largura e 6,71 a 10,75µm de comprimento. Dos 25 isolados testados nas inoculações cruzadas, apenas 14 se apresentaram virulentos aos hospedeiros testados. Não foi encontrada correspondência entre a virulência do isolado e o hospedeiro, o local de coleta, suas características culturais ou morfológicas. Cada isolado apresentou um comportamento diferente perante os demais, quando se considerou a gama de hospedeiros a ele suscetíveis, e ao seu comportamento quanto aos períodos latente e de incubação, e ao índice de crescimento de lesão. O período de incubação variou de dois a sete dias, e período latente variou de três a nove dias. O índice de crescimento de lesão variou de 0,5 a 4,9mm/dia. Não foi observada correlação entre o período latente, o período de incubação e o índice de crescimento de lesão. Através da identificação molecular, cinco isolados puderam ser identificados pelo “primer” específico utilizado, contudo não foi encontrada correspondência entre a identificação molecular e as caracterizações cultural, morfológica e patogênica. / Anthracnose is one of the most important diseases of cucurbitaceous plants, causing severe damages to cucumber, chayote, melon, watermelon and pumpkin. The causal agent is Colletotrichum lagenarium (syn. C. orbiculare, C. gloeosporioides f. sp. cucurbitae). The objective of this work was to determine cultural, morphological and pathogenic characterization, and molecular identification of C. lagenarium, isolated from plants of the Cucurbitaceae family. The isolates used in this study were obtained through isolation from plants presenting symptoms of Anthracnose. The cultural characterization involved the evaluation of mycelial growth, sporulation, colony colour, colony topography, sectors formation, presence and colour of conidial mass. The shape and size of the conidia and apressoria were assessed to the morphological characterization. The pathogenic characterization involved the evaluation of the virulence of all isolates on cross inoculations with cucumber, melon, watermelon, pumpkin and chayote, evaluation of the incubation period, the latent period and the lesion growth. For the molecular identification PCR analysis was used, with specific “primer” for C. lagenarium, to assist the identification of the species. Colonies of all isolates presented great variability in color, topography, and sectors formation; however the color of the mycelial mass did not present great variations. Despite the great variation found in the daily micelial growth indices among the isolates, great variation for each one did not exist when the culture medium was changed. The sporulation did not present correlation with the micelial growth, showing a high variation among the isolates and the culture media. This later parameter was not useful for characterization. The conidia of the isolates were classified in the shapes cylindrical, clavate and slightly curved, with average dimensions varying from 2.25 to 6.38µm in width, and from 5.34 to 15.73µm in length. The apressoria had the shapes globose, clavate and lobed, with average dimensions varying from 5.54 to 8.68µm in width, and 6.71 to 10,75µm in length. From the 25 isolates tested in the cross inoculations, only 14 were virulent to the tested host plants. Correspondence was not found between the virulence of the isolates and de host plants origin, the local origin, and the cultural and morphological characteristics. Analyzing the variability of susceptible host plants, the inoculation and latent periods, and the lesion growth, each isolate showed a different behavior compared to the others. The incubation period varied from two to seven days, and the latent period varied from three to nine days. The lesion growth varied from 0,5 to 4,9mm/day. It was not observed correlation between the latent and incubation periods, as well as in lesion growth. Five isolates were identified to the pair of primers used, although correspondence was not found among the molecular identification and the cultural, morphological and pathogenic characterization.

A antracnose é uma das principais doenças que afetam a goiaba no Estado de São Paulo. Tanto Colletotrichum gloeosporioides quanto Colletotrichum acutatum, são relatados como sendo os agentes causais da doença. Os objetivos do trabalho foram caracterizar e identificar 54 isolados de Colletotrichum oriundos de lesões de goiaba, baseados nos aspectos culturais, morfológicos, moleculares e enzimáticos, além da caracterização patogênica de isolados representativos de cada espécie de Colletotrichum identificadas. A caracterização cultural foi avaliada mediante a mensuração do crescimento micelial dos isolados a 25 ºC, além dos aspectos culturais, como a coloração e a topografia das colônias. Na caracterização morfológica foram mensurados comprimento e largura de conídios, bem como avaliados os seus formatos. Oligonucleotídeos específicos foram utilizados na caracterização molecular, visando identificar as espécies dos isolados de Colletotrichum. A caracterização enzimática envolveu a mensuração, in vitro, do halo de degradação dos substratos da amilase, proteinase, celulase, pectinase e lipase. Por fim, alguns isolados representativos e identificados foram utilizados na caracterização patogênica, sendo avaliados os períodos de latência e incubação, a área lesionadas dos frutos e a esporulação. Baseados na coloração das colônias, os isolados foram reunidos em 9 grupos diferentes. Os mesmos puderam se reunidos em dois grupos distintos de acordo com a taxa do crescimento micelial. Os conídios apresentaram os formatos: (i) reto, fusiforme, com ápices afilados, (ii) reto, oblongo, com ápices arredondados, (iii) reto, clavado, afilado em uma extremidade e (iv) reto, com constrição. As dimensões variaram de 11,4 a 16,8 µm de comprimento por 2,6 a 4,9 µm de largura. O uso de oligonucleotídeos específicos permitiu identificar C. acutatum e C. gloeosporioides entre os isolados avaliados. Grande parte dos isolados, 94%, foram identificados como pertencendo à espécie C. gloeosporioides, enquanto que apenas 4% foram identificados como C. acutatum. Em relação à caracterização enzimática, apenas a atividade celulolítica proporcionou diferenças significativas entre C. gloeosporioides e C. acutatum. A patogenicidade dos isolados avaliados mostrou alta variabilidade na severidade da doença nos frutos, contudo não foi possível evidenciar diferenças significativas que distinguissem C. acutatum de C. gloeosporioides. Os períodos de incubação e latência foram menores para os isolados de C. acutatum em relação aos isolados de C. gloeosporioides. C. acutatum produziu quantidade superior de esporos nos frutos inoculados quando comparados a C. gloeosporioides. Observou-se, ainda, correlação positiva entre a área do halo de degradação de pectina, lipídio e amido e a área lesionada dos frutos afetados pelos isolados avaliados. / Anthracnose is one of the major diseases affecting guava in the State of São Paulo. Both Colletotrichum gloeosporioides and Colletotrichum acutatum are reported as the causal agents of the disease. The objectives of this work were to characterize and to identify 54 Colletotrichum isolates from guava, based on cultural, morphological, molecular, enzymatic, and pathogenic aspects. Cultural characterization was achieved by measuring the mycelial growth at 25 ° C, as well as reporting cultural aspects, such as color and topography of the colonies. In the morphological characterization it was measured length and width of conidia, and rated their shapes. CaInt2 and CgInt specific primers were used in the molecular identification of the Colletotrichum isolates. The enzymatic characterization was performed by measuring, in vitro degradation of starch, protein, cellulose, pectin and lipid. Finally some representative and identified isolates were used in the pathogenic characterization, evaluated by latency and incubation periods, diseased area and sporulation. Based on the color of the colonies, the isolates were grouped in 9 different groups. These same isolates showed two distinct growth paterns according to the mycelial growth rates. Conidia showed shapes: (i) straight, fusiform, with acute ends, (ii) straight, oblong, with round ends, (iii) straight, clavate, tapered at one end and (iv) straight, with a constriction in the middle. Conidia size ranged from 11.4 to 16.8 µm in length by 2.6 to 4.9 µm in width. The use of specific primers identified C. acutatum and C. gloeosporioides among the isolates. Most of the isolates (94%) were identified as C. gloeosporioides, while only (6%) were identified as C. acutatum. In the enzymatic characterization, only cellulolytic activity revealed significant differences between C. gloeosporioides and C. acutatum. Pathogenicity of the isolates was highly variable, but could not help to distinguish between C. acutatum and C. gloeosporioides. The incubation and latency periods were shorter for C. acutatum in relation to C. gloeosporioides. C. acutatum produced higher amounts of spores on inoculated fruits compared to C. gloeosporioides. There was also a positive correlation between in vitro degradation of pectin, lipid and starch, and the diseased area for tested isolates.

Fungos do gênero Colletotrichum são considerados um dos principais fitopatógenos do mundo, comprometendo diversas culturas e causando danos econômicos e sociais para diversos países, inclusive o Brasil. Apesar de medidas de controle já serem empregadas, estas nem sempre são eficazes, motivo pelo qual se faz necessária a busca por novas opções de controle que possam atuar no manejo integrado. Dentre estas, encontram-se os metabólitos secundários produzidos por fungos endofíticos, os quais estão envolvidos na produção de compostos de interesse biotecnológico, com aplicações em diversas áreas, inclusive a agronômica. Neste contexto, o presente trabalho de doutorado teve por objetivo explorar o potencial biológico e químico de metabólitos secundários produzidos por fungos endofíticos isolados de guaranazeiros da Amazônia, avaliando sua atividade antifúngica \"in vitro\" a Colletotrichum gloeosporioides, isolado da cultura do guaranazeiro, a C. acutatum e C. gloeosporioides, isolados da cultura do pimentão. Para tanto, 16 linhagens de fungos endofíticos foram avaliadas em ensaio biológico por cultivo pareado e pelo método de difusão em disco contra Colletotrichum spp. Observou-se que quatro linhagens se mostraram mais promissoras, as quais foram selecionadas para o estudo de bioprospecção. A partir do extrato bruto do endófito Aspergillus flavus (272) foi isolado o composto ativo asperfuran, que apresentou atividade inibitória aos três fitopatógenos, com CI50 < 100 &mu;g disco-1, semelhante ao fungicida comercial difenoconazol. A partir do extrato bruto de Xylaria sp. (214) foi isolado o composto ativo citocalasina D, que apresentou atividade inibitória a C. gloeosporioides isolado do guaranazeiro, com CI50 > 500 &mu;g disco-1. A partir do extrato bruto de Xylaria sp. (249) foi isolado o composto ativo ácido pilifórmico, que apresentou atividade inibitória a C. gloeosporioides isolado do guaranazeiro, com CI50 de 500 &mu;g disco-1 e à C. acutatum isolado o pimentão, com CI50 de 300 &mu;g disco-1. E, a partir do extrato bruto de Talaromyces aculeatus (507) foram isolados três compostos, da classe dos ésteres ftalicos, sendo um ativo. A fração antecessora destes três compostos apresentou atividade inibitória a C. gloeosporioides isolado do guaranazeiro, com CI50 > 500 &mu;g disco-1. A partir do extrato bruto de T. aculeatus também foi isolado um composto ativo parcialmente identificado e um composto ativo semi-purificado. A fração antecessora destes dois compostos apresentou atividade inibitória aos dois C. gloeosporioides, com CI50 > 300 &mu;g disco-1 e a C. acutatum, com CI50 em torno de 150 &mu;g disco-1. A atividade antifúngica destes compostos a fungos do gênero Colletotrichum está sendo relatada pela primeira vez neste estudo. / Colletotrichum fungi are considered one of the main pathogens in the world, affecting different cultures and causing social and economic damage to several countries, including Brazil. Despite control measures already being employed, these are not always effective, which is why the search for new control options that can act in the integrated management is necessary. Among these, the secondary metabolites produced by endophytes are involved in the production of compounds of biotechnological interest, with applications in several areas, including the agronomic. In this context, this study aimed to explore the biological and chemical potential of secondary metabolites produced by endophytic fungi isolated from the Amazonian guarana, evaluating their antifungal activity \"in vitro\" to Colletotrichum gloeosporioides, isolated from the culture of guarana and C. acutatum and C. gloeosporioides, isolated from the red pepper crop. For this purpose, 16 strains of endophytic fungi were evaluated in biological assay of dual culture and disk diffusion method against Colletotrichum spp. Four strains of these strains presented promising results which were selected for bioprospecting. From the crude extract of the endophyte Aspergillus flavus (272) was isolated the active compound asperfuran, which showed inhibitory activity to three pathogens, with IC50 <100 &mu;g disk-1, similar to the commercial fungicide difenoconazole. From the crude extract of Xylaria sp. (214) was isolated the active compound cytochalasin D, which showed inhibitory activity against C. gloeosporioides isolated from guarana (IC50> 500 &mu;g disk-1). From the crude extract of Xylaria sp. (249) was isolated the active compound piliformic acid, which showed inhibitory activity against C. gloeosporioides isolated from guarana (IC50 of 500 &mu;g disk-1) and C. acutatum isolated from red pepper (IC50 of 300 &mu;g disk-1). And from the crude extract of Talaromyces aculeatus (507) were isolated three compounds, of phthalate esters class, one of them with activity. The predecessor fraction of these three compounds showed inhibitory activity against C. gloeosporioides isolated from guarana (IC50> 500 &mu;g disk-1). From the crude extract of T. aculeatus it was also isolated a partially identified active compound and a semi-purified active compound. The predecessor fraction of these two compounds showed inhibitory activity to both C. gloeosporioides (IC50> 300 &mu;g disk-1) and to C. acutatum (IC50 around 150 &mu;g disk-1). The antifungal activity of the compounds isolated in this study is being reported for the first time against fungus of the genus Colletotrichum.

Duas espécies de Colletotrichum podem causar antracnose em goiabas: C. gloeosporioides e C. acutatum. Apesar de ser a principal doença pós-colheita da cultura, a influência de variáveis ambientais no seu desenvolvimento é desconhecida. O objetivo do presente trabalho foi determinar a influência das variáveis ambientais no desenvolvimento in vitro e nos processos de infecção e colonização dos fungos Colletotrichum gloeosporioides e C. acutatum em goiabas. A germinação e a formação de apressórios foram determinadas sob temperaturas de 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40 ºC, com períodos de molhamento de 6, 12 e 24 horas, sob escuro contínuo. Nos experimentos in vivo, goiabas \"Kumagai\" e \"Pedro Sato\" foram inoculadas, por ferimento, com suspensão de conídios das duas espécies e incubadas em câmaras de crescimento a 15, 20, 25 e 30 ºC e períodos de molhamento de 6 e 24 horas. Avaliou-se a incidência de frutos doentes, o diâmetro das lesões, a taxa de progresso da doença e os períodos de incubação e latência. Nas goiabas \"Kumagai\" também foi avaliada a influência dos estádios de maturação dos frutos no progresso da doença. Não houve germinação a 40 ºC em nenhuma das duas espécies. A faixa favorável à germinação e à formação de apressórios in vitro foi de 15 a 30 ºC para C. gloeosporioides, com máximo a 25 ºC e de 20 a 25 ºC para C. acutatum, com máximo a 20 ºC. Para C. acutatum, a germinação foi mais sensível a variações no período de molhamento, sendo significativamente menor com 6 horas em relação a 12 e 24 horas. Nos experimentos in vivo, temperaturas de 25 e 30 ºC e 24 horas de molhamento foram mais favoráveis para as variáveis analisadas em goiaba \"Kumagai\". Os diâmetros máximos de lesão foram de 4,0 cm para C. gloeosporioides e 4,1 cm para C. acutatum, em frutos em ponto de colheita, incubados sob temperatura de 25 ºC. A maior incidência da doença (100%) ocorreu 10 dias após a inoculação, a 30ºC e 24 horas de molhamento. O menor período de incubação foi de 7 dias para as duas espécies, observado a 30 ºC e o menor período de latência foi de 10 e 9 dias para C. gloeosporioides e C. acutatum, respectivamente, sob temperaturas de 25 ou 30 ºC. Em goiabas \"Pedro Sato\", as temperaturas entre 20 e 30 ºC e 24 horas de molhamento foram mais favoráveis. Os diâmetros máximos de lesão foram de 3,3 cm para C. gloeosporioides e 3,2 cm para C. acutatum sob temperatura de 25 ºC. A maior incidência da doença (100%) ocorreu 10 dias após a inoculação, a 25 e 30ºC sob 6 horas de molhamento. O período de incubação foi de 7 dias para as duas espécies entre 20 e 30 ºC e o período de latência foi de 8 dias para C. gloeosporioides e 9 dias para C. acutatum sob temperaturas de 25 e 30 ºC. As condições requeridas para as duas espécies fúngicas foram semelhantes, embora o intervalo de favorabilidade seja mais amplo na goiaba \"Pedro Sato\". / The main causal agents of Anthracnose in guava are Colletotrichum gloeosporioides and C. acutatum. Although anthracnose is the main postharvest disease affecting guava, little is known about the influence of environmental variables on its development. Consequently, the objective of the present study was to determine the influence of environmental factors on in vitro development and on colonization and infection processes of C. gloeosporioides and C. acutatum fungi in guava. The germination and apressorium formation were determined at temperatures of 10, 15, 20, 25, 30, 35 and 40 °C, with wetness durations of 6, 12 or 24 hours under continuous darkness. The in vivo experiments involved puncturing the skin of the Kumagai and Pedro Sato varieties of guava with a needle followed by inoculation with conidial suspensions of C. gloeosporioides and C. acutatum. Fruits were then incubated in growth chambers at temperatures of 15, 20, 25 and 30 °C with wetness duration of 6 and 24 hours. Assessments were made of the following: incidence of disease, lesion diameter, rate of disease progress, as well as incubation and latency periods. In the Kumagai variety, the influence of maturity on disease progression was also evaluated. There was no germination at 40 oC in any of the species. The germination and apressorium formation rate were rather high in the range of 15 to 30 ºC for C. gloeosporioides, with a maximum at 25 ºC and of 20 to 25 ºC for C. acutatum, with a maximum at 20 ºC. For the species C. acutatum, germination rate was more sensitive to variations in wetting periods, thus significantly smaller with 6 hours on 12 and 24 hours. Temperatures of 25 and 30 °C were found to be more favorable for the variables analyzed in the in vivo experiments of Kumagai variety. The maximum lesion diameter recorded in this variety was 4.0 cm for C. gloeosporioides and 4.1 cm for C. acutatum in harvest ready fruit that had been incubated at temperatures lower than 25 °C. The highest incidence of the disease (100%) occurred 10 days after inoculation, at 30 º C and 24 hours of wetting. The lowest incubation period for both species was 7 days at 30 °C and the lowest latency period of 9 days for C. gloeosporioides and 10 days for C. acutatum at temperatures between 25 and 30 °C. For the Pedro Sato variety, temperatures between 20 and 30 °C with a 24 hour wetness period were found to be the most favorable conditions. The maximum lesion diameter was 3.3 cm for C. gloeosporioides and 3.2 cm for C. acutatum at temperatures below 25 °C. The highest incidence of the disease (100%) occurred 10 days after inoculation, at 25 and 30 º C and 6 hours of wetting. The lowest incubation period for both species was 7 days at temperatures between 20 and 30 °C and the lowest latency period of 8 days for C. gloeosporioides and 9 days for C. acutatum at temperatures between 25 and 30 °C. In conclusion, development conditions for Colletotrichum gloeosporioides and Colletotrichum acutatum were similar, although the range of conditions favorable for the Pedro Sato variety was wider than that of the Kumagai cultivar.

O guaraná, Paullinia cupana var. sorbilis, espécie nativa do Brasil é uma cultura de relevância para o país, principalmente nos estados da Bahia e Amazonas. O fruto contém substâncias estimulantes, como a cafeína, que conferem ao guaraná um grande potencial exploratório, visto que esta é uma das substâncias estimulantes mais consumidas no mundo. Apesar de sua importância, a cultura do guaraná é pouco estudada, portanto pouco se sabe sobre sua genética e as interações microbianas existentes, tanto em relação aos microrganismos endofíticos e epifíticos, quanto em relação aos patógenos. De tal forma que a cultura do guaraná na região Amazônica vem sendo afetada por condições fitossanitárias desfavoráveis, como a presença do fungo do gênero Colletotrichum, causador da antracnose, doença considerada uma ameaça à produção comercial do guaraná. Assim, visando compreender a dinâmica envolvida na interação planta - microrganismos e o possível controle da antracnose, o presente trabalho acessou a comunidade bacteriana associada às folhas com e sem sintomas de antracnose, de forma independente e dependente de cultivo; bem como, investigou o potencial biotecnológico e de biocontrole dos isolados bacterianos. A comunidade bacteriana acessada de forma dependente e independente de cultivo apresentaram similaridades, como maior valor de riqueza e menor diversidade bacteriana em folhas assintomáticas, quando comparadas com folhas sintomáticas, e com relação ao filo Proteobacteria, mais abundantemente acessado nas duas comunidades. Comparações realizadas com isolados bacterianos acessados epi e endofiticamente de folhas com e sem sintoma da antracnose apontaram que o aparecimento da doença antracnose na folha pareceu ser o fator que mais influenciou na estrutura da comunidade bacteriana. Com relação às diferenças entre tecidos sintomáticos e assintomáticos, foi possível identificar alguns gêneros abundantes mais frequentemente acessados em plantas sintomáticas, sendo que os gêneros Pseudomonas, Stenotrophomonas e Pantoea foram acessados em grande frequência tanto de forma dependente como independente de cultivo. Porém, de forma independente de cultivo foram acessados outros táxons abundantes que diferiram significativamente entre as plantas, sendo que folhas sintomáticas apresentaram Acinetobacter, Acidobacter_GP1 e Sphingobacteria, e em folhas assintomáticas foram acessados os táxons Methylobacterium, Beijerinckia, Bacilli e um grupo de Rhizobiales não classificados. Além disto, os microrganismos endofíticos e epifíticos cultivados foram testados com o fitopatógeno Colletotrichum sp. em ensaios de antagonismos, sendo que isolados do gênero Bacillus, Stenotrophomonas, Pantoea, Erwinia, Entereobacter, Pseudomonas, entre outros, apresentaram inibição do crescimento do fungo fitopatogênico. As bactérias cultivadas ainda foram testadas quanto ao potencial biotecnológico de produção de enzimas hidrolíticas e sideróforo. Muitos isolados apresentaram produção de protease e sideróforo. Foi possível também correlacionar a produção das enzimas amilase, lipase e poligalacturanase com os isolados provenientes de tecidos sintomáticos. / Guarana, Paullinia cupana var. sorbilis, is a native culture of Brazil that has relevance to the country, mainly in the states of Bahia and Amazonas. The fruit contains stimulants substances, such as caffeine, that gives a high exploration potential to the culture, since this is one of the most consumed stimulant substance in the world. Despite its importance, the culture of guarana hasnt gotten much of attention, and little is known about its genetics and microbial interactions with both epiphytic and endophytic microorganisms, and in relation to pathogens. So, the guarana culture in the Amazon region has been affected by bad phytosanitary conditions, such as the presence of the fungi Colletotrichum, which causes anthracnose disease thats considered a threat to guarana commercial production. Thus, to understand the dynamics involved in the interaction plant-microorganism and the possible control of anthracnose, this study accessed the bacterial community associated to leaves with and without anthracnose symptoms, combining culture-dependent and -independent methodologies and also investigated the biotechnology potential and biocontrol of culture-dependent bacteria. The bacterial community accessed by culture-dependent and -independent manner presented similarities, both presented higher bacterial richness but lower bacterial diversity in asymptomatic leaves when compared with symptomatic leaves, and both communities presented the Proteobacteria phylum as the most abundant one. Comparisons between the endophytic and epiphytic bacterial isolates associated with leaves with and without anthracnose symptoms showed that the onset of anthracnose disease on leaf seemed to be the most important factor that modified the bacterial community structure. Regarding the differences between symptomatic and asymptomatic tissue it was possible to identify some genera most frequently accessed in symptomatic plants such as Pseudomonas, Stenotrophomonas and Pantoea accessed in both culture-dependent and independent methodologies. However, the cultureindependent approach of bacterial accessed others abundants taxa that differed significantly between plants. Symptomatic leaves showed Acinetobacter, Acidobacter_GP1 and Sphingobacteria and asymptomatic leaves presented taxa Methylobacterium, Beijerinckia, group Bacilli and a group of unclassified Rhizobiales. In addition, endophytic and epiphytic isolates microorganisms were tested with the pathogen Colletotrichum sp. in antagonism assays, and isolates from the genus Bacillus, Stenotrophomonas, Pantoea, Erwinia, Entereobacter, Pseudomonas, and others, showed inhibition of growth of the fungus. The bacterial isolates were also tested for production of hydrolytic enzymes and siderophore. Many isolates showed protease and siderophore production. It was possible to correlate the production of amylase, lipase and poligalacturanase with isolates from symptomatic tissue.

A incidência de Colletotrichum graminicola (Ces.) Wils como agente causal da antracnose do colmo aumentou significativamente nos últimos anos no Brasil devido ao incremento da área cultivada de milho aliado a mudanças nas práticas culturais. Os objetivos do presente trabalho foram determinar a herança da resistência à antracnose do colmo, identificar locos de resistência quantitativa (QRL) por meio de marcadores moleculares e estimar os danos potenciais na produção de grãos. A análise de média de gerações foi usada para determinar o modo de herança da resistência em duas famílias derivadas do cruzamento entre duas linhagens resistentes (Das21 e Das64) com uma suscetível (Das86). As inoculações foram realizadas no estádio de florescimento pleno com uma suspensão de 1,8 x 105 conídios/mL. O comprimento de lesão foi medido após abertura dos colmos. Os resultados indicaram modos de herança distintos entre as famílias. Em Das86 x Das21, houve predomínio de efeitos genéticos de dominância e interações epistáticas. Por outro lado, em Das86 x Das64, houve predomínio de efeitos aditivos. As estimativas de heterose diferiram entre as famílias, o que pode ser atribuídos à constituição genética dos genitores. O mapeamento de QRLs foi realizado com base na análise de 118 progênies F2:3, provenientes do cruzamento Das86 x Das21, avaliadas em três ensaios. As avaliações consistiram da medida do comprimento de lesão trinta dias após a inoculação. As análises de ligação entre marcadores e QRLs foram efetuadas por meio da regressão linear múltipla. A proporção da variação fenotípica em resistência devida a associação de QRLs com marcadores para os três ensaios e análise conjunta, variou de 44% a 63%. Nove marcadores foram identificados associados a QRLs no primeiro ensaio, 9 no segundo, 7 no terceiro e 13 analisando-se conjuntamente os experimentos. De maneira geral, foram identificados sete marcadores ligados a alelos de resistência nestes QRLs a C. graminicola, com coeficientes de regressão variando de 2,1% até 14,7%. Para estimar os danos na produção dois ensaios foram instalados em esquema fatorial 2 x 5. Os tratamentos consistiram da combinação de híbridos, suscetível e resistente, e três épocas de inoculação (20, 40, 60 DAE) além de duas testemunhas. Diferenças significativas na produção e peso de espiga ocorreram apenas para o híbrido suscetível quando inoculado aos 20 DAE. Neste caso, as reduções em produção foram de 16,1 e 20,2% para cada ensaio. Não foram verificadas diferenças significativas em comprimento de lesão em ambos os híbridos em função da data de inoculação. Conclui-se, portanto, que as perdas advindas da infecção no início do plantio não são devidas a maior severidade de ataque do patógeno. Este é o primeiro relato de mapeamento de vários QRLs a C. graminicola e de estimativas de danos deste patógeno em milho tropical. / The incidence of Colletotrichum graminicola (Ces.) Wils as the causal agent of stalk rot has increased significantly in recent years in Brazil due to an increase in the area cultivated with maize, in addition to implemented changes in cultural practices. The objectives of this work were to determine the mode of inheritance of resistance to stalk anthracnose, identify quantitative resistance loci (QRL) by means of molecular markers, and estimate potential grain yield reduction. Generation means analysis was used for two families derived from a cross between two resistant (Das21 and Das64) and one susceptible (Das86) line. Inoculations were performed at the flowering stage with a suspension containing 1.8 × 105 conidia/mL. Lesion length was measured after opening the stalks. The results indicated distinct inheritance modes between families. In Das86 × Das21, dominance genetic effects and epistatic interactions were predominant. On the other hand, in Das86 × Das64 there was a predominance of additive effects. Heterosis estimates differed between families, which could be attributed to the genetic background of the inbred parents. QRL mapping was performed based on the analysis of 118 F2:3 progenies from the Das86 × Das21 cross, evaluated in three trials. Evaluations consisted in measuring lesion lengths thirty days after inoculation. The linkage analysis between markers and QRLs were made by means of multiple linear regressions. The proportion of the phenotypic variation in resistance due to an association of QRLs with markers for the three trials and in the joint analysis ranged from 44% to 63%. Nine markers associated with QRLs were identified in the first trial, 9 in the second, 7 in the third, and 13 when the experiments were analyzed jointly. In general, seven markers linked to resistance alleles were identified in these QRLs, with coefficients of regression ranging from 2.1% to 14.7%. Two trials were installed to estimate yield reduction, in a 2 × 5 factorial design. Treatments consisted of a combination of hybrids, susceptible and resistant, and three inoculation times (20, 40, 60 DAE), in addition to two controls. Significant differences in yield and ear weight occurred only for the susceptible hybrid when inoculated at 20 DAE. In this case, yield reductions were 16.1 and 20.2% for each trial compared to the non-inoculated control. No significant differences were observed for lesion length in any of the two hybrids as a function of inoculation date. It can therefore be concluded that losses caused by infection at the beginning of planting are not due to a greater severity of attack by the pathogen. This is the first report on the mapping of several QRLs to C. graminicola and on yield estimates for this pathogen in tropical maize.

2 p. / Alfalfa varieties differ in fall dormancy, defined as growth during the fall. Nondormant alfalfa varieties are usually planted in mild winter areas for their ability to grow in the fall. However, fall growth of nondormant alfalfa may be undesirable in areas subject to repeated frosts or freezes. Nondormant, very nondormant, and extremely nondormant alfalfa varieties (fall dormancy class 8, 9, and 10) are adapted to elevations below 4000 feet in Arizona. Other dormancy classes not included in this publication are moderately nondormant varieties (fall dormancy class 7) which may be grown from 3000 to 5000 feet, and semi-dormant and dormant varieties (fall dormancy 6 and below) which are adapted to colder winter areas above 4000 feet.

Industry demand for local sources of grain for animal feed has increased sorghum production in the mid-Atlantic region of the U.S. Sorghum anthracnose (causal agent Colletotrichum sublineola) and the grain mold complex, which includes mycotoxin-producing Fusarium spp., limit the yield and quality of grain sorghum in humid climates worldwide. A majority of U.S. grain sorghum production is in arid regions, and management strategies have not been developed for the mid-Atlantic U.S. where warm, wet conditions favor disease. The specific objectives of this research were to: (1) determine the effectiveness of fungicides and their application timing for the management of sorghum foliar anthracnose, (2) compare five grain sorghum hybrids for their susceptibility to foliar anthracnose, grain mold and mycotoxin contamination under field conditions, (3) integrate host resistance and fungicide application to manage anthracnose and grain mold, and (4) identify Fusarium spp. associated with grain mold and mycotoxin contamination of sorghum in the mid-Atlantic U.S. For Objective 1, it was determined that a single application of pyraclostrobin-containing fungicide no later than flowering reduced anthrancose, protected yield and maximized farm income. Objective 2 focused on sorghum hybrid selection as a disease management tactic, and it was determined that hybrids with high yield potential and moderate disease resistance should be selected for mid-Atlantic sorghum production in order to maximize grain yield and quality while minimizing the need for fungicide inputs. Objective 3 focused on integrated management and demonstrated that under moderate disease pressure, a high-yielding susceptible hybrid required a single application of pyraclostrobin-based fungicide to minimize fungal diseases and maintain acceptable yields, whereas under high disease pressure it was necessary to integrate hybrid resistance and judicous applications of fungicides. The aim of Objective 4 was to characterize potential causal agents of mycotoxin contamination in mid-Atlantic sorghum, and thirteen phylogenetically distinct Fusarium species (F. lacertarum, F. graminearum. F. armeniacum, F. proliferatum, F. fujikuroi, F. verticillioides, F. thapsinum and several in Fusarium incarnatum-equiseti species complex) were found to be associated with grain mold and fumonisin and/or deoxynivalenol contamination of sorghum grain. This work has provided insights into the impacts of fungal diseases on grain sorghum yield and quality in the mid-Atlantic and has aided in development of best management practices for the region. / Doctor of Philosophy / Sorghum is grown in tropics, sub-tropics and semi-arid region worldwide for food, feed, forage and fuel. Sorghum acreage in the mid-Atlantic is increasing due the demand for locally grown grain by poultry and swine industries. During the growing season, warm and humid conditions are common in the southeastern and mid-Atlantic states favoring fungal diseases development that reduce the grain yield and quality. Anthracnose and grain mold, which includes toxic mycotoxin-producing Fusarium species, are the two major constraints in sorghum production in the region. However, management alternatives have not been developed. The main goal of this research was to develop management strategies to protect yield and maximize farm profitability by controlling anthracnose and grain mold of sorghum using chemicals and/or host resistance. The specific objectives were to: (1) determine the effectiveness of fungicides and their application timing for the management of sorghum foliar anthracnose, (2) compare grain sorghum hybrids for their susceptibility to foliar anthracnose, grain mold and mycotoxin contamination under field conditions, (3) assess the value of integrating host resistance and judicious use of fungicides to manage sorghum anthracnose and grain mold, and (4) identify Fusarium spp. associated with grain mold and mycotoxin contamination of sorghum in the mid-Atlantic U.S. Results from this research indicate that a single application of pyraclostrobin-containing fungicides no later than flowering reduces anthrancose, protects yield, and increases farm income. Sorghum hybrids varied in susceptibility to anthrancnose and grain mold, and planting a moderately resistant hybrid and applying a fungicide under high disease risk conditions provided the greatest return on investment. Both fumonisin and deoxynivalenol were frequently detected from sorghum grain, and mycotoxin contamination was associated with 13 different Fusarium species from three distinct species complexes. Based on the results of this work, best management practices for minimizing sorghum disease losses were developed for the mid-Atlantic region.

Le haricot commun est la légumineuse à graine la plus consommée au monde en alimentation humaine. Le génome du haricot possède plusieurs énormes clusters de gènes de résistance (R) qui ont la particularité de se cartographier en extrémité de groupes de liaison. Le génome du haricot commun (génotype Andin G19833) a été récemment séquencé et nous avons participé à ce projet en annotant la famille des NB-LRR (NL), classe prépondérante des gènes de résistance. Ces données génomiques nous ont permis de réaliser les 3 études suivantes. (i) L’identification des bases moléculaires de Co-x un gène R vis-à-vis d’une souche très virulente de C. lindemuthianum chez JaloEEP558 a été initiée. La cartographie fine de Co-x suivie du séquençage de la région cible chez JaloEEP558 (Co-x) a permis d’identifier un gène candidat codant une kinase atypique qui pourrait être la cible d’un effecteur fongique, gardée par un gène R. (ii) Des études récentes ont mis en évidence l’implication de petits ARNs (miRNAs induisant la production de phased siRNAs) dans la régulation de l’expression des NL. Le séquençage et l’analyse de banques de sRNAs de haricot nous ont permis d’identifier ce mécanisme et de mettre le doigt sur un nouveau mécanisme de régulation des NL impliquant des sRNAs de 24 nt. (iii) Des ADN satellites ont été étudiés à l’échelle du génome du haricot. L’étude des centromères de haricot a permis de mettre en évidence l’existence de 2 ADN satellites différents, Nazca et CentPv2. Nous avons également étudié un ADN satellite subtélomérique khipu précédemment identifié au niveau de 2 clusters de gènes R du haricot. L’étude de khipu à l’échelle du génome suggère l’existence d’échanges fréquents de séquences entre subtélomères de chromosomes non homologues. Ces résultats nous ont amenés à proposer que des éléments structuraux et une combinaison de mécanismes de régulation (TGS et PTGS) permettent la prolifération des NL sans effet néfaste pour la plante, conduisant à l’obtention de très gros clusters de NL dans le génome du haricot. / Common bean is the main source of protein for human consumption in many developing countries. Several huge disease resistance (R) gene clusters have been mapped at the end of common bean linkage groups. The common bean genome (Andean genotype G19833) has recently been sequenced. Access to the complete genome sequence of common bean allowed us to annotate the Nucleotide Binding-Leucine Rich Repeat (NL) encoding gene family, the prevalent class of disease R genes in plants, and to perform the 3 following studies: (i) We have investigated the molecular basis of Co-x, an anthracnose R gene to a highly virulent strain of C. lindemuthianum, previously identified in the Andean cultivar JaloEEP558. Fine mapping of Co-x and sequencing of the target region in JaloEEP558, allowed us to identify a candidate gene encoding an atypical kinase. We hypothesised that this atypical kinase is a fungal effector target. (ii) Several recent studies have highlighted the role of small RNA (miRNAs that triggered phased siRNAs production) in the regulating of NL gene expression. Analyses of small RNAs libraries of common bean led to the identification of this mechanism in common bean and also allowed us to propose a new NL regulation pathway involving 24 nt sRNAs. (iii) We have studied centromeric and subtelomeric satellite DNAs at common bean genome level. We have identified 2 different satellite DNAs in common bean centromeres, Nazca and CentPv2. We have also conducted the analyze of the subtelomeric satellite khipu, previously identified in common bean R clusters and confirmed that frequent sequence exchange occurs between non-homologous chromosome ends in common bean genome. Together, these results led us to propose that both structural elements and a combination of regulatory mechanisms (TGS, PTGS) allow the amplification of NL sequences without detrimental effect for the plant leading to the large NL clusters observed in common bean.

As espécies patogênicas do gênero Colletotrichum apresentam importância mundial, pois causam danos a várias culturas de interesse agronômico. Diversas medidas de controle são empregadas, mas estas nem sempre são eficazes devido à ocorrência de linhagens resistentes. Desta forma, se faz necessário a busca por novos compostos que possam ser utilizados no manejo integrado desta doença. Os produtos naturais isolados de micro-organismos podem ser uma alternativa para o desenvolvimento de novos defensivos agrícolas. Dentre os micro-organismos, as actinobactérias são conhecidas pela produção de inúmeros compostos antimicrobianos. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo o isolamento e a identificação de compostos antifúngicos produzidos por actinobactérias da rizosfera de guaranazeiros. Para isto, a seleção de actinobactérias foi baseada em dois ensaios. No primeiro, as 65 actinobactérias foram avaliadas em ensaio de cultivo pareado frente ao fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides. Destas, os isolados mais promissores foram AM1 (43,78 % de inibição do crescimento micelial), AM3 (43,98 %), AM18 (37,86 %), AM25 (43,17 %), AM30 (47,12 %), AM61 (40,12 %) e AM68 (47,94 %). No segundo ensaio, estes isolados foram cultivados em meio BD e, após o cultivo, o meio metabólico foi submetido a três métodos de extração: (a) partição líquido-líquido com n-butanol; (b) partição líquido-líquido com acetato de etila e (c) coluna sílica gel C18. As frações obtidas a partir das três metodologias foram avaliadas pelo método de difusão em disco de papel contra C. gloeosporioides. Neste ensaio de difusão em disco foram selecionadas as linhagens AM1(n-butanol), AM3 (acetato de etila) e AM25 (C18) para o estudo de bioprospecção. Estas foram identificadas por técnicas moleculares como pertencentes ao gênero Streptomyces. A partir do extrato bruto da Streptomyces sp. AM1 foi isolado um composto análogo do ácido proclavamínico, o qual apresentou atividade mínima inibitória (MIC) de 1,25 mg mL-1 contra o fitopatógeno C. gloeosporioides. Da linhagem Streptomyces sp. AM3 foi isolado o composto streptimidona que apresentou MIC de 1,25 mg mL-1. Já no estudo de Streptomyces sp. AM25 um composto não identificado apresentou MIC de 2,50 mg mL-1. Estes três compostos apresentaram atividade superior aos fungicidas Captan SC&reg; (Captana) e Dithane NT&reg; (Mancozeb), e inferior ao Score&reg; (Difenoconazol). A atividade antifúngica destes compostos ao C. gloeosporioides está sendo relatada pela primeira vez. / The pathogenic species of the genus Colletotrichum present importance worldwide because they cause damage to numerous crops of agronomic interest. Several control methods are employed, but they are not always effective due to the occurrence of resistant strains. Thus, it is necessary searching for new compounds that can be used in the integrated management of this disease. Natural products isolated from microorganisms can be an alternative for the development of new agricultural pesticides. Among microorganisms, actinobacteria are known to produce numerous antimicrobial compounds. In this context, the present study aimed to isolate and identify antifungal compounds produced by actinobacteria from guarana rhizosphere. For this, the selection of actinobacteria was based on two tests. In the first one, the 65 actinobacteria were evaluated in paired cultivation test against the plant pathogen Colletotrichum gloeosporioides. Among them, the most promising isolates were AM1 (43.78% inhibition), AM3 (43.98%), AM18 (37.86%), AM25 (43.17%), AM30 (47.12%), AM61 (40.12%) and AM68 (47.94%). In the second assay, these isolates were cultured in BD medium and, after culturing, the metabolic medium was subjected to three extraction methods: (a) liquid-liquid partition with n-butanol; (B) liquid-liquid partition with ethyl acetate and (c) silica gel column C18. The fractions obtained from the three methodologies were evaluated by paper disc diffusion method against C. gloeosporioides. In this disk diffusion assay, the strains AM1 (n-butanol), AM3 (ethyl acetate) and AM25 (C18) were selected for the bioprospecting study. These were identified by molecular techniques as belonging to the genus Streptomyces. From the crude extract of Streptomyces sp. AM1 the analogous compound proclavaminic acid was isolated, which presented minimal inhibitory activity (MIC) of 1.25 mg mL -1 against the plant pathogen C. gloeosporioides. From Streptomyces sp. AM3, the compound streptimidone was isolated, which presented MIC of 1.25 mg mL-1. In the study of Streptomyces sp. AM25 an unidentified compound had MIC of 2.50 mg mL-1. These three compounds presented superior activity to the fungicides Captan SC&reg; (Captan) and Dithane NT&reg; (Mancozeb), and inferior to the Score&reg; (Difenoconazole). The antifungal activity of these compounds to C. gloeosporioides is being reported here for the first time.