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Développement d' outils innovants pour le diagnostic et la découverte de cibles dans le cancer du seinEven, Klervi 25 May 2012 (has links)
Au cours de sa vie, 1 femme sur 9 sera atteinte du cancer du sein, 1 sur 27 sera emportée par cette maladie et 10 à 15 % des patientes développeront des métastases dans les trois années suivant le diagnostic. Le diagnostic précis et personnalisé du cancer du sein ainsi que l'évaluation de son potentiel métastatique est donc un enjeu majeur. Une analyse plus précise des caractéristiques moléculaires d'une tumeur primaire devrait conduire à une médecine personnalisée, un traitement et un suivi plus efficace. La détection de biomarqueurs sériques serait un moyen de diagnostiquer un cancer métastatique. Dans le but de découvrir de nouveaux marqueurs, l'analyse protéomique d'échantillons de patient a un fort potentiel mais souffre de limitations techniques, incluant le manque d'anticorps stables reconnaissant des marqueurs tumoraux d'intérêt. Par l'utilisation de fragments d'anticorps aux propriétés remarquables nommé single domain antibody (sdAb), et grâce à la mise au point d'une stratégie innovante de phages display, ce travail apporte d'importantes réponses en termes de disponibilité d'anticorps, d'analyse spécifique d'échantillon et de découverte de nouvelles cibles. Nous avons élaboré une stratégie permettant la découverte de biomarqueurs et l'isolement des anticorps correspondants. Après la construction de banques de sdAb à partir de lamas immunisés par des biopsies, une nouvelles stratégie de sélection in vitro par phage display, la sélection masquée, nous a permis d'isoler des anticorps spécifiques du cancer du sein. / In a lifetime, 1 in 9 women will develop breast cancer, 1 of 27 will be swept away by the disease and from 10 to 15% of patients will develop metastases within three years of diagnosis. Accurate and personalized diagnosis of breast cancer and the detection of its metastatic potential is a major challenge. It is essential to develop new analytical methods allowing an effective monitoring of breast cancer. A closer analysis of the molecular characteristics of a primary tumor should lead to more effective personalized medicine, treatment and monitoring. The efficient detection of serum biomarkers would be a way to diagnose metastatic cancer and to modify treatment based on these results. Toward this goal, the proteomic analysis of patient samples has great potential but suffers from technical limitations, including the lack of a wide variety of antibodies and tumor marker. By the use of innovative antibody fragments with remarkable properties named single domain antibody (sdAb), and through the development of a new innovative strategy of phage display, this work provides important answers in terms of availability of antibody, specific proteomic analysis of sample and new target discovery. We have developed a strategy allowing the simultaneous discovery of new biomarkers and the isolation of corresponding antibodies. After the construction of sdAb libraries from llamas immunized with biopsies, and using a new in vitro selection strategy by phage display named masked selection, we have isolated breast cancer-specific antibodies.
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Développement de bionansondes en biofonctionnalisant des boîtes quantiques (quantum dots) par des anticorpsRousserie, Gilles 30 November 2012 (has links)
Ce travail porte sur différentes méthodes de détection de protéines par des anticorps (Acs) marqués par des boîtes quantiques (QD, « quantum dots »). La première partie de la thèse porte sur le développement et l'optimisation de méthodes de conjugaison d'Acs polyclonaux à des QDs. Une étude de 2007 avait démontré que les conjugués anticorps-quantum dots (Acs-QDs) commerciaux ne présentent que de très rares anticorps fonctionnels à leur surface [Pathak et al., 2007]. Nous avons donc : (i) développé des conditions de réduction ménagée des ponts disulfures des Acs en utilisant soit du dithiothreitol, soit du 2-mercapotethanolamine, (ii) purifié les fragments d'Acs fonctionnels grâce à une colonne d'affinité, (iii) conjugué ces fragments fonctionnels d'Acs aux QDs en utilisant l'agent de liaison amine-thiol SMCC et (iv) développé une méthode de purification des conjugués sur gel d'agarose afin d'éliminer les fragments d'Acs non conjugués et les QDs libres. Des tests en cytométrie en flux ont permis de déterminer l'efficacité des conjugués pour détecter l'expression de la molécule CD4 à la surface de lymphocytes T humains. Un marquage de CD4 réalisé avec des conjugués préparés selon notre méthode s'avère être cinq fois plus sensible qu'en utilisant des conjugués réalisés selon les recommandations commerciales. Une autre méthode de préparation des Acs pour la conjugaison aux QDs a été testée : l'ajout de groupements fonctionnels sulfhydriles sur des amines primaires grâce au N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA). Cependant, cette méthode ne permet pas d'avoir un contrôle précis du nombre ni de l'emplacement des groupements fonctionnels sulfhydriles ainsi ajoutés. Les tests de conjugaison aux QDs qui ont été réalisés avec ces Acs-SH, en utilisant l'agent de liaison SMCC, a entraîné la formation d'agrégats de taille variable. Cette méthode a donc été abandonnée.La seconde partie de la thèse porte sur la démonstration de la faisabilité et l'optimisation d'un marquage de l'antigène carcino-embryonnaire (CEA, « carcinoembryonic antigen ») humain à la surface de lignées cellulaires murines avec un anticorps simple domaine (sdAb) anti-CEA biotinylé détecté grâce à des conjugués streptavidine-QDs commerciaux et analysé par cytométrie en flux. Ces sdAbs ont été biotinylés selon deux approches : (i) avec des agents de biotinylation chimique qui permettent d'ajouter une biotine sur les amines primaires (biotinylation in vitro) et (ii) par une enzyme lors de leur production par E. coli (biotinylation in vivo). La détection du CEA humain à la surface des 100 000 cellules (lignées cellulaires murine MC38 et MC38-CEA) par ces sdAbs biotinylés a été testée en cytométrie de flux puis comparée à celle obtenue par un anticorps monoclonal biotinylé in vitro. Les résultats ont démontré que les sdAbs biotinylés ont une sensibilité de détection similaire que la biotinylation soit réalisée in vitro ou in vivo. Par contre, la sensibilité de la détection du CEA est environ cinquante fois meilleure en utilisant des sdAbs biotinylés (0,6 fmol d'anticorps sont nécessaires pour détecter le CEA) qu'avec des anticorps monoclonaux biotinylés (33 fmol). / We have been working on different ways to detect proteins with antibodies (Abs) labeled by quantum dots (QDs). The first part of his work is to develop and optimize the conjugation of polyclonal antibodies to quantum dot. A study has reported that commercial antibody-quantum dots conjugates (Abs-QDs) present very few functional Ab fragments at the surface of the conjugate [Pathak et al., 2007]. We had: (i) developed an advanced procedure of antibody reduction using dithiothreitol (DTT) or 2-mercaptoethanolamine (2-MEA) (to prevent the loss of antibody functions), (ii) purified the active fragments by affinity purification on column, (iii) conjugated the active reduced antibody fragments to QDs using the amine-thiol crosslinker SMCC for SH coupling, and (iv) developed the purification of the conjugates on agarose gel to remove free QDs and unconjugated antibody fragments. Our conjugates present about a five times better ability to detect CD4 by flow cytometry on 500 000 isolated human lymphocyte T cells than those made after the commercial procedure. Another procedure for antibody preparation was addition of sulfhydryl groups on primary amines using N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA). However this procedure presents some variable yield and the number and the localization of sulfhydryl groups added on antibody cannot be fully controlled. Thereby, the conjugation of these Abs-SH to QDs using SMCC chemistry leads to the creation of aggregates. This Ab preparation in preparation for conjugation to QDs was abandoned.The second part of our work focusses on testing and comparing the ability to detect carcinoembryonic antigen (CEA) by flow cytometry with anti-CEA single domain antibodies (sdAbs) labeled by QDs. The sdAbs were biotinylated by using two methods: (i) in vitro chemical biotinylation reagent which adds biotins on primary amines, and (ii) enzymatic in vivo biotinylation during their production in E. coli. These anti-CEA sdAb biotinylation methods were compared to in vitro biotinylated monoclonal Abs against CEA for their respective ability to detect human CEA on 100 000 mice cells (MC38 and MC38-CEA cell lines) using flow cytometry. The results show that the limit detection for biotinylated sdAbs is similar between in vitro and in vivo biotinylation. Furthermore the limit detection with biotinylated sdAb (0.6 fmol are required to detect CEA) is about fifty times better than with biotinylated monoclonal Abs (33 fmol).
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Développement et utilisation de nanobodies dirigés contre le Grapevine fanleaf virus (GFLV) en lutte antivirale et comme biocapteur in planta / Development and use of nanobodies against Grapevine fanleaf virus (GFLV) for antiviral resistance and live-cell imagingHemmer, Caroline 16 September 2015 (has links)
Par leur stabilité, leur petite taille et leur nature monomérique, les domaines variables des immunoglobulines à chaînes lourdes, ou Nanobodies (Nb), sont incontournables en diagnostic et recherche médicale. Pourtant, leur utilisation en agro-biotechnologies demeure confidentielle.Dans l'idée de les utiliser pour étudier et combattre le Grapevine fanleaf virus (GFLV), responsable de la maladie du court-noué très préjudiciable à l'économie viticole mondiale, j'ai produit une collection de Nb spécifiques du GFLV.Fusionné à une protéine fluorescente et exprimé en plante de façon stable, un de ces Nb (alors appelé Chromobody, Cb) a conféré une haute résistance au GFLV inoculé mécaniquement ou transmis par nématodes.Le potentiel du Cb comme biocapteur a été validé par le suivi in vivo d’un isolat contournant la résistance mais toujours reconnu par le Cb. La structure du complexe Nb/GFLV a été résolue à 2,8 Å et révèle la zone occupée par le Nb à la surface de la capside.Ces résultats ouvrent des perspectives innovantes pour la compréhension du cycle infectieux d'un phytovirus et l'élaboration de nouvelles stratégies de lutte antivirale. / Due to their small size, high stability and strict monomeric nature, Nanobodies (Nbs) deriving from camelids heavy chain only antibodies have proven very valuable as diagnostic and therapeutic tools. However their use in agro biotechnology remains limited.In order to apply Nbs to the study and the control of grapevine fanleaf degeneration, I produced acollection of Nbs against Grapevine fanleaf virus (GFLV), the causal agent of this devastating disease worldwide.When fused to a fluorescent protein and stably expressed in plants, one of these Nbs (calledChromobody, Cb) conferred high resistance to GFLV, whether inoculated mechanically or by vector-mediated transmission.The identification of an isolate overcoming the resistance but still bound by the Cb allowed real-time tracking of the infection showing the high potential of Cbs as biosensors.The cryoEM structure of the Nb/GFLV complex was obtained at 2,8 Å and provides a clear picture of the footprint of the Nb on the surface of the GFLV capsid.These results pave the way for the innovative use of Nbs to unravel viral life cycle and to counter viral diseases.
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