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Bioprospecção de uma substância antifúngica potencialmente nova produzida por actinomicetos isolados no RS / Bioprospection of a potentially new antifungal substance produced by actinomycetes isolated on RSSpadari, Cristina de Castro January 2013 (has links)
Os fungos dermatófitos e as leveduras do gênero Candida são alguns dos microrganismos responsáveis por micoses em humanos. O tratamento dessas doenças acaba se tornando difícil pelo baixo número de antifúngicos existentes no mercado e pelo surgimento de resistência destes às drogas utilizadas. Já as actinobactérias são conhecidas por produzirem uma grande variedade de metabólitos secundários. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica dos metabólitos secundários produzidos por isolados de actinomicetos contra fungos dermatófitos e espécies de Candida sp. de origem clínica. Para a seleção dos isolados de actinomicetos com o melhor potencial de inibição foi realizado o ensaio de dupla camada em meio ágar amido caseína (ACA). Os isolados que mostraram atividade foram submetidos aos ensaios para a otimização da produção do composto ativo em sistema de cultura submersa. Para isso, foram avaliados diferentes meios de cultura, diferentes temperaturas e diferentes faixas de pH. A atividade antifúngica foi avaliada a cada 24h durante oito dias e observada através do ensaio de difusão em poço, onde foi calculado o índice de antibiose (IA). Nenhum dos isolados de fungos dermatófitos foi inibido no ensaio de dupla camada e os isolados 1S, R18(6) e 6(2) demonstraram atividade frente todas as espécies de Candida testadas. O isolado R18(6) mostrou melhor atividade em cultura líquida, sendo que as melhores condições de cultivo para a produção do antifúngico foi meio AC sem controle de pH, temperatura de 30°C e crescimento por 72h. Foram realizados ensaios como a concentração inibitória mínima, teste de termoestabilidade e avaliação do efeito de enzimas na atividade antifúngica do extrato bruto. O extrato bruto padronizado foi submetido à cromatografia de camada delgada (CCD) com diferentes solventes e o ensaio de autobiografia foi realizado para verificar a banda com atividade antifúngica. O composto ativo foi observado em um Rf de 0,35 quando utilizado como solvente a mistura de butanol/ ácido acético/ água. Após identificar a banda com atividade antifúngica foram realizados testes de coloração da CCD com cloreto férrico, ninhidrina e anisaldeído para identificação parcial do composto ativo. O resultado sugere que o composto não possui hidroxilas ligadas a anel aromático, não apresenta grupo amino livre e possivelmente alguma parte da molécula tenha um anel heterocíclico com nitrogênio ligado. Também, foi realizada a caracterização morfológica do isolado R18(6) através de microcultivo e microscopia eletrônica de varredura (MEV) e foram observadas estruturas características do gênero Streptomyces. / The dermatophytes fungi and Candida species are some of the microorganisms responsible for mycoses in humans. The treatment of these diseases eventually becomes difficult by the low number of antifungal agents in the market and by the emergence of resistance to the drugs available today. The actinobacteria are known by producing different secondary metabolites. This study aimed to evaluate the antifungal activity of secondary metabolites produced by actinomycetes isolates against fungal pathogens of clinical origin. For the selection of actinomycetes isolates with the best potential inhibition the assay of double layer was performed on starch casein agar (SCA). The isolates that showed activity were submitted to an optimization of the active compound production in submerged culture system. In order to do so, different culture media, temperatures and pH ranges were assessed. The antifungal activity was evaluated every 24 hours for eight days and activity was observed by well diffusion assay, where the antibiosis index was calculated. None of the dermatophyte isolates were inhibited in the double layer assay. Isolates 1S, R18(6) and 6(2) of the actinobacteria demonstrated activity against all the tested Candida species. Isolate R18(6) showed the highest activity in liquid culture and the best growing conditions for producing the antifungal compound was media starch casein broth , without pH control, temperature of 30°C with 72h of cell growth. Assays were performed as the minimum inhibitory concentration, thermal stability test and the effect of different enzymes on antifungal activity of the crude extract. The crude extract was subjected to standardized thin layer chromatography (TLC) with different solvents and an autobiography assay was conducted to verify band with antifungal activity. The active compound was observed at an Rf of 0.35 when the solvent mixture of butanol/ acetic acid/ water was used. After identifying the band with antifungal activity CCD coloring tests were performed with ferric chloride, anisaldehyde and ninhydrin for partial identification of the active compound; it has been observed that the compound does not have hydroxyl groups attached to the aromatic ring, it has no free amino group and possibly some part of the molecule has a linked nitrogen heterocyclic ring. Also, we performed a morphological characterization of the isolate R18 (6) through microcultive and scanning electron microscopy and structures have been observed characteristics of the genus Streptomyces.
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Bioprospecção de uma substância antifúngica potencialmente nova produzida por actinomicetos isolados no RS / Bioprospection of a potentially new antifungal substance produced by actinomycetes isolated on RSSpadari, Cristina de Castro January 2013 (has links)
Os fungos dermatófitos e as leveduras do gênero Candida são alguns dos microrganismos responsáveis por micoses em humanos. O tratamento dessas doenças acaba se tornando difícil pelo baixo número de antifúngicos existentes no mercado e pelo surgimento de resistência destes às drogas utilizadas. Já as actinobactérias são conhecidas por produzirem uma grande variedade de metabólitos secundários. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica dos metabólitos secundários produzidos por isolados de actinomicetos contra fungos dermatófitos e espécies de Candida sp. de origem clínica. Para a seleção dos isolados de actinomicetos com o melhor potencial de inibição foi realizado o ensaio de dupla camada em meio ágar amido caseína (ACA). Os isolados que mostraram atividade foram submetidos aos ensaios para a otimização da produção do composto ativo em sistema de cultura submersa. Para isso, foram avaliados diferentes meios de cultura, diferentes temperaturas e diferentes faixas de pH. A atividade antifúngica foi avaliada a cada 24h durante oito dias e observada através do ensaio de difusão em poço, onde foi calculado o índice de antibiose (IA). Nenhum dos isolados de fungos dermatófitos foi inibido no ensaio de dupla camada e os isolados 1S, R18(6) e 6(2) demonstraram atividade frente todas as espécies de Candida testadas. O isolado R18(6) mostrou melhor atividade em cultura líquida, sendo que as melhores condições de cultivo para a produção do antifúngico foi meio AC sem controle de pH, temperatura de 30°C e crescimento por 72h. Foram realizados ensaios como a concentração inibitória mínima, teste de termoestabilidade e avaliação do efeito de enzimas na atividade antifúngica do extrato bruto. O extrato bruto padronizado foi submetido à cromatografia de camada delgada (CCD) com diferentes solventes e o ensaio de autobiografia foi realizado para verificar a banda com atividade antifúngica. O composto ativo foi observado em um Rf de 0,35 quando utilizado como solvente a mistura de butanol/ ácido acético/ água. Após identificar a banda com atividade antifúngica foram realizados testes de coloração da CCD com cloreto férrico, ninhidrina e anisaldeído para identificação parcial do composto ativo. O resultado sugere que o composto não possui hidroxilas ligadas a anel aromático, não apresenta grupo amino livre e possivelmente alguma parte da molécula tenha um anel heterocíclico com nitrogênio ligado. Também, foi realizada a caracterização morfológica do isolado R18(6) através de microcultivo e microscopia eletrônica de varredura (MEV) e foram observadas estruturas características do gênero Streptomyces. / The dermatophytes fungi and Candida species are some of the microorganisms responsible for mycoses in humans. The treatment of these diseases eventually becomes difficult by the low number of antifungal agents in the market and by the emergence of resistance to the drugs available today. The actinobacteria are known by producing different secondary metabolites. This study aimed to evaluate the antifungal activity of secondary metabolites produced by actinomycetes isolates against fungal pathogens of clinical origin. For the selection of actinomycetes isolates with the best potential inhibition the assay of double layer was performed on starch casein agar (SCA). The isolates that showed activity were submitted to an optimization of the active compound production in submerged culture system. In order to do so, different culture media, temperatures and pH ranges were assessed. The antifungal activity was evaluated every 24 hours for eight days and activity was observed by well diffusion assay, where the antibiosis index was calculated. None of the dermatophyte isolates were inhibited in the double layer assay. Isolates 1S, R18(6) and 6(2) of the actinobacteria demonstrated activity against all the tested Candida species. Isolate R18(6) showed the highest activity in liquid culture and the best growing conditions for producing the antifungal compound was media starch casein broth , without pH control, temperature of 30°C with 72h of cell growth. Assays were performed as the minimum inhibitory concentration, thermal stability test and the effect of different enzymes on antifungal activity of the crude extract. The crude extract was subjected to standardized thin layer chromatography (TLC) with different solvents and an autobiography assay was conducted to verify band with antifungal activity. The active compound was observed at an Rf of 0.35 when the solvent mixture of butanol/ acetic acid/ water was used. After identifying the band with antifungal activity CCD coloring tests were performed with ferric chloride, anisaldehyde and ninhydrin for partial identification of the active compound; it has been observed that the compound does not have hydroxyl groups attached to the aromatic ring, it has no free amino group and possibly some part of the molecule has a linked nitrogen heterocyclic ring. Also, we performed a morphological characterization of the isolate R18 (6) through microcultive and scanning electron microscopy and structures have been observed characteristics of the genus Streptomyces.
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Caracterização do mecanismo de ação do composto natural plumieridina contra Cryptococcus gattiiSilva, Adriana Corrêa da January 2016 (has links)
As leveduras basidiomicéticas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são os agentes etiológicos da criptococose. A infecção se desenvolve via inalação e disseminação até o sistema nervoso central, causando lesões pulmonares e meningoencefalite, a principal causa de morte da criptococose. Estes fungos patogênicos causam aproximadamente um milhão de casos por ano, principalmente entre pacientes imunocomprometidos, resultando em aproximadamente 625.000 mortes. O tratamento da criptococose emprega altas doses dos fármacos anfotericina B e 5-flucitosina, seguido de longa monoterapia com fluconazol. Este tratamento é caracterizado pela nefrotoxicidade e hepatotoxicidade. Além destes efeitos tóxicos, o surgimento de linhagens resistentes a estes compostos leva à necessidade de novas estratégias terapêuticas, dentre as quais podem ser citadas moléculas obtidas de fontes vegetais. O composto natural plumieridina, extraído de Allamanda polyantha (uma planta nativa brasileira), possui atividade antifúngica. Com o objetivo de elucidar as bases moleculares desta atividade, uma biblioteca de mutantes de C. gattii obtida por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens foi triada utilizando distintas concentrações deste composto, tendo como referencial o valor de MIC para a linhagem selvagem de C. gattii. Foram encontrados dez mutantes sensíveis e um mutante resistente a plumieridina e os fatores de virulência clássicos foram avaliados. A identificação dos genes inativados pelo T-DNA revelou o possível envolvimento de algumas proteínas no mecanismo molecular de plumieridina, tais como lisofosfolipídeo aciltransferase, transportador de colina, protease rhomboide, transportador de arsenito ATPase, proteína BAG e subunidade N6 do complexo regulatório 26S proteasoma. Estas proteínas estão relacionadas com diferentes processos biológicos ligados a via de sinalização Unfolded Protein Response (UPR). Esses resultados indicam um complexo processo celular desencadeado por estresse de retículo endoplasmático, afetando indiretamente várias vias, o que sugere um novo mecanismo de ação para um fármaco antifúngico em potencial. / The basidiomycete yeasts Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are the etiologic agents of cryptococcosis. The infection proceeds via inhalation and dissemination of yeast cells to the central nervous system, causing lung injury and meningoencephalitis, which is the major cause of death on cryptococcosis. These fungal pathogens cause one million cases per year among immunocompromised patients mainly, resulting in nearly 625,000 deaths. The treatment of cryptococcosis uses high doses of amphotericin B and 5-flucytoseine, followed by long fluconazole monotherapy. This regime is characterized by nephrotoxicity and hepatotoxicity. In addition to these toxic effects, the emergence of strains resistant to these compounds leads to the need of new therapeutic strategies, among which molecules obtained from plant sources. The natural compound plumieridine, extract from Allamanda polyantha (a Brazillian native plant), has antifungal activity. In order to elucidate the molecular basis of plumieridine antifungal activity, a C. gattii mutant library obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation was screened using distinct plumieridine concentrations based on MIC value for C. gattii wild type. One resistant and ten susceptible mutants were found and the classical virulence factors were evaluated. The genome-wide screening revealed the possible involvement of some proteins in molecular mechanisms of plumieridine, such as lysophospholipid acyltransferase, choline transporter, rhomboid protease, arsenite transporting ATPase, BAG Protein and 26S proteasome regulatory subunit N6. These proteins are related with different biological process linked to Unfolded Protein Response (UPR) signaling pathway. This result suggests a complex cell process triggered by endoplasmic reticulum stress with many pathways indirectly affected by plumieridine, displaying a novel mechanism of action in a potential antifungal agent.
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Avaliação da utilização de uma vacina de DNA contendo a região codificadora de 14-3-3 de Cryptococcus gattii como estratégia profilática para criptococoseMingori, Moara Rodrigues January 2014 (has links)
Cryptococcus gattii é um patógeno emergente que infecta principalmente indivíduos imunocompetentes, causando criptococose. Dentre os tratamentos estão anfotericina B e fluconazol, porém são insuficientes na erradicação da doença. A estimulação da resposta imune por vacinas de DNA em diversos modelos fúngicos vem sendo relatados. Dentre as proteínas fúngicas candidatas no desenvolvimento de vacinas estão às proteínas 14-3-3, as quais foram identificadas como proteínas imudominantes em estudos de proteômica de Cryptococcus neoformans e C. gattii e em soro de pacientes com criptococose. O objetivo deste estudo foi realizar a construção do vetor recombinante contendo a região codificante do gene 14-3-3, seguido da análise preliminar da resposta imune em camundongos imunizados. A região codificante do 14-3-3 foi clonada em vetor de expressão eucariótico pcDNA3.1(+) e a funcionalidade do vetor recombinante foi confirmada a nível transcricional por RT-PCR a partir de células A549 transfectadas com a vacina de DNA e a nível traducional por imunobloting. A proteína 14-3-3 foi ainda localizada na parede celular da levedura, revelado por metodologias de microscopia por imunofluorescência. A porção codificante do gene 14-3-3 de C. gattii foi clonada em vetor de expressão pET23-d e a proteína recombinante foi expressa em células de E. coli BL21 e purificada por cromatografia de afinidade a níquel. A resposta imune humoral foi determinada por dosagem de imunoglobulinas, porém não ocorreu diferença estatística na indução de imunoglobulinas totais em camundongos inoculados com a vacina. Assim esse trabalho contribuiu para o estudo imunogenicidade da proteína 14-3-3 em C. gattii permitindo possíveis estudos em outros modelos animais usando a mesma estratégia profilática. / Cryptococcus gattii is an emerging pathogen that mainly infects immunocompetent individuals, causing cryptococcosis. Among the treatments are amphotericin B and fluconazole, but they have proven insufficient in eradicating this disease. The immune responses stimulation by DNA vaccines in several fungal models has been reported. Among fungal candidate proteins in vaccine development are the 14-3-3 proteins, which were identified as immunodominant sera proteins in Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii proteomics and in serum of patients with cryptococcosis. The study aimed to construct a recombinant vector containing the 14-3-3 coding region, followed by the immune response preliminary analysis of immunized mice. The 14-3-3 gene was cloned into a eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+) vector and RT-PCR confirmed the recombinant transcriptional level functionality from A549 transfected with DNA vaccine cells and translational level by immunoblotting. The 14-3-3 protein was localized associated with the yeast cell wall, as revealed by immunofluorescence microscopy. The coding portion of the 14-3-3 C. gattii gene was cloned into pET23-d expression vector and the recombinant protein was expressed in E. coli BL21 and purified by nickel affinity chromatography. The humoral immune response was determined by serum total immunoglobulin measurements, but no statistical differences were observed in total immunoglobulins from vaccine-inoculated mice. Thus, this research contributed to 14-3-3 C. gattii protein immunogenicity study, allowing possible researches in other animal models applying the same prophylactic strategy.
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Avaliação da utilização de uma vacina de DNA contendo a região codificadora de 14-3-3 de Cryptococcus gattii como estratégia profilática para criptococoseMingori, Moara Rodrigues January 2014 (has links)
Cryptococcus gattii é um patógeno emergente que infecta principalmente indivíduos imunocompetentes, causando criptococose. Dentre os tratamentos estão anfotericina B e fluconazol, porém são insuficientes na erradicação da doença. A estimulação da resposta imune por vacinas de DNA em diversos modelos fúngicos vem sendo relatados. Dentre as proteínas fúngicas candidatas no desenvolvimento de vacinas estão às proteínas 14-3-3, as quais foram identificadas como proteínas imudominantes em estudos de proteômica de Cryptococcus neoformans e C. gattii e em soro de pacientes com criptococose. O objetivo deste estudo foi realizar a construção do vetor recombinante contendo a região codificante do gene 14-3-3, seguido da análise preliminar da resposta imune em camundongos imunizados. A região codificante do 14-3-3 foi clonada em vetor de expressão eucariótico pcDNA3.1(+) e a funcionalidade do vetor recombinante foi confirmada a nível transcricional por RT-PCR a partir de células A549 transfectadas com a vacina de DNA e a nível traducional por imunobloting. A proteína 14-3-3 foi ainda localizada na parede celular da levedura, revelado por metodologias de microscopia por imunofluorescência. A porção codificante do gene 14-3-3 de C. gattii foi clonada em vetor de expressão pET23-d e a proteína recombinante foi expressa em células de E. coli BL21 e purificada por cromatografia de afinidade a níquel. A resposta imune humoral foi determinada por dosagem de imunoglobulinas, porém não ocorreu diferença estatística na indução de imunoglobulinas totais em camundongos inoculados com a vacina. Assim esse trabalho contribuiu para o estudo imunogenicidade da proteína 14-3-3 em C. gattii permitindo possíveis estudos em outros modelos animais usando a mesma estratégia profilática. / Cryptococcus gattii is an emerging pathogen that mainly infects immunocompetent individuals, causing cryptococcosis. Among the treatments are amphotericin B and fluconazole, but they have proven insufficient in eradicating this disease. The immune responses stimulation by DNA vaccines in several fungal models has been reported. Among fungal candidate proteins in vaccine development are the 14-3-3 proteins, which were identified as immunodominant sera proteins in Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii proteomics and in serum of patients with cryptococcosis. The study aimed to construct a recombinant vector containing the 14-3-3 coding region, followed by the immune response preliminary analysis of immunized mice. The 14-3-3 gene was cloned into a eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+) vector and RT-PCR confirmed the recombinant transcriptional level functionality from A549 transfected with DNA vaccine cells and translational level by immunoblotting. The 14-3-3 protein was localized associated with the yeast cell wall, as revealed by immunofluorescence microscopy. The coding portion of the 14-3-3 C. gattii gene was cloned into pET23-d expression vector and the recombinant protein was expressed in E. coli BL21 and purified by nickel affinity chromatography. The humoral immune response was determined by serum total immunoglobulin measurements, but no statistical differences were observed in total immunoglobulins from vaccine-inoculated mice. Thus, this research contributed to 14-3-3 C. gattii protein immunogenicity study, allowing possible researches in other animal models applying the same prophylactic strategy.
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Bioprospecção de uma substância antifúngica potencialmente nova produzida por actinomicetos isolados no RS / Bioprospection of a potentially new antifungal substance produced by actinomycetes isolated on RSSpadari, Cristina de Castro January 2013 (has links)
Os fungos dermatófitos e as leveduras do gênero Candida são alguns dos microrganismos responsáveis por micoses em humanos. O tratamento dessas doenças acaba se tornando difícil pelo baixo número de antifúngicos existentes no mercado e pelo surgimento de resistência destes às drogas utilizadas. Já as actinobactérias são conhecidas por produzirem uma grande variedade de metabólitos secundários. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica dos metabólitos secundários produzidos por isolados de actinomicetos contra fungos dermatófitos e espécies de Candida sp. de origem clínica. Para a seleção dos isolados de actinomicetos com o melhor potencial de inibição foi realizado o ensaio de dupla camada em meio ágar amido caseína (ACA). Os isolados que mostraram atividade foram submetidos aos ensaios para a otimização da produção do composto ativo em sistema de cultura submersa. Para isso, foram avaliados diferentes meios de cultura, diferentes temperaturas e diferentes faixas de pH. A atividade antifúngica foi avaliada a cada 24h durante oito dias e observada através do ensaio de difusão em poço, onde foi calculado o índice de antibiose (IA). Nenhum dos isolados de fungos dermatófitos foi inibido no ensaio de dupla camada e os isolados 1S, R18(6) e 6(2) demonstraram atividade frente todas as espécies de Candida testadas. O isolado R18(6) mostrou melhor atividade em cultura líquida, sendo que as melhores condições de cultivo para a produção do antifúngico foi meio AC sem controle de pH, temperatura de 30°C e crescimento por 72h. Foram realizados ensaios como a concentração inibitória mínima, teste de termoestabilidade e avaliação do efeito de enzimas na atividade antifúngica do extrato bruto. O extrato bruto padronizado foi submetido à cromatografia de camada delgada (CCD) com diferentes solventes e o ensaio de autobiografia foi realizado para verificar a banda com atividade antifúngica. O composto ativo foi observado em um Rf de 0,35 quando utilizado como solvente a mistura de butanol/ ácido acético/ água. Após identificar a banda com atividade antifúngica foram realizados testes de coloração da CCD com cloreto férrico, ninhidrina e anisaldeído para identificação parcial do composto ativo. O resultado sugere que o composto não possui hidroxilas ligadas a anel aromático, não apresenta grupo amino livre e possivelmente alguma parte da molécula tenha um anel heterocíclico com nitrogênio ligado. Também, foi realizada a caracterização morfológica do isolado R18(6) através de microcultivo e microscopia eletrônica de varredura (MEV) e foram observadas estruturas características do gênero Streptomyces. / The dermatophytes fungi and Candida species are some of the microorganisms responsible for mycoses in humans. The treatment of these diseases eventually becomes difficult by the low number of antifungal agents in the market and by the emergence of resistance to the drugs available today. The actinobacteria are known by producing different secondary metabolites. This study aimed to evaluate the antifungal activity of secondary metabolites produced by actinomycetes isolates against fungal pathogens of clinical origin. For the selection of actinomycetes isolates with the best potential inhibition the assay of double layer was performed on starch casein agar (SCA). The isolates that showed activity were submitted to an optimization of the active compound production in submerged culture system. In order to do so, different culture media, temperatures and pH ranges were assessed. The antifungal activity was evaluated every 24 hours for eight days and activity was observed by well diffusion assay, where the antibiosis index was calculated. None of the dermatophyte isolates were inhibited in the double layer assay. Isolates 1S, R18(6) and 6(2) of the actinobacteria demonstrated activity against all the tested Candida species. Isolate R18(6) showed the highest activity in liquid culture and the best growing conditions for producing the antifungal compound was media starch casein broth , without pH control, temperature of 30°C with 72h of cell growth. Assays were performed as the minimum inhibitory concentration, thermal stability test and the effect of different enzymes on antifungal activity of the crude extract. The crude extract was subjected to standardized thin layer chromatography (TLC) with different solvents and an autobiography assay was conducted to verify band with antifungal activity. The active compound was observed at an Rf of 0.35 when the solvent mixture of butanol/ acetic acid/ water was used. After identifying the band with antifungal activity CCD coloring tests were performed with ferric chloride, anisaldehyde and ninhydrin for partial identification of the active compound; it has been observed that the compound does not have hydroxyl groups attached to the aromatic ring, it has no free amino group and possibly some part of the molecule has a linked nitrogen heterocyclic ring. Also, we performed a morphological characterization of the isolate R18 (6) through microcultive and scanning electron microscopy and structures have been observed characteristics of the genus Streptomyces.
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Efeito de um antifungico derivado imidazolico-cetoconazol, sobre o perfil enzimatico da aspartato-aminotransferase e alanina-aminotransferase no soro de ratos parcialmente hepatectomizadosAraujo, Carlos Eduardo Pulz 18 July 2018 (has links)
Orientador : Thales Rocha de Mattos Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-18T04:23:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 1992 / Resumo: Não informado / Abstract: Not informed. / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Odontologia
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Propriedasdes antifúngicas da urease de Canavalia ensiformisPostal, Melissa January 2012 (has links)
Ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas que hidrolisam uréia para produzir amônia e dióxido de carbono. Essas proteínas têm atividade inseticida e fungicida, efeitos independentes da sua atividade ureolítica. A atividade inseticida de ureases depende, em parte, da liberação de peptídeos internos através da hidrólise por catepsinas digestivas do inseto. Um desses peptídeos foi isolado e um recombinante chamado Jaburetox –V5 foi produzido em E. coli a partir da sequência da urease. Outra propriedade relevante de ureases é sua atividade antifúngica, que ocorre em concentrações de 10-7 M para certos fungos filamentosos, causando danos à membrana celular, visualizados por microscopia eletrônica de varredura. Moléculas antifúngicas de origem vegetal representam uma alternativa estratégica para o surgimento de espécies resistentes de fungos. Sabendo que a atividade antifúngica das ureases é cerca de 3-4 de magnitude mais ativa do que a maioria das proteínas antifúngicas já descritas, neste trabalho, avaliamos o efeito tóxico da urease de C. ensiformis (JBU) sobre diferentes espécies de leveduras. Além disso, buscamos identificar as regiões responsáveis por essa atividade através da fragmentação da JBU por hidrólise enzimática. Os efeitos tóxicos da JBU também ocorrem em espécies de leveduras, indicando que atividade antifúngica não afeta somente fungos filamentosos. Os efeitos da JBU nas leveduras variam conforme o gênero e a espécie, tanto em termos qualitativos como quantitativos, indicando seletividade espécie-específica. Os efeitos fungitóxicos consistem de inibição da multiplicação, indução de alterações morfológicas com formação de pseudo-hifas, alterações do transporte de H+ e no metabolismo energético, permeabilização de membranas, podendo ocorrer morte celular. Nas condições testadas, não houve produção de espécies reativas de oxigênio associada ao efeito fungitóxico da JBU. A hidrólise da JBU com papaína produziu fragmentos tóxicos com massa molecular ~10 kD. Esses hidrolisados foram analisados por espectrometria de massas e um fragmento contendo parte da sequência N-terminal do peptídeo entomotóxico Jaburetox foi encontrado. A atividade fungitóxica do peptídeo recombinante Jaburetox – V5 foi testada, sendo observada atividade tóxica sobre leveduras e fungos filamentosos. A atividade antifúngica do Jaburetox-V5 requer concentrações 2-3 vezes maiores do que aquela observada para a holoproteína JBU, indicando a possibilidade de que outros domínios da proteína estejam envolvidos nessa atividade. A descoberta de novos agentes antifúngicos é urgente e imperativa, devido ao crescente número de casos de micoses invasivas. Ureases de plantas, como a JBU, e peptídeos derivados, podem representar uma nova alternativa para controle de fungos de importância clínica e fitopatogênicos, principalmente em se considerando a potente atividade, na faixa de 10-6 a 10-7 M . Estudos estrutura versus atividade adicionais, aprofundando a identificação de domínios antifúngicos, e a construção de recombinantes contendo esses domínios, são etapas futuras para avaliar o real potencial fungicida/fungistático das ureases e peptídeos derivados. / Ureases (EC 3.5.1.5) are metalloenzymes that hydrolyze urea to produce ammonia and carbon dioxide. These proteins have insecticidal and fungicidal effects not related to their enzyme activity. The insecticidal activity of urease is mostly dependent on the release of internal peptides consequent to hydrolysis of the ingested protein by insect digestive cathepsins. One of these peptides was isolated and its recombinant version, named Jaburetox-V5, was produced in E. coli. Another important property of ureases is their antifungal activity, which occurs at concentrations of 10-7 M for certain filamentous fungi, causing damage to the cell membranes, as visualized by scanning electron microscopy. Antifungal molecules from plants represent an alternative strategy to the emergence of resistant fungal species. Considering that the antifungal activity of urease is about 3-4 orders of magnitude more potent than most of the antifungal proteins already described, in this study, we evaluated the toxic effect of Canavalia ensiformis urease (JBU) on different species of yeast. Furthermore, studies aiming to identify antifungal domain(s) of JBU by enzymatic hydrolysis were carried out. The results showed that JBU exerts toxic effects on yeast species, indicating that antifungal activity is not restricted to filamentous fungi. The effects of JBU in yeast varied according to the genus and species of yeasts, both in qualitative and quantitative terms, indicating a species-specific selectivity. The fungitoxic effects consisted in inhibition of proliferation, induction of morphological alterations with formation of pseudo hyphae, changes in the transport of H+ and carbohydrate metabolism, permeabilization of membranes, eventually leading to cell death. Under the conditions tested, there was no production of reactive oxygen species associated with the antifungal effect of JBU. Hydrolysis of JBU with papain resulted in fungitoxic fragments with molecular mass ~ 10 kD. These peptides were analyzed by mass spectrometry, revealing the presence of a fragment containing the Nterminal sequence of the entomotoxic peptide Jaburetox. We tested the recombinant peptide Jaburetox-V5 for antifungal effects and observed fungitoxic activity on yeast and filamentous fungi. The antifungal activity of Jaburetox-V5 requires 2-3 times larger concentrations than those observed for the holoprotein JBU, indicating the possibility that other protein domains are involved in this activity. The discovery of new antifungal agents is imperative to face the increasing number of cases of invasive mycoses. Plant ureases, such as JBU, and its derived peptides, may represent a new alternative to control medically important and phytopathogenic fungi, especially considering their potent activity in the range of 10-6 to 10-7 M. More studies are necessary to clarify the structure versus activity relationships of ureases. Construction of mutants containing ureasederived antifungal domains is one of the necessary steps to assess the real fungicidal/ fungistatic potential of ureases and derived peptides.
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Histoplasmose em indivíduos HIV positivos no estado do Ceará : estudo clínico epidemiológico e teste de sensibilidade antimicrobiana de cepas de Histoplasma capsulatum var. Capsulatum / Histoplasmosis in HIV-positive individuals in the state of Ceará : clinical epidemiological study and antimicrobial susceptibility testing Histoplasma capsulatum strains var. capsulatumFechine, Maria Auxiliadora Bezerra January 2011 (has links)
FECHINE, Maria Auxiliadora Bezerra. Histoplasmose em indivíduos HIV positivos no estado do Ceará : estudo clínico epidemiológico e teste de sensibilidade antimicrobiana de cepas de Histoplasma capsulatum var. Capsulatum. 2011. 145 f. Tese (Doutorado em Ciências Médicas) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-05-18T16:39:36Z
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Previous issue date: 2011 / Histoplasmosis, caused by the fungus Histoplasma capsulatum, is the most prevalent of the systemic mycoses and a marker disease for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). A descriptive analysis was carried out of 254 cases of patients suffering from histoplasmosis and AIDS between 2006 and 2010 in the state of Ceará, northeastern Brazil, noting the epidemiological, clinical, laboratory and therapeutic aspects. Additionally, the in vitro sensitivity profile of strains of H. capsulatum in the filamentous and yeast phases was tested by the microdilution method against the antifungals amphotericin B, fluconazole, itraconazole, voriconazole and caspofungin and the combined antimicrobial sulfametoxazol-trimetoprim, according to protocol M-27A2 from the CLSI. The results were compared with those of strains obtained from southeastern Brazil. In 39.37% of the cases, histoplasmosis was the first event indicating AIDS and in 80.4% of the patients the CD4 cell count was under 100 cells/ml. The levels of lactate dehydrogenase were high in all the patients evaluated, with impaired hepatic and renal function evolving to death being observed in 41.7% of the cases. The in vitro sensitivity profile demonstrated there was no antifungal resistance in the strains analyzed and all the strains were sensitive to sulfametoxazol-trimetoprim. The MFC levels of caspofungin, itraconazole, voriconazole and sulfametoxazol-trimetoprim were higher for the strains from the Northeast than those from the Southeast. In recent years there has been a significant increase in the number of histoplasmosis cases in HIV-positive individuals in the state of Ceará, but the results showed no resistance among the strains of H. capsulatum tested. These showed sensitivity of sulfametoxazol-trimetoprim, but there was a difference in sensitivity between the strains from the northeastern and southeastern regions of Brazil / A histoplasmose, causada pelo fungo Histoplasma capsulatum, é a mais prevalente das micoses sistêmicas e doença marcadora da síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS). Foi realizada análise descritiva de 254 casos de histoplasmose em pacientes com AIDS, no período de 2006 a 2010, no Estado do Ceará, Nordeste do Brasil, descrevendo os aspectos epidemiológicos, clínicos, laboratoriais e terapêuticos. Adicionalmente, buscou-se determinar o perfil de sensibilidade in vitro de cepas de H.capsulatum. O teste de sensibilidade in vitro foi realizado, pelo método da microdiluição, segundo protocolo M-27A2 do CLSI, em cepas de H. capsulatum nas fases filamentosa e leveduriforme, frente os antifúngicos anfotericina B, fluconazol, itraconazol, voriconazol e caspofungina, e o antimicrobiano sulfametoxazol-trimetoprim, comparando-se cepas obtidas dos casos do período analisado e cepas clínicas oriundas de pacientes do Sudeste do Brasil. Em 39,37% dos casos, a histoplasmose foi o primeiro evento definidor de SIDA e em 80,4% dos pacientes a contagem de células CD4 era menor do que 100 cells/ml. Os níveis de lactato desidrogenase estavam elevados em todos os pacientes avaliados, observando-se comprometimento da função hepática e renal, com evolução para óbito em 41,7% dos casos. O perfil de sensibilidade in vitro demonstrou que não há fenômeno de resistência antifúngica entre as cepas avaliadas, e todas as cepas foram sensíveis ao sulfametoxazol-trimetoprim. A CFM das drogas caspofungina, itraconazol, voriconazol e sulfametoxazol-trimetoprim foi mais elevada para as cepas oriundas do Nordeste em relação às cepas do Sudeste do Brasil. Existe aumento significativo no número de casos de histoplasmose em indivíduos HIV positivos no Estado do Ceará, Nordeste do Brasil, em relação a estudos anteriores, mas não há fenômeno de resistência entre as cepas de H. capsulatum, e estas demonstram sensibilidade ao sulfametoxazol-trimetoprim, com diferença no perfil de sensibilidade entre as cepas do Nordeste e Sudeste do Brasil.
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Propriedasdes antifúngicas da urease de Canavalia ensiformisPostal, Melissa January 2012 (has links)
Ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas que hidrolisam uréia para produzir amônia e dióxido de carbono. Essas proteínas têm atividade inseticida e fungicida, efeitos independentes da sua atividade ureolítica. A atividade inseticida de ureases depende, em parte, da liberação de peptídeos internos através da hidrólise por catepsinas digestivas do inseto. Um desses peptídeos foi isolado e um recombinante chamado Jaburetox –V5 foi produzido em E. coli a partir da sequência da urease. Outra propriedade relevante de ureases é sua atividade antifúngica, que ocorre em concentrações de 10-7 M para certos fungos filamentosos, causando danos à membrana celular, visualizados por microscopia eletrônica de varredura. Moléculas antifúngicas de origem vegetal representam uma alternativa estratégica para o surgimento de espécies resistentes de fungos. Sabendo que a atividade antifúngica das ureases é cerca de 3-4 de magnitude mais ativa do que a maioria das proteínas antifúngicas já descritas, neste trabalho, avaliamos o efeito tóxico da urease de C. ensiformis (JBU) sobre diferentes espécies de leveduras. Além disso, buscamos identificar as regiões responsáveis por essa atividade através da fragmentação da JBU por hidrólise enzimática. Os efeitos tóxicos da JBU também ocorrem em espécies de leveduras, indicando que atividade antifúngica não afeta somente fungos filamentosos. Os efeitos da JBU nas leveduras variam conforme o gênero e a espécie, tanto em termos qualitativos como quantitativos, indicando seletividade espécie-específica. Os efeitos fungitóxicos consistem de inibição da multiplicação, indução de alterações morfológicas com formação de pseudo-hifas, alterações do transporte de H+ e no metabolismo energético, permeabilização de membranas, podendo ocorrer morte celular. Nas condições testadas, não houve produção de espécies reativas de oxigênio associada ao efeito fungitóxico da JBU. A hidrólise da JBU com papaína produziu fragmentos tóxicos com massa molecular ~10 kD. Esses hidrolisados foram analisados por espectrometria de massas e um fragmento contendo parte da sequência N-terminal do peptídeo entomotóxico Jaburetox foi encontrado. A atividade fungitóxica do peptídeo recombinante Jaburetox – V5 foi testada, sendo observada atividade tóxica sobre leveduras e fungos filamentosos. A atividade antifúngica do Jaburetox-V5 requer concentrações 2-3 vezes maiores do que aquela observada para a holoproteína JBU, indicando a possibilidade de que outros domínios da proteína estejam envolvidos nessa atividade. A descoberta de novos agentes antifúngicos é urgente e imperativa, devido ao crescente número de casos de micoses invasivas. Ureases de plantas, como a JBU, e peptídeos derivados, podem representar uma nova alternativa para controle de fungos de importância clínica e fitopatogênicos, principalmente em se considerando a potente atividade, na faixa de 10-6 a 10-7 M . Estudos estrutura versus atividade adicionais, aprofundando a identificação de domínios antifúngicos, e a construção de recombinantes contendo esses domínios, são etapas futuras para avaliar o real potencial fungicida/fungistático das ureases e peptídeos derivados. / Ureases (EC 3.5.1.5) are metalloenzymes that hydrolyze urea to produce ammonia and carbon dioxide. These proteins have insecticidal and fungicidal effects not related to their enzyme activity. The insecticidal activity of urease is mostly dependent on the release of internal peptides consequent to hydrolysis of the ingested protein by insect digestive cathepsins. One of these peptides was isolated and its recombinant version, named Jaburetox-V5, was produced in E. coli. Another important property of ureases is their antifungal activity, which occurs at concentrations of 10-7 M for certain filamentous fungi, causing damage to the cell membranes, as visualized by scanning electron microscopy. Antifungal molecules from plants represent an alternative strategy to the emergence of resistant fungal species. Considering that the antifungal activity of urease is about 3-4 orders of magnitude more potent than most of the antifungal proteins already described, in this study, we evaluated the toxic effect of Canavalia ensiformis urease (JBU) on different species of yeast. Furthermore, studies aiming to identify antifungal domain(s) of JBU by enzymatic hydrolysis were carried out. The results showed that JBU exerts toxic effects on yeast species, indicating that antifungal activity is not restricted to filamentous fungi. The effects of JBU in yeast varied according to the genus and species of yeasts, both in qualitative and quantitative terms, indicating a species-specific selectivity. The fungitoxic effects consisted in inhibition of proliferation, induction of morphological alterations with formation of pseudo hyphae, changes in the transport of H+ and carbohydrate metabolism, permeabilization of membranes, eventually leading to cell death. Under the conditions tested, there was no production of reactive oxygen species associated with the antifungal effect of JBU. Hydrolysis of JBU with papain resulted in fungitoxic fragments with molecular mass ~ 10 kD. These peptides were analyzed by mass spectrometry, revealing the presence of a fragment containing the Nterminal sequence of the entomotoxic peptide Jaburetox. We tested the recombinant peptide Jaburetox-V5 for antifungal effects and observed fungitoxic activity on yeast and filamentous fungi. The antifungal activity of Jaburetox-V5 requires 2-3 times larger concentrations than those observed for the holoprotein JBU, indicating the possibility that other protein domains are involved in this activity. The discovery of new antifungal agents is imperative to face the increasing number of cases of invasive mycoses. Plant ureases, such as JBU, and its derived peptides, may represent a new alternative to control medically important and phytopathogenic fungi, especially considering their potent activity in the range of 10-6 to 10-7 M. More studies are necessary to clarify the structure versus activity relationships of ureases. Construction of mutants containing ureasederived antifungal domains is one of the necessary steps to assess the real fungicidal/ fungistatic potential of ureases and derived peptides.
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