CUNHA, Juliana Ribeiro. Resposta antioxidante de raízes de arroz deficientes em peroxidases de ascorbato do citosol aos estresses salino e osmótico. 2014. 73 f. Dissertação (Mestrado de Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-01T12:29:58Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_jrcunha.pdf: 1279314 bytes, checksum: a28bd01afc552e65a95fd7899e549097 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-12T23:28:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_jrcunha.pdf: 1279314 bytes, checksum: a28bd01afc552e65a95fd7899e549097 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-12T23:28:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_jrcunha.pdf: 1279314 bytes, checksum: a28bd01afc552e65a95fd7899e549097 (MD5) Previous issue date: 2014 / Salt and osmotic stresses are responsible for significant losses in agriculture, particularly in semiarid regions. In such conditions, roots are the first plant organ in contact with the stress and are responsible for perception and signaling. In leaves, cytosolic ascorbate peroxidases (APX) are the main isoforms involved with antioxidative defence against H2O2 excess and signaling under stressful conditions. Nevertheless, such metabolic mechanisms in roots are still unknown. The aim of this study was to test the hypothesis that cytosolic APX isoforms are essential to antioxidant protection in rice roots exposed to salt and osmotic stresses. To test this hypothesis, rice mutants double silenced for cytosolic APXs (APX1/2) and non-transformed plants, both with 45 day-old, were submitted to two stressful treatments: (1) NaCl and mannitol in iso-osmotic concentrations (-0.62MPa) for eight days and (2) mannitol 268 mM (-0.62MPa) for two days. In mutant plants, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts (RNAs) were reduced by 90% whereas both protein abundance measured by Western blotting were not detectable. Under control conditions, total APX activity was reduced by 66% in comparison with NT plants, showing that the silencing was effective in roots. In APX1/2 roots, H2O2 level was increased by 51% as a consequence of APX1/2 silencing. Both stresses affected similarly root and shoot growing compared with NT. Membrane damage was increased at the same level in both genotypes and in both stresses, showing that APX1/2 were as sensible as NT plants. In NT roots, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts was slightly increased by NaCl and mannitol whereas only NaCl increased APX activity. Under salt stress, both genotypes increased other APX isoforms, especially OsAPX3, OsAPX5 and OsAPX8. These increases were correlated with the increased APX activity. In addition, other peroxidases (GPX and GPOD) displayed the same trend as APX, increasing their activity in response to NaCl. On the other hand, mannitol induced a prominent increase in catalase activity in NT plants, while in APX1/2 plants CAT activity did not changed. The H2O2 content was increased in both genotypes exposed to mannitol treatments, and was reduced for NaCl. TBARS level was not altered in the presence of both stresses for both genotypes. This study shows that rice plants exposed to salt or osmotic stresses display complex responses regarding to redox metabolism. Apparently, both cytosolic APXs are not essential to antioxidative protection, since mutant plants presented similar physiological performance to NT plants. The responses to both stresses, NaCl and mannitol, were contrasting for both genotypes, suggesting that different mechanisms of antioxidative protection were triggered for each different stress condition. / Os estresses salino e osmótico são responsáveis por perdas significativas na produção agrícola, particularmente nas regiões semiáridas. Nessas condições, a raiz é o órgão da planta que sofre os primeiros efeitos e é responsável pela percepção e sinalização bioquímica dos estresses. Em folhas, as peroxidases do ascorbato do citosol são as principais isoformas envolvidas com a proteção antioxidativa contra o excesso de H2O2 e são também relacionadas na sinalização em condições de estresses. Entretanto, esses mecanismos de ação em raízes são pouco conhecidos. O objetivo deste estudo foi testar a hipótese de que as APXs citosólicas são essenciais para a proteção antioxidativa de raízes de arroz expostas às condições de estresse salino e osmótico. Para isso, plantas transgênicas silenciadas nas duas isoformas de APXs citosólicas (APX1/2) e plantas não transformadas (45 dias de idade) foram expostas a duas condições de estresse: (1) NaCl e manitol em concentrações iso-osmóticas (-0,62 MPa) durante oito dias e (2) manitol 268 mM (-0,62 MPa) por dois dias. Em plantas silenciadas, a quantidade de transcritos (RNAs) de OsAPX1 e OsAPX2 foi reduzida em 90% enquanto que a abundância das duas proteínas mensurada por western blotting não foi detectável. A atividade total de APX foi diminuída em 66% em comparação com as NTs na condição controle, evidenciando que o silenciamento foi efetivo nas raízes. Como consequência da deficiência das APX1/2, o nível de H2O2 foi aumentado em 51% comparado com as NTs. Ambos os estresses afetaram de modo similar o crescimento da raiz e parte aérea das APX1/2, em comparação com as plantas não transformadas (NT). Os valores de danos de membrana nas raízes foram aumentados na mesma intensidade nos dois genótipos e nos dois tipos de estresses, indicando que as APX1/2 apresentaram mesma sensibilidade aos estresses estudados. Nas plantas NT, as quantidades de transcritos de OsAPX1 e OsAPX2 foram aumentadas discretamente por NaCl e manitol enquanto que a atividade de APX foi aumentada somente pelo NaCl. As plantas APX1/2 mostraram a mesma tendência das NTs quanto a expressão e atividade de APX. O aumento na quantidade relativa dos transcritos das outras isoformas de APX, principalmente de OsAPX3, OsAPX5 e OsAPX8, em ambos os genótipos sob estresse salino, foi correlacionado com o aumento da atividade da APX. Além disso, outras peroxidases (GPX e GPOD) apresentaram a mesma tendência de aumento de atividade apenas sob estresse salino. Diferentemente, manitol induziu um aumento proeminente na atividade de catalase nas plantas NT enquanto que nas APX1/2 essa enzima já apresentava atividade aumentada antes do estresse e permaneceu no mesmo nível. As concentrações de H2O2 foram aumentadas intensamente por manitol e reduzidas na presença de NaCl. O nível de TBARS (indicador de peroxidação lipídica) foi mantido inalterado na presença dos dois estresses e nos dois tipos de plantas. Os resultados deste estudo, quando analisados em conjunto, mostram que raízes de arroz expostas aos estresses salino e osmótico exibiram respostas complexas em termos de metabolismo redox. Aparentemente, as duas APXs citosólicas não são essenciais para a proteção antioxidativa, uma vez que as plantas mutantes apresentaram uma performance fisiológica semelhante as plantas NT. As respostas aos dois fatores de estresse, NaCl e manitol, foram contrastantes nos dois genótipos, sugerindo que diferentes mecanismos de proteção antioxidante foram acionados para cada tipo de estresse.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os estresses salino e osmÃtico sÃo responsÃveis por perdas significativas na produÃÃo agrÃcola, particularmente nas regiÃes semiÃridas. Nessas condiÃÃes, a raiz à o ÃrgÃo da planta que sofre os primeiros efeitos e à responsÃvel pela percepÃÃo e sinalizaÃÃo bioquÃmica dos estresses. Em folhas, as peroxidases do ascorbato do citosol sÃo as principais isoformas envolvidas com a proteÃÃo antioxidativa contra o excesso de H2O2 e sÃo tambÃm relacionadas na sinalizaÃÃo em condiÃÃes de estresses. Entretanto, esses mecanismos de aÃÃo em raÃzes sÃo pouco conhecidos. O objetivo deste estudo foi testar a hipÃtese de que as APXs citosÃlicas sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa de raÃzes de arroz expostas Ãs condiÃÃes de estresse salino e osmÃtico. Para isso, plantas transgÃnicas silenciadas nas duas isoformas de APXs citosÃlicas (APX1/2) e plantas nÃo transformadas (45 dias de idade) foram expostas a duas condiÃÃes de estresse: (1) NaCl e manitol em concentraÃÃes iso-osmÃticas (-0,62 MPa) durante oito dias e (2) manitol 268 mM (-0,62 MPa) por dois dias. Em plantas silenciadas, a quantidade de transcritos (RNAs) de OsAPX1 e OsAPX2 foi reduzida em 90% enquanto que a abundÃncia das duas proteÃnas mensurada por western blotting nÃo foi detectÃvel. A atividade total de APX foi diminuÃda em 66% em comparaÃÃo com as NTs na condiÃÃo controle, evidenciando que o silenciamento foi efetivo nas raÃzes. Como consequÃncia da deficiÃncia das APX1/2, o nÃvel de H2O2 foi aumentado em 51% comparado com as NTs. Ambos os estresses afetaram de modo similar o crescimento da raiz e parte aÃrea das APX1/2, em comparaÃÃo com as plantas nÃo transformadas (NT). Os valores de danos de membrana nas raÃzes foram aumentados na mesma intensidade nos dois genÃtipos e nos dois tipos de estresses, indicando que as APX1/2 apresentaram mesma sensibilidade aos estresses estudados. Nas plantas NT, as quantidades de transcritos de OsAPX1 e OsAPX2 foram aumentadas discretamente por NaCl e manitol enquanto que a atividade de APX foi aumentada somente pelo NaCl. As plantas APX1/2 mostraram a mesma tendÃncia das NTs quanto a expressÃo e atividade de APX. O aumento na quantidade relativa dos transcritos das outras isoformas de APX, principalmente de OsAPX3, OsAPX5 e OsAPX8, em ambos os genÃtipos sob estresse salino, foi correlacionado com o aumento da atividade da APX. AlÃm disso, outras peroxidases (GPX e GPOD) apresentaram a mesma tendÃncia de aumento de atividade apenas sob estresse salino. Diferentemente, manitol induziu um aumento proeminente na atividade de catalase nas plantas NT enquanto que nas APX1/2 essa enzima jà apresentava atividade aumentada antes do estresse e permaneceu no mesmo nÃvel. As concentraÃÃes de H2O2 foram aumentadas intensamente por manitol e reduzidas na presenÃa de NaCl. O nÃvel de TBARS (indicador de peroxidaÃÃo lipÃdica) foi mantido inalterado na presenÃa dos dois estresses e nos dois tipos de plantas. Os resultados deste estudo, quando analisados em conjunto, mostram que raÃzes de arroz expostas aos estresses salino e osmÃtico exibiram respostas complexas em termos de metabolismo redox. Aparentemente, as duas APXs citosÃlicas nÃo sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa, uma vez que as plantas mutantes apresentaram uma performance fisiolÃgica semelhante as plantas NT. As respostas aos dois fatores de estresse, NaCl e manitol, foram contrastantes nos dois genÃtipos, sugerindo que diferentes mecanismos de proteÃÃo antioxidante foram acionados para cada tipo de estresse. / Os estresses salino e osmÃtico sÃo responsÃveis por perdas significativas na produÃÃo agrÃcola, particularmente nas regiÃes semiÃridas. Nessas condiÃÃes, a raiz à o ÃrgÃo da planta que sofre os primeiros efeitos e à responsÃvel pela percepÃÃo e sinalizaÃÃo bioquÃmica dos estresses. Em folhas, as peroxidases do ascorbato do citosol sÃo as principais isoformas envolvidas com a proteÃÃo antioxidativa contra o excesso de H2O2 e sÃo tambÃm relacionadas na sinalizaÃÃo em condiÃÃes de estresses. Entretanto, esses mecanismos de aÃÃo em raÃzes sÃo pouco conhecidos. O objetivo deste estudo foi testar a hipÃtese de que as APXs citosÃlicas sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa de raÃzes de arroz expostas Ãs condiÃÃes de estresse salino e osmÃtico. Para isso, plantas transgÃnicas silenciadas nas duas isoformas de APXs citosÃlicas (APX1/2) e plantas nÃo transformadas (45 dias de idade) foram expostas a duas condiÃÃes de estresse: (1) NaCl e manitol em concentraÃÃes iso-osmÃticas (-0,62 MPa) durante oito dias e (2) manitol 268 mM (-0,62 MPa) por dois dias. Em plantas silenciadas, a quantidade de transcritos (RNAs) de OsAPX1 e OsAPX2 foi reduzida em 90% enquanto que a abundÃncia das duas proteÃnas mensurada por western blotting nÃo foi detectÃvel. A atividade total de APX foi diminuÃda em 66% em comparaÃÃo com as NTs na condiÃÃo controle, evidenciando que o silenciamento foi efetivo nas raÃzes. Como consequÃncia da deficiÃncia das APX1/2, o nÃvel de H2O2 foi aumentado em 51% comparado com as NTs. Ambos os estresses afetaram de modo similar o crescimento da raiz e parte aÃrea das APX1/2, em comparaÃÃo com as plantas nÃo transformadas (NT). Os valores de danos de membrana nas raÃzes foram aumentados na mesma intensidade nos dois genÃtipos e nos dois tipos de estresses, indicando que as APX1/2 apresentaram mesma sensibilidade aos estresses estudados. Nas plantas NT, as quantidades de transcritos de OsAPX1 e OsAPX2 foram aumentadas discretamente por NaCl e manitol enquanto que a atividade de APX foi aumentada somente pelo NaCl. As plantas APX1/2 mostraram a mesma tendÃncia das NTs quanto a expressÃo e atividade de APX. O aumento na quantidade relativa dos transcritos das outras isoformas de APX, principalmente de OsAPX3, OsAPX5 e OsAPX8, em ambos os genÃtipos sob estresse salino, foi correlacionado com o aumento da atividade da APX. AlÃm disso, outras peroxidases (GPX e GPOD) apresentaram a mesma tendÃncia de aumento de atividade apenas sob estresse salino. Diferentemente, manitol induziu um aumento proeminente na atividade de catalase nas plantas NT enquanto que nas APX1/2 essa enzima jà apresentava atividade aumentada antes do estresse e permaneceu no mesmo nÃvel. As concentraÃÃes de H2O2 foram aumentadas intensamente por manitol e reduzidas na presenÃa de NaCl. O nÃvel de TBARS (indicador de peroxidaÃÃo lipÃdica) foi mantido inalterado na presenÃa dos dois estresses e nos dois tipos de plantas. Os resultados deste estudo, quando analisados em conjunto, mostram que raÃzes de arroz expostas aos estresses salino e osmÃtico exibiram respostas complexas em termos de metabolismo redox. Aparentemente, as duas APXs citosÃlicas nÃo sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa, uma vez que as plantas mutantes apresentaram uma performance fisiolÃgica semelhante as plantas NT. As respostas aos dois fatores de estresse, NaCl e manitol, foram contrastantes nos dois genÃtipos, sugerindo que diferentes mecanismos de proteÃÃo antioxidante foram acionados para cada tipo de estresse. / Salt and osmotic stresses are responsible for significant losses in agriculture, particularly in semiarid regions. In such conditions, roots are the first plant organ in contact with the stress and are responsible for perception and signaling. In leaves, cytosolic ascorbate peroxidases (APX) are the main isoforms involved with antioxidative defence against H2O2 excess and signaling under stressful conditions. Nevertheless, such metabolic mechanisms in roots are still unknown. The aim of this study was to test the hypothesis that cytosolic APX isoforms are essential to antioxidant protection in rice roots exposed to salt and osmotic stresses. To test this hypothesis, rice mutants double silenced for cytosolic APXs (APX1/2) and non-transformed plants, both with 45 day-old, were submitted to two stressful treatments: (1) NaCl and mannitol in iso-osmotic concentrations (-0.62MPa) for eight days and (2) mannitol 268 mM (-0.62MPa) for two days. In mutant plants, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts (RNAs) were reduced by 90% whereas both protein abundance measured by Western blotting were not detectable. Under control conditions, total APX activity was reduced by 66% in comparison with NT plants, showing that the silencing was effective in roots. In APX1/2 roots, H2O2 level was increased by 51% as a consequence of APX1/2 silencing. Both stresses affected similarly root and shoot growing compared with NT. Membrane damage was increased at the same level in both genotypes and in both stresses, showing that APX1/2 were as sensible as NT plants. In NT roots, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts was slightly increased by NaCl and mannitol whereas only NaCl increased APX activity. Under salt stress, both genotypes increased other APX isoforms, especially OsAPX3, OsAPX5 and OsAPX8. These increases were correlated with the increased APX activity. In addition, other peroxidases (GPX and GPOD) displayed the same trend as APX, increasing their activity in response to NaCl. On the other hand, mannitol induced a prominent increase in catalase activity in NT plants, while in APX1/2 plants CAT activity did not changed. The H2O2 content was increased in both genotypes exposed to mannitol treatments, and was reduced for NaCl. TBARS level was not altered in the presence of both stresses for both genotypes. This study shows that rice plants exposed to salt or osmotic stresses display complex responses regarding to redox metabolism. Apparently, both cytosolic APXs are not essential to antioxidative protection, since mutant plants presented similar physiological performance to NT plants. The responses to both stresses, NaCl and mannitol, were contrasting for both genotypes, suggesting that different mechanisms of antioxidative protection were triggered for each different stress condition. / Salt and osmotic stresses are responsible for significant losses in agriculture, particularly in semiarid regions. In such conditions, roots are the first plant organ in contact with the stress and are responsible for perception and signaling. In leaves, cytosolic ascorbate peroxidases (APX) are the main isoforms involved with antioxidative defence against H2O2 excess and signaling under stressful conditions. Nevertheless, such metabolic mechanisms in roots are still unknown. The aim of this study was to test the hypothesis that cytosolic APX isoforms are essential to antioxidant protection in rice roots exposed to salt and osmotic stresses. To test this hypothesis, rice mutants double silenced for cytosolic APXs (APX1/2) and non-transformed plants, both with 45 day-old, were submitted to two stressful treatments: (1) NaCl and mannitol in iso-osmotic concentrations (-0.62MPa) for eight days and (2) mannitol 268 mM (-0.62MPa) for two days. In mutant plants, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts (RNAs) were reduced by 90% whereas both protein abundance measured by Western blotting were not detectable. Under control conditions, total APX activity was reduced by 66% in comparison with NT plants, showing that the silencing was effective in roots. In APX1/2 roots, H2O2 level was increased by 51% as a consequence of APX1/2 silencing. Both stresses affected similarly root and shoot growing compared with NT. Membrane damage was increased at the same level in both genotypes and in both stresses, showing that APX1/2 were as sensible as NT plants. In NT roots, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts was slightly increased by NaCl and mannitol whereas only NaCl increased APX activity. Under salt stress, both genotypes increased other APX isoforms, especially OsAPX3, OsAPX5 and OsAPX8. These increases were correlated with the increased APX activity. In addition, other peroxidases (GPX and GPOD) displayed the same trend as APX, increasing their activity in response to NaCl. On the other hand, mannitol induced a prominent increase in catalase activity in NT plants, while in APX1/2 plants CAT activity did not changed. The H2O2 content was increased in both genotypes exposed to mannitol treatments, and was reduced for NaCl. TBARS level was not altered in the presence of both stresses for both genotypes. This study shows that rice plants exposed to salt or osmotic stresses display complex responses regarding to redox metabolism. Apparently, both cytosolic APXs are not essential to antioxidative protection, since mutant plants presented similar physiological performance to NT plants. The responses to both stresses, NaCl and mannitol, were contrasting for both genotypes, suggesting that different mechanisms of antioxidative protection were triggered for each different stress condition.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 314133 bytes, checksum: 1d6a5d1c68ecfce7803cec5192e08e88 (MD5) Previous issue date: 2006-06-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Tolerance to salt stress was studied in maize seedlings (Zea mays L.) cultivars AGN 3150, BR 106, BR 201, BR 206 and SHS 4040, grown in Hoagland s nutrient solution. Treatments with NaCl 50 and 100 mM led to a decrease in the biomass production and to an increase in the relative electrolyte leakage in the roots and shoots in all cultivars. However, the largest decrease in growth and electrolyte leakage were shown by cultivar BR 106 and the smallest ones by cultivar AGN 3150, lead them to be considered as the most sensitive and the most tolerant to salt stress, respectively. The effect of NaCl 100 mM was investigated by considering some components of the antioxidative metabolism and mitochondrial respiration in roots of the seedlings. The tolerant cultivar showed increased activities of the enzymes superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APX) and glutathione redutase (GR), as well as increase in ascorbate/dehydroascorbate ratio. The sensitive cultivar showed reduction in catalases (CAT) and GR activities as well as in ascorbate/dehydroascorbate ratio. The lipid peroxidation degree increased in roots and isolated mitochondria, only in the sensitive cultivar. In mitochondria isolated from the tolerant cultivar, NaCl treatment promoted an increase in the state 4 respiration rate and in the alternative pathway capacity. Additionally, salinity promoted a decrease in ADP/O and respiratory control ratios, indicating a lower coupling, likely due to an increase in alternative oxidase (AOX) activity. In sensitive cultivar, total respiration activity and the ADP/O ratio were strongly decreased, however the capacity of the alternative pathway was not altered. The NaCl treatment promoted decrease in the uncoupling protein (UCP) activity in the tolerant cultivar, but an increase it in the sensitive one occurred. These results suggest that the tolerant cultivar exhibits a larger efficiency in the reactive oxygen intermediates scavenging, as compared to the sensitive one. In addition, the high tolerance of cultivar AGN 3150 to the salt stress could be related to its high AOX capacity. A possible contribution of the UCP could not be confirmed from the results observed. / A sensibilidade ao estresse salino foi avaliada em plântulas de milho (Zea mays L.) das cultivares AGN 3150, BR 106, BR 201, BR 206 e SHS 4040, cultivadas em solução nutritiva de Hoagland. Os tratamentos com 50 e 100 mM de NaCl reduziram a produção de biomassa e aumentaram o extravasamento relativo de eletrólitos nas raízes e nas partes aéreas de todas as cultivares estudadas. Porém, os maiores valores de redução no crescimento e de extravasamento de eletrólitos foram apresentados pela cultivar BR 106 e os menores valores observados na cultivar AGN 3150. Portanto, entre as cultivares avaliadas, estas duas foram consideradas, respectivamente, como a mais sensível e a mais tolerante ao estresse salino. Verificou-se, então, o efeito do tratamento com 100 mM de NaCl sobre alguns componentes do metabolismo antioxidativo e sobre a respiração mitocondrial nas raízes de plântulas dessas duas cultivares. A cultivar tolerante apresentou aumento nas atividades das enzimas dismutase do superóxido (SOD), peroxidase do ascorbato (APX) e redutase da glutationa (GR), bem como aumento na razão ascorbato/desidroascorbato. A cultivar sensível apresentou redução na atividade das catalases (CAT) e GR, e também da razão ascorbato/desidroascorbato. O grau de peroxidação de lipídeos aumentou nas raízes e nas mitocôndrias isoladas, apenas na cultivar sensível. Nas mitocôndrias isoladas da cultivar tolerante, o tratamento com NaCl resultou em aumento na taxa respiratória no estado 4 e na capacidade da rota alternativa. Além disso, houve redução nas razões ADP/O e de controle respiratório, indicando um menor grau de acoplamento, possivelmente resultante da maior atividade da oxidase alternativa (AOX) na cultivar tolerante. Na cultivar sensível, a atividade respiratória total e a razão ADP/O foram fortemente reduzidas, porém a participação percentual da rota alternativa não foi alterada. O tratamento com NaCl resultou em redução na atividade da proteína desacopladora (UCP) na cultivar tolerante e em aumento desta atividade na cultivar sensível. Pelos dados obtidos, a maior tolerância da cultivar AGN 3150 está relacionada à sua maior eficiência na remoção de intermediários reativos de oxigênio, além da maior possibilidade de desvio de elétrons pela sua rota alternativa na cadeia respiratória. Entretanto, a contribuição da UCP nos mecanismos de tolerância à salinidade dessa cultivar não foi evidenciada.