Submitted by RODOLFO DOS SANTOS CARRIJO null (rodolfo_carrijo@hotmail.com) on 2018-03-11T15:22:02Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Rodolfo dos Santos Carrijo.pdf: 2813521 bytes, checksum: fa8e9b21bc15dbfbb018be6a2c56a5e9 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2018-03-13T17:53:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carrijo_rs_me_araiq.pdf: 2778305 bytes, checksum: 00ef39cdf6ae435c0ced83a90aa10053 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-13T17:53:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carrijo_rs_me_araiq.pdf: 2778305 bytes, checksum: 00ef39cdf6ae435c0ced83a90aa10053 (MD5) Previous issue date: 2018-03-05 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Sistemas toxina-antitoxina (TA) são tipicamente formados por dois genes que codificam uma toxina estável e uma antitoxina lábil. Esses módulos genéticos são diversos e abundantes em procariotos, sendo agrupados em seis tipos (I à VI) com base na natureza da antitoxina e no seu modo de interação com a toxina. O sistema TA GhoT/GhoS (tipo V) foi identificado em Escherichia coli, estando implicado no fenômeno de persistência celular (tolerância temporária à antibióticos). Embora a antitoxina desse sistema (GhoS) tenha sido bem caracterizada, os detalhes que envolvem a estrutura e os mecanismos de ação da toxina GhoT ainda não foram totalmente esclarecidos, sendo apenas demonstrado que a molécula in vivo ocasiona a formação de poros na membrana plasmática bacteriana, interrompendo a produção de ATP. Dessa maneira, considerando o potencial biotecnológico dos sistemas TA como alvos para o desenho de novos bactericidas, o presente trabalho caracterizou funcional e estruturalmente a proteína GhoT de Salmonella enterica e peptídeos derivados com capacidade de interação com membranas biológicas. Para isso, após a obtenção da sequência de aminoácidos da GhoT de S. enterica por BLAST e de sua predição estrutural in silico, a proteína e seus derivados (HN e HC) foram sintetizados pelo método químico em fase sólida, sendo purificados por cromatografia líquida de alta eficiência e identificados por espectrometria de massas. Em seguida, a capacidade de estruturação das moléculas foi avaliada com o auxílio da espectroscopia de dicroísmo circular. Já as suas funções foram investigadas através de ensaios de permeabilização de vesículas lipídicas, expressão heteróloga em bactéria e atividade antimicrobiana. Coletivamente, os estudos demonstraram que os polipeptídeos estão predominantemente enovelados em α-hélice, confirmando a modelagem estrutural realizada. Além disso, constatou-se que as moléculas conservam a mesma atividade lítica verificada para a toxina GhoT de E. coli, destacando-se o peptídeo HN. Ademais, os polipeptídeos foram tóxicos para bactérias tanto intracelularmente (quando expressos heterologamente) quanto extracelularmente (quando adicionados ao meio de cultura). Assim, além de apontar uma possível relação entre o produto do gene ghoT de S. enterica e a formação de células persistentes no gênero Salmonella, os resultados alcançados exibem o potencial uso das moléculas como modelos para o desenvolvimento de novos antibióticos. / Toxin-antitoxin (TA) systems are typically formed by two genes encoding a stable toxin and a labile antitoxin. These genetic modules are diverse and abundant in prokaryotes and are grouped into six types (I to VI) based on the nature of the antitoxin and its mode of interaction with the toxin. The TA GhoT/GhoS system (type V) was identified in Escherichia coli, being implicated in the phenomenon of cell persistence (temporary tolerance to antibiotics). Although the antitoxin of this system (GhoS) has been well characterized, the details surrounding the structure and mechanisms of action of the GhoT toxin have not yet been fully elucidated, and it has only been shown that the molecule in vivo causes the formation of pores in the bacterial plasma membrane, disrupting the production of ATP. In this way, taking into account the biotechnological potential of TA systems as targets for the design of new bactericides, the present work characterized the GhoT protein of Salmonella enterica and derived peptides with interaction capacity with biological membranes. After obtaining the amino acid sequence of S. enterica GhoT by BLAST and its in silico structural prediction, the protein and analogues (HN and HC) were synthesized by the solid phase chemical method and were isolated by high performance liquid chromatography and identified by means of mass spectrometry. Then, the conformations of the molecules were evaluated with the help of circular dichroism (CD) spectroscopy. Its functions were investigated through lipid vesicle permeabilization assays, heterologous expression in bacteria and antimicrobial activity. Thus, collectively, the information revealed by the studies demonstrated that the polypeptides are predominantly anchored in α-helix, confirming the structural modeling performed. In addition, it was observed that the molecules retain the same lytic activity verified for the E. coli GhoT toxin, especially the HN peptide. In addition, polypeptides were toxic to bacteria both intracellularly (when expressed heterologously) and extracellularly (when added to the culture medium). Therefore, in addition to pointing out a possible relationship between the product of the S. enterica ghoT gene and the formation of persistent cells in the Salmonella genus, the results show the potential use of the molecules as models for the development of new antibiotics. / CNPq: 131219/2016-2

Uma abordagem promissora para a obtenção de coquetéis enzimáticos eficientes para a etapa de hidrólise na produção de etanol de 2ª geração é o enriquecimento em termos de atividades que lhes faltam, mas podem ser obtidas através de sistemas heterólogos. O trabalho teve como objetivo avaliar o sistema toxina -antitoxina (TA) para estabilização plasmidial em E. coli na produção de expansina e endoglucanase recombinantes. Os resultados indicaram que o sistema de expressão com estabilização TA é tão eficaz quanto o dependente de antibiótico para estabilização plasmidial. Além disso, mostrou-se mais eficiente pelo fato de não permitir a sobrevivência de células sem o plasmídeo. Estudos indicaram a quantidade mínima de 0,05mM de IPTG para expressão das proteínas nesta linhagem, cerca de 20 vezes menos que a concentração usualmente aplicada no momento da indução. Sendo assim, o sistema de estabilização plasmidial TA mostrou-se uma ótima ferramenta para o desenvolvimento de uma plataforma alternativa para a produção de proteínas recombinantes. / A promising approach to obtain efficient enzyme cocktails for the hydrolysis step in the production of 2nd generation ethanol is the enrichment in terms of activities that are lacking, but can be obtained by heterologous systems. The study aimed to evaluate the toxina-antitoxin (TA) system for plasmid stabilization in E. coli in the production of recombinant expansin and endoglucanase. The results indicated that the expression system with TA stabilization is as effective as the antibiotic dependent for plasmid stabilization. Moreover, it proved to be more efficient by not allo wing the survival of cells without the plasmid. Studies have indicated the minimum amount of 0.05 mM IPTG for expression of proteins in this strain, about 20 times less than the concentration usually applied for induction. Thus, the plasmid stabilization TA system proved to be a great tool for the development of an alternative platform for producing recombinant proteins.

Uma abordagem promissora para a obtenção de coquetéis enzimáticos eficientes para a etapa de hidrólise na produção de etanol de 2ª geração é o enriquecimento em termos de atividades que lhes faltam, mas podem ser obtidas através de sistemas heterólogos. O trabalho teve como objetivo avaliar o sistema toxina -antitoxina (TA) para estabilização plasmidial em E. coli na produção de expansina e endoglucanase recombinantes. Os resultados indicaram que o sistema de expressão com estabilização TA é tão eficaz quanto o dependente de antibiótico para estabilização plasmidial. Além disso, mostrou-se mais eficiente pelo fato de não permitir a sobrevivência de células sem o plasmídeo. Estudos indicaram a quantidade mínima de 0,05mM de IPTG para expressão das proteínas nesta linhagem, cerca de 20 vezes menos que a concentração usualmente aplicada no momento da indução. Sendo assim, o sistema de estabilização plasmidial TA mostrou-se uma ótima ferramenta para o desenvolvimento de uma plataforma alternativa para a produção de proteínas recombinantes. / A promising approach to obtain efficient enzyme cocktails for the hydrolysis step in the production of 2nd generation ethanol is the enrichment in terms of activities that are lacking, but can be obtained by heterologous systems. The study aimed to evaluate the toxina-antitoxin (TA) system for plasmid stabilization in E. coli in the production of recombinant expansin and endoglucanase. The results indicated that the expression system with TA stabilization is as effective as the antibiotic dependent for plasmid stabilization. Moreover, it proved to be more efficient by not allo wing the survival of cells without the plasmid. Studies have indicated the minimum amount of 0.05 mM IPTG for expression of proteins in this strain, about 20 times less than the concentration usually applied for induction. Thus, the plasmid stabilization TA system proved to be a great tool for the development of an alternative platform for producing recombinant proteins.

Dados sorológicos sobre doenças imunopreveníveis são úteis para avaliar o sucesso de programas de imunização e a identificação de populações suscetíveis. Nos últimos 20 anos, as campanhas de imunização na infância foram eficientes no controle da difteria em muitos países. No entanto, uma taxa importante da população adulta continua suscetível à doença, uma vez que os níveis de anticorpos protetores reduzem com o passar do tempo. A infecção pelo HIV-1 leva a uma perda progressiva das funções imunes. Com o aumento da expectativa de vida dos pacientes HIV-1, e a maior incidência de infecções, torna-se importante a avaliação dos níveis de anticorpos antitoxina diftérica nestes grupos. O objetivo deste estudo foi avaliar os níveis de anticorpos antitoxina diftérica e a contagem de linfócitos T (LT) em indivíduos infectados ou não pelo HIV -1, assistidos no Instituto de Biologia do Exército (IBEx). Investigamos a correlação entre níveis de anticorpos específicos e os seguintes parâmetros dos grupos de estudo: sexo, faixa etária, categoria militar ou civil; vacinação prévia contra difteria; número de LT CD4+ e CD8+; e entre os indivíduos HIV-1 positivos a correlação com a carga viral e a terapia com antirretrovirais potentes (HAART). Para a quantificação de anticorpos antitoxina diftérica utilizou-se um kit ELISA (IBL Immuno-Biological Laboratories, Hamburg, Alemanha) e amostras de sangue de 180 indivíduos, sendo que 75 eram doadores de sangue e 105 eram pacientes positivos para o HIV-1. Aproximadamente 60% dos indivíduos estavam parcialmente protegidos contra a difteria (IgG específica &#8805; 0,1 < 1,0 UI/mL). Entre os doadores de sangue, 56% dos indivíduos estavam protegidos (IgG específica &#8805; 1,0 UI/mL) contra a doença, contra apenas 29 % dos indivíduos positivos para HIV-1. Em relação aos doadores de sangues de origem civil não se observou correlação entre os níveis de IgG e a idade, enquanto que, para os militares observou-se uma correlação inversa. Não houve diferença significativa na resposta de anticorpos para difteria entre os indivíduos soropositivos com CD4+ baixo ou normal. Pacientes com HAART mostraram uma resposta significativamente mais baixa de anticorpos (média geométrica de 0.39 IU/mL, n = 84) do que os pacientes não tratados (média geométrica de 0.58 IU/mL, n = 19). A diferença na idade média dos pacientes não tratados (46 anos) e tratados com HAART (35 anos) provavelmente influenciou estes resultados, já que os níveis de anticorpos contra a difteria declinam com o tempo. A existência em nossa comunidade de adultos (militares e civis) suscetíveis à difteria, incluindo os indivíduos soropositivos, reforça que a imunização a cada 10 anos e os estudos soroepidemiológicos são muito importantes e devem ser estimulados. / Serologic data on diseases that are preventable by vaccine are useful to evaluate the success of immunization programs and to identify susceptible subgroups. In the last 20 years the childhood immunization program has been efficient in the control of the diphtheria in many countries. However, an important rate of adult population remains susceptible to the illness, since diphtheria protective antibodies decline with time. HIV-1 infection leads to a progressive loss of immune functions. With the increase of life expectancy of HIV-1 patients, and also the increment of infections, it is important to known the antibody levels to diphtheria toxin in these population. The aim of this study was to evaluate the IgG levels to diphtheria toxin and T lymphocytes (LT) counts in HIV-1 infected and non- infected individuals assisted at the Instituto de Biologia do Exército (IBEx), Rio de Janeiro. We investigated the correlation between specific antibody levels and the following parameters of the study groups: gender, age-group, military or civilian origin, previous diphtheria immunization, CD4+ and CD8+ counts. For HIV-1 patients, we also analysed the correlation of specific antibodies with viral load and the use of highly active antiretroviral therapy HAART. A commercial diphtheria-ELISA kit (IBL Immuno-Biological Laboratories, Hamburg, Alemanha) was used to evaluate IgG levels in serum samples of 180 individuals. Blood donors accounted for 75 individuals and 105 subjects were HIV-1 patients. About 60% of individuals were partially protected against diphtheria (specific IgG levels &#8805; 0,1 < 1,0 IU/mL). About 56% of blood donors were protected against diphtheria (specific IgG > 1.0 IU/mL). Howerver, only 29% of HIV-1 patients showed the same level of protective antibodies. For the civilian blood donors, there were no correlation between specific antibody levels and age group. In contrast, a negative correlation was observed in the military group. There were no differences in diphtheria serology according to CD4+ counts of HIV-1 patients or blood donors. Interesting, HAART- treated (n = 84) patients showed a significantly lower antibody response (geomean of 0.39 IU/mL) than untreated patients (geomean of 0.58 IU/mL, n = 19). As tetanus and diphtheria antibodies tend to decrease with time, the difference in age between HAART-treated patients (mean of 46 years) and those not being treated (mean of 35 years) might introduce a bias in the study. Concluding, the existence of susceptible military and civilian adults in our community, including HIV-1 patients, reinforce that reliable seroepidemiological data and immunization campaigns should be routinely stimulated.

Dados sorológicos sobre doenças imunopreveníveis são úteis para avaliar o sucesso de programas de imunização e a identificação de populações suscetíveis. Nos últimos 20 anos, as campanhas de imunização na infância foram eficientes no controle da difteria em muitos países. No entanto, uma taxa importante da população adulta continua suscetível à doença, uma vez que os níveis de anticorpos protetores reduzem com o passar do tempo. A infecção pelo HIV-1 leva a uma perda progressiva das funções imunes. Com o aumento da expectativa de vida dos pacientes HIV-1, e a maior incidência de infecções, torna-se importante a avaliação dos níveis de anticorpos antitoxina diftérica nestes grupos. O objetivo deste estudo foi avaliar os níveis de anticorpos antitoxina diftérica e a contagem de linfócitos T (LT) em indivíduos infectados ou não pelo HIV -1, assistidos no Instituto de Biologia do Exército (IBEx). Investigamos a correlação entre níveis de anticorpos específicos e os seguintes parâmetros dos grupos de estudo: sexo, faixa etária, categoria militar ou civil; vacinação prévia contra difteria; número de LT CD4+ e CD8+; e entre os indivíduos HIV-1 positivos a correlação com a carga viral e a terapia com antirretrovirais potentes (HAART). Para a quantificação de anticorpos antitoxina diftérica utilizou-se um kit ELISA (IBL Immuno-Biological Laboratories, Hamburg, Alemanha) e amostras de sangue de 180 indivíduos, sendo que 75 eram doadores de sangue e 105 eram pacientes positivos para o HIV-1. Aproximadamente 60% dos indivíduos estavam parcialmente protegidos contra a difteria (IgG específica &#8805; 0,1 < 1,0 UI/mL). Entre os doadores de sangue, 56% dos indivíduos estavam protegidos (IgG específica &#8805; 1,0 UI/mL) contra a doença, contra apenas 29 % dos indivíduos positivos para HIV-1. Em relação aos doadores de sangues de origem civil não se observou correlação entre os níveis de IgG e a idade, enquanto que, para os militares observou-se uma correlação inversa. Não houve diferença significativa na resposta de anticorpos para difteria entre os indivíduos soropositivos com CD4+ baixo ou normal. Pacientes com HAART mostraram uma resposta significativamente mais baixa de anticorpos (média geométrica de 0.39 IU/mL, n = 84) do que os pacientes não tratados (média geométrica de 0.58 IU/mL, n = 19). A diferença na idade média dos pacientes não tratados (46 anos) e tratados com HAART (35 anos) provavelmente influenciou estes resultados, já que os níveis de anticorpos contra a difteria declinam com o tempo. A existência em nossa comunidade de adultos (militares e civis) suscetíveis à difteria, incluindo os indivíduos soropositivos, reforça que a imunização a cada 10 anos e os estudos soroepidemiológicos são muito importantes e devem ser estimulados. / Serologic data on diseases that are preventable by vaccine are useful to evaluate the success of immunization programs and to identify susceptible subgroups. In the last 20 years the childhood immunization program has been efficient in the control of the diphtheria in many countries. However, an important rate of adult population remains susceptible to the illness, since diphtheria protective antibodies decline with time. HIV-1 infection leads to a progressive loss of immune functions. With the increase of life expectancy of HIV-1 patients, and also the increment of infections, it is important to known the antibody levels to diphtheria toxin in these population. The aim of this study was to evaluate the IgG levels to diphtheria toxin and T lymphocytes (LT) counts in HIV-1 infected and non- infected individuals assisted at the Instituto de Biologia do Exército (IBEx), Rio de Janeiro. We investigated the correlation between specific antibody levels and the following parameters of the study groups: gender, age-group, military or civilian origin, previous diphtheria immunization, CD4+ and CD8+ counts. For HIV-1 patients, we also analysed the correlation of specific antibodies with viral load and the use of highly active antiretroviral therapy HAART. A commercial diphtheria-ELISA kit (IBL Immuno-Biological Laboratories, Hamburg, Alemanha) was used to evaluate IgG levels in serum samples of 180 individuals. Blood donors accounted for 75 individuals and 105 subjects were HIV-1 patients. About 60% of individuals were partially protected against diphtheria (specific IgG levels &#8805; 0,1 < 1,0 IU/mL). About 56% of blood donors were protected against diphtheria (specific IgG > 1.0 IU/mL). Howerver, only 29% of HIV-1 patients showed the same level of protective antibodies. For the civilian blood donors, there were no correlation between specific antibody levels and age group. In contrast, a negative correlation was observed in the military group. There were no differences in diphtheria serology according to CD4+ counts of HIV-1 patients or blood donors. Interesting, HAART- treated (n = 84) patients showed a significantly lower antibody response (geomean of 0.39 IU/mL) than untreated patients (geomean of 0.58 IU/mL, n = 19). As tetanus and diphtheria antibodies tend to decrease with time, the difference in age between HAART-treated patients (mean of 46 years) and those not being treated (mean of 35 years) might introduce a bias in the study. Concluding, the existence of susceptible military and civilian adults in our community, including HIV-1 patients, reinforce that reliable seroepidemiological data and immunization campaigns should be routinely stimulated.