Les systèmes toxine-antitoxine sont divisés en trois classes suivant la nature et le mode d’action de l’antitoxine. Ils sont fortement représentés au sein du règne bactérien et se trouvent sur des éléments génétiques mobiles qu’ils stabilisent dans la population bactérienne, mais aussi sur les chromosomes bactériens où leur fonction n’a pas encore été établie avec certitude. Au cours de ce travail, nous avons étudié les systèmes toxine-antitoxine bactériens de classe II, qui sont généralement composés de deux gènes organisés en opéron. Le premier gène code pour une antitoxine qui antagonise l’activité de la toxine, le produit du second gène. L’antitoxine, en complexe avec la toxine, est également capable de réguler l’expression de l’opéron en se fixant au promoteur de l’opéron. Lors du commencement de cette étude, les systèmes toxine-antitoxine étaient divisés en 10 familles sur base des similarités de séquences partagées par les toxines. A chaque famille de toxine était associée une famille d’antitoxine. <p>\ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les systèmes toxine-antitoxine (TA) sont composés de deux gènes organisés en opéron retrouvés chez la quasi-totalité des bactéries ainsi que chez les archées. Ils ont été découverts sur des plasmides, où ils induisent une tuerie post-segregationnelle (PSK). En effet, l’antitoxine est instable car elle est dégradée par une protéase ATP dépendante. Lors de la réplication, si un plasmide portant un système TA n’est pas transmis à la cellule fille, celle-ci recevra tout de même une partie du cytoplasme de la cellule mère qui contenait des protéines de toxine et d’antitoxine. Cette dernière étant instable, et sans synthèse de novo, la toxine va se retrouver libre d’affecter sa cible cellulaire. Un système TA crée donc une addiction au plasmide qui le porte, stabilisant celui-ci.<p>Les systèmes TA se retrouvent également, dans un nombre de copies variable, au sein du chromosome. Dans ce cas, plusieurs hypothèses existent quant à leur fonction, comme la mort cellulaire programmée, la réponse au stress, la stabilisation de régions génomiques non essentielles, ou l’anti-addiction au plasmide.<p>L’origine et l’évolution des systèmes TA restent inconnues, alors qu’ils présentent des aspects intrigants. En effet, les toxines CcdB et MazF ont des séquences et des activités toxiques très différentes, malgré une structure proche ;les toxines RelE et ParE présentent des séquences proches, mais des fonctions différentes. À l’heure actuelle, les deux hypothèses concernant l’origine évolutive des systèmes TA sont soit qu’ils seraient tous issus d’un ancêtre commun, soit qu’ils auraient été réinventés plusieurs fois au cours de l’évolution, à partir d’un nombre limité de gènes.<p>Au cours de cette thèse, nous avons abordé la question de l’origine et l’évolution des systèmes TA de plusieurs manières :par la reconstruction de phylogénies et de séquences ancestrales, et par l’étude d’un système chromosomique particulier au sein de nombreuses souches d’Escherichia coli. Enfin, nous nous avons décidé d’analyser le contexte génomique des systèmes TA chromosomiques. Ces travaux ont notamment permis de mieux comprendre l’évolution des systèmes TA, et de conforter l’hypothèse selon laquelle ils seraient des éléments égoïstes, évoluant au sein des génomes sans gain d’aptitude pour l’hôte.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les systèmes toxine-antitoxine (TA) sont très répandus au sein des génomes bactériens. Ces opérons bicistroniques de petite taille ont été découverts sur des plasmides à bas nombre de copies. Dans ce contexte génétique, les systèmes TA confèrent un avantage sélectif à leurs molécules-hôtes en tuant les bactéries-filles qui ne les ont pas héritées par le mécanisme de tuerie post-ségrégationnelle (PSK, post-segregational killing). Ces systèmes génétiques sont également appelés modules d’addiction étant donné qu’ils rendent la descendance des bactéries qui les contiennent dépendantes de leur présence. Alors que leur rôle dans les molécules d’ADN épisomiques est relativement bien établi, le sens biologique de la présence d’homologues à ces systèmes épisomiques au sein des chromosomes bactériens est sujet à d’intenses débats. L’idée que les systèmes TA chromosomiques confèrent un avantage sélectif a été mise en évidence dans plusieurs modèles. Selon ces modèles, les systèmes TA permettent aux bactéries de mieux faire face à des conditions environnementales stressantes. <p>Entre-temps, la compréhension de l’évolution des génomes bactériens a connu des avancées significatives. L’impressionnante capacité d’adaptation des bactéries est aujourd’hui majoritairement attribuée au transfert horizontal de gènes (THG) provoqué par les éléments génétiques mobiles (phages, plasmides, transposons…). Dans le débat du rôle des systèmes TA chromosomiques, très peu d’attention a été accordée aux relations phylogénétiques et interactions entre systèmes plasmidiques et chromosomiques co-existant au sein d’un même hôte ainsi qu’à l’impact du THG sur leur évolution. Notre travail de thèse vise à mieux comprendre la biologie des systèmes TA en tenant compte de ces paramètres. Nous nous sommes intéressés à des systèmes homologues au système plasmidique ccdF. Nous avons étudié expérimentalement les 4 systèmes ccd (ccd1, ccd2, ccd3 et ccd4) qui co-habitent au sein du chromosome d’Erwinia chrysanthemi 3937 (une bactérie phytopathogène), leurs interactions intragénomiques et les interactions de ces systèmes avec le système plasmidique ccdF. Ce cadre expérimental a mené à la construction du modèle d’anti-addiction. Ce modèle propose que certains systèmes chromosomiques puissent conférer un avantage sélectif à leurs hôtes bactériens en interférant avec le PSK médié par leurs homologues plasmidiques. Cet avantage sélectif pourrait permettre la fixation de systèmes TA latéralement acquis au sein des populations bactériennes. Nous avons également recherché de nouveaux systèmes ccd au sein des génomes bactériens afin d’avoir un aperçu de leur distribution, des contextes génétiques dans lesquels ils existent et de l’implication du THG dans leur dispersion. Les réflexions qui ont accompagné notre recherche nous ont mené à proposer une synthèse sur le rôle des systèmes TA (plasmidiques et chromosomiques). Celle-ci se nourrit des avancées qui ont été effectuées, ces dernières années, dans la compréhension de l’évolution des génomes bactériens, de la théorie hiérarchique de la sélection naturelle et des processus non-adaptatifs et contingents qui pourraient expliquer la présence et la propagation des systèmes TA au sein des génomes bactériens sans que ceux-ci en soient les agents causaux. <p><p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les systèmes toxine-antitoxine (TA) bactériens ont été découverts il y a une vingtaine d’année sur les plasmides à bas nombre de copie. Ils sont composés de deux gènes organisés en opéron, l’un codant pour une toxine stable et l’autre pour une antitoxine instable capable de neutraliser l’effet de la toxine. Les systèmes TA sont fortement représentés au sein de l’ensemble des génomes bactériens. Ils se localisent aussi bien sur des éléments génétiques mobiles (plasmides, phages, transposons,…) que dans les chromosomes, ce qui suggère que le transfert horizontal de gènes participe à leur dissémination. Le système TA ccd du plasmide F d’Escherichia coli (ccdF) est composé de l’antitoxine CcdA et de la toxine CcdB. Le système ccdF contribue à la stabilité du plasmide F en tuant les bactéries-filles n’ayant pas reçu de copies plasmidiques lors de la division bactérienne (tuerie post-ségrégationelle).<p>Au cours de ce travail, nous avons caractérisé un homologue du système toxine-antitoxine ccd du plasmide F (ccdF) qui se situe dans le chromosome de la souche pathogène E. coli O157:H7 EDL933 entre les gènes folA et apaH (ccdO157). Les systèmes ccdF et ccdO157 coexistent naturellement dans les souches d’E. coli O157:H7, le système ccdF se trouvant sur le plasmide pO157 qui dérive du plasmide F. Nos résultats montrent que l’antitoxine plasmidique CcdAF neutralise l’effet de la toxine chromosomique CcdBO157, tandis que l’antitoxine chromosomique CcdAO157 ne contrecarre pas la toxicité de la toxine plasmidique CcdBF. Nous avons également montré que le système ccdF cause une tuerie post-ségrégationelle, lorsqu’il est cloné dans un plasmide instable, dans une souche possédant le système chromosomique ccdO157. Le système ccdF est donc fonctionnel en présence de son homologue chromosomique. <p>Le système ccdO157 est absent du chromosome de la souche de laboratoire E. coli K-12 MG1655, où une région intergénique de 77 pb sépare les gènes folA et apaH. Celle-ci contient une séquence cible pour la transposition. Nous avons étudié la distribution du système ccdO157 au sein de 523 souches d’E. coli représentatives de l’ensemble des sérogroupes décrits. Nos résultats montrent que le système ccdO157 est présent au sein de souches appartenant à 47 sérogroupes différents. Nos résultats mettent en évidence la diversité de la région intergénique folA-apaH d’E. coli. Celle-ci peut contenir gènes codant pour des protéines présentant de l’homologie avec des protéines d’espèce bactériennes éloignées d’E. coli ou d’organismes eucaryotes, ainsi qu’un élément génétique mobile, l’IS621, ce qui montre que le système ccdO157 a intégré le chromosome d’E. coli via le transfert horizontal de gènes.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les systèmes toxine-antitoxines (TA) sont abondants dans la majorité des génomes bactériens séquencés à ce jour. Ces systèmes codent une toxine stable qui inhibe soit la transcription, soit la traduction, et une antitoxine qui contrecarre l’effet de la toxine par formation d’un complexe avec celle-ci. L’antitoxine est instable suite à sa dégradation continue par les protéases ATP-dépendantes. Afin de maintenir un ratio antitoxine :toxine constant en condition normale de croissance, l’expression des systèmes TA est régulée négativement au niveau transcriptionnel par le complexe toxine-antitoxine.<p><p>Au début de notre travail, cinq systèmes TA étaient identifiés dans le chromosome d’E. coli. Il avait été montré par notre laboratoire que parmi ces systèmes, seul yefM-yoeB était activé en condition de surproduction de la protéase ATP-dépendante Lon. Ce résultat était surprenant puisque Lon était connue pour dégrader également l’antitoxine RelB du système chromosomique relBE. Un des objectifs de notre travail était de comprendre les mécanismes sous-jacents à cette spécificité. Nous avons montré que l’antitoxine YefM était dégradée à la fois par Lon et les protéases ClpAP et ClpXP. Nous avons également montré qu’en condition de surproduction de Lon, YefM était fortement instable (t1/2~ 10 min. vs 60 min en condition normale). Cette instabilité accrue permet donc l’activation du système yefM-yoeB, c’est-à-dire la libération de la toxine YoeB du complexe qu’elle forme avec YefM. Nous avons également avons montré que le t1/2 de RelB n’était pas affecté par la surproduction de Lon, ce qui explique pourquoi le système relBE n’est pas activé dans ces conditions. Notre hypothèse était qu’un cofacteur soit nécessaire à la dégradation de RelB par Lon et que celui-ci serait limitant dans nos conditions expérimentales. Le crible génétique que nous avons réalisé n’a cependant pas permis d’identifier de cofacteur de dégradation ni de régulateur transcriptionnel en trans du système relBE. <p><p>Un deuxième volet de notre travail de thèse a consisté en l’étude de la fonction des systèmes TA chromosomiques. L’hypothèse prévalente au début de notre travail était que les systèmes TA soient intégrés dans les voies adaptatives de réponses au stress. Cependant, le résultat de leur activation était controversé. L’hypothèse du groupe de Gerdes était que leur activation mène à un état bactériostatique réversible alors que le groupe d’Engelberg-Kulka montrait que le système mazEF était un système de mort programmée. Afin d’éclaircir le rôle des cinq systèmes TA dans la physiologie d’E. coli, nous avons testé l’effet de nombreux stress sur la croissance et la viabilité de souches sauvages et de souches délétées de ces systèmes. Aucune des conditions que nous avons testées n’a entraîné une diminution de la viabilité excluant de manière définitive l’hypothèse de la mort programmée. De plus, l’inhibition de croissance causée par ces différents stress s’est avérée être indépendante des cinq systèmes, de même que la phase de récupération suivant les différents stress. Enfin, nos expériences de compétition ont clairement démontré que les cinq systèmes ne procuraient aucun avantage sélectif aux bactéries dans des conditions de compétition en carence nutritive. Les systèmes TA étudiés dans ce travail ne jouent donc aucun rôle dans l’adaptation aux stress que nous avons testé puisqu’ils n’améliorent ni l’aptitude (fitness), ni la compétitivité des bactéries dans ces conditions. <p><p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

CsrA is a global regulator and the main player of the carbon storage regulator (Csr) network, a well- conserved regulatory network in the bacterial world. CsrA is involved in regulation of many physiological processes, including pathways of central carbon metabolism, biofilm formation, motility and virulence in pathogenic species. CsrA acts at the post-transcriptional level by binding specific sequences on its target mRNAs, leading to mRNA destabilization or stabilization. The majority of studies were analyzing a csrA mutant of E. coli K-12 encoding a truncated form of the CsrA protein, retaining residual activity.<p>This work aims at further characterize the roles of CsrA by deleting the entire csrA gene in a recently isolated strain, the uropathogenic E. coli CFT073 strain. Deletion of csrA leads to a marked growth defect, indicating that this gene, although not essential, is primordial for growth. We performed experimental evolution of csrA deletion mutants. Compensatory mutants totally outcompete the original csrA deletion mutant after six days of culture, indicating that the applied selective pressures are strong. The ÄcsrA and three ÄcsrA evolved mutants were extensively analyzed by combining molecular techniques such as genetics, microscopy and use of fluorescent reporters, and global approaches, including comparative proteomics and whole genome sequencing.<p>Our data indicate that csrA deletion strongly affects central metabolism and energy status, constituting an endogenous metabolic stress that, in turn, induces specific stress responses. This work illustrates the interconnection of multiple regulation networks for responding to specific conditions and demonstrates the flexibility of metabolic network to compensate for genetic perturbations in E. coli.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Em procariotos, RNAs antisense (asRNAs) constituem a classe de RNAs não codificantes (ncRNAs) mais numerosa detectada por métodos de avaliação de transcritoma em larga escala. Apesar da grande abundância, pouco se sabe sobre mecanismos regulatórios e aspectos da conservação evolutiva dessas moléculas, principalmente em arquéias, onde o mecanismo de degradação de RNAs dupla fita (dsRNAs) é um fenômeno pouco conhecido. No presente estudo, utilizando dados de dRNA-seq, identificamos 1626 inícios de transcrição primários antisense (aTSSs) no genoma de Halobacterium salinarum NRC-1, importante organismo modelo para estudos de regulação gênica no domínio Archaea. Integrando dados de expressão gênica obtidos a partir de 18 bibliotecas de RNA-seq paired-end, anotamos 846 asRNAs a partir dos aTSSs mapeados. Encontramos asRNAs em ~21% dos genes anotados, alguns desses relacionados a importantes características desse organismo como: codificadores de proteínas que constituem vesículas de gás e da proteína bacteriorodopsina, além de vários genes relacionados a maquinaria de tradução e transposases. Além desses, encontramos asRNAs em genes pertencentes a sistemas de toxinas-antitoxinas do tipo II e utilizando dados públicos de dRNA-seq, evidenciamos que esse é um fenômeno que ocorre em bactérias e arquéias. A interação de um ncRNA com seu RNA alvo pode ser dependente de proteínas, em arquéias, a proteína LSm é uma chaperona de RNA homóloga a Hfq de bactérias, implicada no controle pós-transcricional. Utilizamos dados de RIP-seq de RNAs imunoprecipitados com LSm e identificamos 91 asRNAs interagindo com essa proteína, para 81 desses, o mRNA do gene sense também foi encontrado interagindo. Buscando por aTSSs presentes nas mesmas regiões de genes ortólogos, identificamos 160 aTSSs que dão origem a asRNAs em H. salinarum possivelmente conservados em Haloferax volcanii. A expressão dos asRNAs anotados foi avaliada ao longo de uma curva de crescimento e em uma linhagem knockout de um gene que codifica uma RNase R, possível degradadora de dsRNAs em arquéias. Encontramos um total de 144 asRNAs diferencialmente expressos ao longo da curva de crescimento, para 56 desses o gene sense também está diferencialmente expresso, caracterizando possíveis mecanismos de regulação em cis por esses RNAs. Na linhagem knockout, encontramos cinco asRNAs diferencialmente expressos e apenas para um desses o gene sense também está diferencialmente expresso, resultado que não nos permitiu inferir um possível papel de degradação de dsRNAs da RNAse R em H. salinarum NRC-1. Nesse trabalho apresentamos um mapeamento completo do transcritoma antisense primário de H. salinarum NRC-1 com resultados que consistem em um importante passo na direção da compreensão do envolvimento da transcrição antisense na regulação gênica pós-transcricional desse organismo modelo do terceiro domínio da vida. / Antisense RNAs (asRNAs) constitute the most numerous class of non-coding RNAs (ncRNAs) detected by transcriptome highthroughput methods in prokaryotes. Despite this abundance, little is known about regulatory mechanisms and evolutionary aspects of these molecules, mainly in archaea, where the mechanism of double-strand RNA (dsRNA) degradation remains poorly understood. In this study, using dRNA-seq data, we identified 1626 antisense transcription start sites (aTSSs) in the genome of Halobacterium salinarum NRC-1, an important model organism for gene expression regulation studies in Archaea. By integrating gene expression data from 18 RNA-seq paired-end libraries, we were able to annotate 846 asRNAs from mapped aTSSs. We found asRNAs in ~21% of annotated genes including genes related to important characteristics of this organism, such as: gas vesicle proteins, bacteriorhodopsin, translation machinery and transposases. We also found asRNAs in type II toxin-antitoxin systems and using public dRNA-seq data, we show evidences that this phenomenon might be conserved in archaea and bacteria. The interaction of a ncRNA with its target may depend on intermediary proteins action. In archaea, the LSm protein is a RNA chaperone homologous to bacterial Hfq, involved in post-transcriptional regulation. We used RIP-seq data from RNAs immunoprecipitated with LSm and identified 91 asRNAs interacting with this protein, for 81 of these the mRNA of the sense gene is also interacting. We searched for aTSSs present in the same region of orthologous genes in the Haloferax volcanii. We found 160 aTSSs that originated asRNAs in H. salinarum NRC-1 that might be conserved in this two archaea. The expression of annotated asRNAs was analyzed over a growth curve and in a knockout strain for RNase R gene. We found 144 asRNA differentially expressed over the growth curve, for 56 of these the sense gene was also differentially expressed, characterizing possible cis regulators asRNAs. In the knockout strain we found five differentially expressed asRNAs and only one asRNA/gene pair, this result does not allow us to infer a dsRNA degradation in vivo activity for this RNase in H. salinarum NRC- 1. This work contributes to the discovery of the antisense transcriptome in H. salinarum NRC- 1 a relevant step to uncover the post-transcriptional gene regulatory network in this archaeon.

Em procariotos, RNAs antisense (asRNAs) constituem a classe de RNAs não codificantes (ncRNAs) mais numerosa detectada por métodos de avaliação de transcritoma em larga escala. Apesar da grande abundância, pouco se sabe sobre mecanismos regulatórios e aspectos da conservação evolutiva dessas moléculas, principalmente em arquéias, onde o mecanismo de degradação de RNAs dupla fita (dsRNAs) é um fenômeno pouco conhecido. No presente estudo, utilizando dados de dRNA-seq, identificamos 1626 inícios de transcrição primários antisense (aTSSs) no genoma de Halobacterium salinarum NRC-1, importante organismo modelo para estudos de regulação gênica no domínio Archaea. Integrando dados de expressão gênica obtidos a partir de 18 bibliotecas de RNA-seq paired-end, anotamos 846 asRNAs a partir dos aTSSs mapeados. Encontramos asRNAs em ~21% dos genes anotados, alguns desses relacionados a importantes características desse organismo como: codificadores de proteínas que constituem vesículas de gás e da proteína bacteriorodopsina, além de vários genes relacionados a maquinaria de tradução e transposases. Além desses, encontramos asRNAs em genes pertencentes a sistemas de toxinas-antitoxinas do tipo II e utilizando dados públicos de dRNA-seq, evidenciamos que esse é um fenômeno que ocorre em bactérias e arquéias. A interação de um ncRNA com seu RNA alvo pode ser dependente de proteínas, em arquéias, a proteína LSm é uma chaperona de RNA homóloga a Hfq de bactérias, implicada no controle pós-transcricional. Utilizamos dados de RIP-seq de RNAs imunoprecipitados com LSm e identificamos 91 asRNAs interagindo com essa proteína, para 81 desses, o mRNA do gene sense também foi encontrado interagindo. Buscando por aTSSs presentes nas mesmas regiões de genes ortólogos, identificamos 160 aTSSs que dão origem a asRNAs em H. salinarum possivelmente conservados em Haloferax volcanii. A expressão dos asRNAs anotados foi avaliada ao longo de uma curva de crescimento e em uma linhagem knockout de um gene que codifica uma RNase R, possível degradadora de dsRNAs em arquéias. Encontramos um total de 144 asRNAs diferencialmente expressos ao longo da curva de crescimento, para 56 desses o gene sense também está diferencialmente expresso, caracterizando possíveis mecanismos de regulação em cis por esses RNAs. Na linhagem knockout, encontramos cinco asRNAs diferencialmente expressos e apenas para um desses o gene sense também está diferencialmente expresso, resultado que não nos permitiu inferir um possível papel de degradação de dsRNAs da RNAse R em H. salinarum NRC-1. Nesse trabalho apresentamos um mapeamento completo do transcritoma antisense primário de H. salinarum NRC-1 com resultados que consistem em um importante passo na direção da compreensão do envolvimento da transcrição antisense na regulação gênica pós-transcricional desse organismo modelo do terceiro domínio da vida. / Antisense RNAs (asRNAs) constitute the most numerous class of non-coding RNAs (ncRNAs) detected by transcriptome highthroughput methods in prokaryotes. Despite this abundance, little is known about regulatory mechanisms and evolutionary aspects of these molecules, mainly in archaea, where the mechanism of double-strand RNA (dsRNA) degradation remains poorly understood. In this study, using dRNA-seq data, we identified 1626 antisense transcription start sites (aTSSs) in the genome of Halobacterium salinarum NRC-1, an important model organism for gene expression regulation studies in Archaea. By integrating gene expression data from 18 RNA-seq paired-end libraries, we were able to annotate 846 asRNAs from mapped aTSSs. We found asRNAs in ~21% of annotated genes including genes related to important characteristics of this organism, such as: gas vesicle proteins, bacteriorhodopsin, translation machinery and transposases. We also found asRNAs in type II toxin-antitoxin systems and using public dRNA-seq data, we show evidences that this phenomenon might be conserved in archaea and bacteria. The interaction of a ncRNA with its target may depend on intermediary proteins action. In archaea, the LSm protein is a RNA chaperone homologous to bacterial Hfq, involved in post-transcriptional regulation. We used RIP-seq data from RNAs immunoprecipitated with LSm and identified 91 asRNAs interacting with this protein, for 81 of these the mRNA of the sense gene is also interacting. We searched for aTSSs present in the same region of orthologous genes in the Haloferax volcanii. We found 160 aTSSs that originated asRNAs in H. salinarum NRC-1 that might be conserved in this two archaea. The expression of annotated asRNAs was analyzed over a growth curve and in a knockout strain for RNase R gene. We found 144 asRNA differentially expressed over the growth curve, for 56 of these the sense gene was also differentially expressed, characterizing possible cis regulators asRNAs. In the knockout strain we found five differentially expressed asRNAs and only one asRNA/gene pair, this result does not allow us to infer a dsRNA degradation in vivo activity for this RNase in H. salinarum NRC- 1. This work contributes to the discovery of the antisense transcriptome in H. salinarum NRC- 1 a relevant step to uncover the post-transcriptional gene regulatory network in this archaeon.