Les riborégulateurs sont un sujet de grand intérêt pour une partie de la communauté scientifique depuis leur découverte en 2002. Toutefois, comme ces structures retrouvées dans des ARNm ayant la capacité de réguler l'expression génétique en réponse à la liaison d'un petit métabolite sont présentées comme une cible antibiotique très prometteuse, les riborégulateurs intéressent maintenant les médias ainsi que la population en général. Malgré ce fort potentiel de cible antibiotique, il reste encore beaucoup d'interrogations à élucider avant de commercialiser des molécules ciblant les riborégulateurs afin de contrer une infection bactérienne chez un animal ou un humain. De cette manière, la recherche visant à mieux caractériser les riborégulateurs est d'une grande importance. L'étude présentée dans ce mémoire a donc comme objectif général de mieux caractériser le riborégulateur SAM-I d'un point de vue structural et fonctionnel. Grâce à des techniques de transcription in vitro à cycle unique (single-round in vitro transcription), d'acylation sélective du 2'-hydroxyle analysée par extension d'amorce (SHAPE) et de transfert d'énergie par résonnance de fluorescence (FRET), il a été possible de mieux caractériser deux éléments structuraux importants pour le repliement et la fonction du riborégulateur SAM-I. En effet, il a été démontré que l'appariement du coeur ainsi que l'identité des nucléotides de la jonction 1/4, sont essentiels au bon fonctionnement du riborégulateur. De plus, des essais d'électrophorèse comparative sur gel (CGE) ont permis de caractériser la phase ondulatoire de la rotation de la tige P1 du riborégulateur SAM-I ainsi que confirmer sa présence dans le cas d'un aptamère à 3 voies, c'est-à-dire qui ne possède pas de tige P4.

Du fait de leur haute stabilité et bas coût de production, les aptamères suscitent un intérêt croissant, depuis près de 20 ans, dans le design de biocapteurs en tant qu'élément de reconnaissance idéal. Le but de ce travail de thèse est de démontrer l'intérêt et la pertinence d'un outil tel qu'une biopuce à aptamères, associant les avantages des sondes aptamères à ceux d'une détection par SPRi (Surface Plasmon Resonance imaging), permettant une détection sans marquage et en temps réel d'interactions moléculaires. Dans ce but, deux aptamères anti-thrombine (APT1 = 5′- GGT-TGG-TGT-GGT-TGG -3′ et APT2 = 5′-AGT-CCG-TGG-TAG-GGG-AGG-TTG-GGG-TGA-CT-3′) ont été choisis comme objets d'étude modèles. Ce choix a permis d'orienter différents axes de recherche : utilisés indépendamment comme sondes lors de l'élaboration de notre biopuce, ils ont tout d'abord permis de réaliser une détection cinétique optimisée de la thrombine, avec des performances remarquables pour une détection de ce type, ainsi que le calcul de constantes de dissociation en solution et à la surface des biopuces. Mais au-delà d'un simple biocapteur, la biopuce a également pu être utilisée comme véritable plateforme d'étude de la thrombine et de ses interactions, au sein de structures plus complexes telles que la structure « sandwich » entre les deux aptamères, ou d'autres interactions impliquant la thrombine en tant qu'acteur de la cascade de coagulation (inhibition de la thrombine par l'antithrombine III et le cofacteur II de l'héparine, transformation de la prothrombine au sein du complexe prothrombinase). / For 20 years, aptamers have been raising an increasing interest for biosensor applications as replacements for antibodies, due to their high stability and low cost. The main objective of this Ph.D. thesis is to show the great capacities of an aptamer biochip that combines the advantages of aptamer probes associated with a SPRi (Surface Plasomn Resonance imaging) detection to monitor, in real-time and in a label-free manner, molecular interactions occurring on the surface of the biochip. Two aptamers selected against the thrombin protein (APT1 = 5′- GGT-TGG-TGT-GGT-TGG -3′ and APT2 = 5′-AGT-CCG-TGG-TAG-GGG-AGG-TTG-GGG-TGA-CT-3′) were chosen as models for our study. This choice led to the exploration of different lines of research. First, both aptamers were used independently to develop a kinetic biosensor with remarkable performances for the quantification of thrombin. This tool served to determine independently, and compare, both the solution- and surface-phase affinities of the trombin-APT2 interaction. But more than a simple and effective biosensor, this kind of biochip represents a true platform to study the protein and its interactions within complex structures, such as the sandwich-like architecture with APT1 and APT2, or its interactions with other factors of the coagulation cascade (inhibition of thrombin by antithrombin III and heparin cofactor II, conversion of prothrombin into thrombin by the prothrombinase complex).

La détection rapide et sensible des agents pathogènes est d’une très grande importance pour la biosécurité. Les biopuces sont bien adaptées à cet effet, car elles permettent la détection multiplexe des cibles. Une limitation cruciale des biopuces est leur manque de fiabilité et de sensibilité. L’objectif de cette thèse est de développer une architecture reproductible de biopuces à base de couche mince de silicium amorphe carboné (a-SiC:H) déposée sur un réflecteur en aluminium pour une détection fiable et sensible des pathogènes. Nous avons choisi comme système modèle l’interaction de la toxine alimentaire ochratoxine A (OTA) avec son aptamère AntiOTA de longueur 36mer. Les aptamères (simples brins d’ADN) sont de plus en plus utilisés comme sondes en raison de leur grande spécificité et affinité vis-à-vis d’une large gamme de cibles (i.e. protéines, bactéries…). La stratégie de fabrication consiste en un greffage de monocouches organiques d’acides carboxyliques via des liaisons Si-C robustes, suivi de l’accrochage covalent des aptamères par un couplage peptidique. Les processus de greffage ont été mis au point sur silicium cristallin permettant la quantification des couches greffées par spectroscopie infrarouge en mode ATR (Attenuated total reflexion). La quantification IR des interactions OTA – AntiOTA a été montrée pour la première fois sur des surfaces par IR-ATR. La spécificité de l’aptamère a été démontrée en utilisant une molécule chimiquement similaire (warfarin), pour laquelle l’AntiOTA ne montre aucune affinité. Ces protocoles bien contrôlés ont été transférés sur l’architecture de la biopuce a-SiC:H. Les aptamères immobilisés sont hybridés avec des brins complémentaires marqués avec des fluorophores. En présence de l’OTA une déshybridation des brins complémentaires est attendue, conduisant à une diminution du signal fluorescent. Différentes longueurs de brins complémentaires ont été comparées, montrant jusqu’à 13% de diminution due à l’interaction de l’OTA. / Rapid and sensitive detection of pathogenic targets play a crucial role in biosecurity. Biochips are ideal for this, as they allow easy and multiplex detection of targets. A crucial limitation in biochips is that they often suffer from low reliability and sensitivity. The goal of this thesis is to develop a stable and reproducible architecture for biochips based on an amorphous silicon carbon alloy (a-SiC:H) deposited on an aluminium back-reflector for reliable and sensitive detection of pathogens. On these biochips we introduced the interaction of the food and feed toxin ochratoxin A (OTA) with its 36mer aptamer AntiOTA as a model system. Aptamers (single strands of DNA) are ideal as probes for biochips as they display high specificity and affinity towards a wide range of targets (i.e. proteins, bacteria…). The well-controlled multi-step fabrication process consists of the reliable photochemical grafting of acid-terminated organic monolayers on silicon surfaces by robust Si C bonds, which in turn were functionalized with aptamers by stable peptide coupling. Carrying out this process on crystalline silicon allowed monitoring and quantification of every step by infrared spectroscopy (IR-ATR). The interaction OTA – AntiOTA was shown for the first time on surfaces by IR, and an IR in situ calibration allowed the quantification of OTA which was bound by the aptamers on the surface. The specificity of AntiOTA towards OTA was demonstrated by using a chemically similar molecule (warfarin), for which AntiOTA shows no affinity. The well-controlled protocols were transferred to the a-SiC:H biochip. The immobilized aptamers were hybridized with complementary and fluorescent-labeled DNA-strands. In presence of OTA, dehybridization of the complementary strands is expected, resulting in a decrease of fluorescent signal. Different lengths of complementary strands were compared, exhibiting up to 13% signal decrease due to OTA.

Les biopuces sont des outils d'analyse et de diagnostic de plus en plus utilisés dans le domaine médical et celui de la sécurité. Les puces à protéines sont particulièrement intéressantes car les protéines sont les manifestations directes de l'activité cellulaire. Ces puces sont généralement constituées d'un support sur lequel sont déposés des sondes possédant une affinité particulière avec les cibles à détecter. Cependant, leur sélectivité et sensibilité n'est parfois pas suffisante pour détecter de manière fiable les concentrations létales des certaines toxines, en particulier à cause de l'adsorption non spécifique des cibles sur la surface et de le fragilité de la chimie d'immobilisation des sondes. Cette thèse s'est attelée à améliorer ces paramètres en proposant une chimie contrôlée sur silicium qui, en utilisant des molécules composées d'un alcène et d'une chaîne poly(éthylène glycol), a permis de très largement limiter cette adsorption indésirable, tandis que la présence d'un groupement acide carboxylique en surface a permis l'immobilisation covalente des sondes aptamères capables de reconnaître des protéines.

Du fait de leur haute stabilité et bas coût de production, les aptamères suscitent un intérêt croissant, depuis près de 20 ans, dans le design de biocapteurs en tant qu'élément de reconnaissance idéal. Le but de ce travail de thèse est de démontrer l'intérêt et la pertinence d'un outil tel qu'une biopuce à aptamères, associant les avantages des sondes aptamères à ceux d'une détection par SPRi (Surface Plasmon Resonance imaging), permettant une détection sans marquage et en temps réel d'interactions moléculaires. Dans ce but, deux aptamères anti-thrombine (APT1 = 5′- GGT-TGG-TGT-GGT-TGG -3′ et APT2 = 5′-AGT-CCG-TGG-TAG-GGG-AGG-TTG-GGG-TGA-CT-3′) ont été choisis comme objets d'étude modèles. Ce choix a permis d'orienter différents axes de recherche : utilisés indépendamment comme sondes lors de l'élaboration de notre biopuce, ils ont tout d'abord permis de réaliser une détection cinétique optimisée de la thrombine, avec des performances remarquables pour une détection de ce type, ainsi que le calcul de constantes de dissociation en solution et à la surface des biopuces. Mais au-delà d'un simple biocapteur, la biopuce a également pu être utilisée comme véritable plateforme d'étude de la thrombine et de ses interactions, au sein de structures plus complexes telles que la structure " sandwich " entre les deux aptamères, ou d'autres interactions impliquant la thrombine en tant qu'acteur de la cascade de coagulation (inhibition de la thrombine par l'antithrombine III et le cofacteur II de l'héparine, transformation de la prothrombine au sein du complexe prothrombinase).

Les biosenseurs basés sur des aptamères quadruplexes comme celui de la thrombine (TBA) recourent souvent à l’élongation de l’aptamère. La flexibilité accrue de l’aptamère-sonde facilite la reconnaissance de la cible et améliore donc sa détection. Or le reploiement des structures quadruplexes est influencé notamment par l’ajout de nucléotides à leur extrémité. Du fait de l’importance de la structure de la sonde pour la reconnaissance, nous avons dans un premier temps comparé le type de reploiement adopté par 2 séquences allongées, GTA GGT TBA et TTT TTT TBA, à celui de TBA et ce en présence de différents cations (Ba2+, Ca2+, K+, Mg2+, Na+, NH4+, Rb+ et Sr2+). La stabilité thermique de ces structures a aussi été étudiée. Nous avons montré qu’alors que TBA se reploie toujours en un quadruplexe anti-parallèle, les séquences allongées peuvent également adopter une conformation parallèle. Les différences entre les résultats obtenus avec les deux séquences allongées indiquent que, contrairement à ce qui se fait dans la littérature, le choix de ces nucléotides devrait être effectué en fonction de la structure adoptée par la sonde allongée dans les conditions d’interaction envisagées.<p><p>La deuxième partie du travail a porté sur l’interaction entre les aptamères et le [Ru(NH3)6]3+, fréquemment utilisé pour quantifier des sondes ADN immobilisées. Nos mesures mettent en évidence un comportement électrochimique inédit pour le [Ru(NH3)6]3+ en interaction avec les aptamères. La notion de [Ru(NH3)6]3+ « confiné » a été introduite pour distinguer cette interaction du cas purement électrostatique bien connu. La stœchiométrie d’interaction entre le [Ru(NH3)6]3+ confiné et la partie quadruplexe des séquences d’aptamère a été évaluée à 2 complexes métalliques par quadruplexe et confirmée, en solution, par dichroïsme circulaire (CD). Ces mesures montrent aussi que ce marqueur redox déstabilise la structure quadruplexe anti-parallèle de TBA et que pour les séquences GTA GGT TBA et TTT TTT TBA, il stabilise des structures quadruplexes parallèles. Dans le cas des séquences allongées, l’interconversion entre les structures parallèles et anti-parallèles a été suivie par CD lors d’une compétition ionique entre les cations [Ru(NH3)6]3+ et K+.<p><p>Sur base des différentes interactions mises en évidence entre le [Ru(NH3)6]3+ et les aptamères, diverses pistes de détection de la thrombine ont été explorées. Les conditions d’immobilisation des sondes ont été optimisées sur base des dimensions de la thrombine. La détection de cette protéine cible a été réalisée avec succès d’une part en exploitant l’interaction purement électrostatique du [Ru(NH3)6]3+ et d’autre part grâce à la formation de [Ru(NH3)6]3+ confiné.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’analyse de traces dans des matrices complexes (environnementales, alimentaires ou biologiques) requiert très souvent une étape de purification et de préconcentration avant une analyse via des méthodes chromatographiques. Dans cette optique, des supports d’extraction basés sur des mécanismes de reconnaissance moléculaire ont été développés et appliqués à l’extraction de composés cibles rendant ainsi l’analyse plus sensible et plus fiable. Ces supports sélectifs peuvent entre autres résulter de l’immobilisation de biomolécules tels que les anticorps ou les aptamères (i.e. des oligonucléotides présentant une séquence capable de se lier spécifiquement à une molécule). Cette étape de traitement de l’échantillon est particulièrement nécessaire lorsqu’il s’agit de développer des systèmes séparatifs miniaturisés, tels que les microsystèmes séparatifs sur puce, du fait de la diminution de la résolution qui résulte de l’utilisation d’un canal de séparation de faible longueur. Dans ce contexte, ce projet de recherche a consisté à développer des systèmes bioanalytiques miniaturisés pour l’analyse de petites molécules ou protéines dans des échantillons complexes. Pour développer ces systèmes, la synthèse d’un monolithe hybride organique-inorganique in situ dans des capillaires de 100 µm d.i. a, dans un premier temps, été optimisée via une approche sol-gel puis caractérisée en termes de répétabilité. Dans une deuxième partie, deux toxines modèles de faible poids moléculaire ont été choisies : la microcystine-LR (MC-LR) et l’ochratoxine A (OTA). Des anticorps monoclonaux et des aptamères, spécifiques de l’une et l’autre des toxines ont ensuite été greffés sur des monolithes en capillaire. Les immuno- et oligoadsorbants miniaturisés obtenus (respectivement mIS et mOS) ont été couplés en ligne avec la nanoLC. La rétention spécifique des toxines cibles sur les mIS et mOS a été démontrée dans l’eau pure. La répétabilité de la synthèse et du greffage a été évaluée et la capacité de chacun des supports miniaturisés a été déterminée. Enfin, mIS et mOS ont été appliqués avec succès à l’extraction sélective de la MC-LR et de l’OTA à partir d’extraits de cultures de cyanobactéries, d’eaux environnementales ainsi que d’échantillons de bière dopés. Dans un troisième temps, de façon à transposer les outils sélectifs développés à l’analyse de protéines, des microréacteurs enzymatiques (IMER) ont été préparés par greffage de deux enzymes protéolytiques (pepsine et trypsine) sur des monolithes. Ces outils ont ensuite été couplés avec la nanoLC-MS² pour l’analyse d’une protéine modèle, le cytochrome C. Les rendements de digestion sur IMER se sont avérés présenter une bonne répétabilité. Toutefois, l’efficacité de la digestion sur les IMER à base de pepsine reste à ce jour insuffisante et nécessite de réadapter la procédure de greffage et/ou de digestion. / The analysis of ultra-traces from complex matrices (environmental, foodstuff or biological) often requires a step of purification and preconcentration before their analysis by chromatographic separation methods. Therefore, extraction sorbents based on a molecular recognition mechanism can be developed and used for the selective extraction of target molecules thus rendering their quantitative analysis in complex samples more reliable and sensitive. These extraction sorbents may result, among others, from the immobilization of biomolecules such as antibodies and aptamers (i.e. oligonucleotides whose sequence is specific for a target molecule). This selective sample pretreatment step is particularly necessary when developing miniaturized devices such as separative microsystems on chip because of the decrease of the resolution that results from the use of a shorter length separation channel. In this context, the aim of our study was to develop miniaturized bioanalytical devices for the analysis of small molecules or proteins in complex samples. For the development of these devices, in-situ synthesis of a porous hybrid organic-inorganic monolith in capillaries (100 µm i.d.) by sol-gel approach was firstly optimized and characterized in terms of repeatability. Secondly, two model toxins of low molecular weight were chosen: microcystin-LR (MC-LR) and ochratoxin A (OTA). Monoclonal antibodies and aptamers specific to one and the other target molecules were then grafted on the monolithic capillaries. The resulting miniaturized immunosorbent (mIS) and oligosorbent (mOS) were then coupled on-line to nanoLC. Specific retention of MC-LR and OTA on the mIS and the mOS, respectively, was demonstrated in pure water. Synthesis repeatability and capacity of the miniaturized sorbents were evaluated. Finally, these miniaturized tools were applied to the selective extraction of MC-LR or OTA from complex samples, i.e. blue-green algae extracts, environmental waters or beer. In a third part, immobilized enzyme reactors (IMERs) were prepared by grafting two proteolytic enzymes (pepsin and trypsin) on monoliths in order to transpose the developed selective tools to the analysis of proteins. These IMERs were then coupled on-line to nanoLC-MS² for the analysis of a model protein, cytochrome C. Digestion yields on IMERs presented a good repeatability. However, digestion efficiency on the pepsin-based IMERs remains so far insufficient and grafting or digestion procedure needs to be readjusted.

Le travail réalisé au cours de cette thèse a porté sur le développement de biocapteurs électrochimiques d’affinité, sensibles et sélectifs, pour la détection de l’ochratoxine A (OTA) et l’aflatoxine M1 (AFM1). Les biocapteurs développés reposent sur l’association de différents nanomatériaux pour une meilleure performance analytique. Pour construire notre transducteur, nous avons associé le polypyrrole à des dendrimères poly(amido-amine) PAMAM, ce qui a permis d’avoir de très bon rendements grâce au propriétés électriques du polypyrrole et à l’augmentation de la surface active due à la structure tridimensionnelle des dendrimères. L’utilisation d’aptamères spécifiques pour la détection des différentes mycotoxines a permis leur détection et quantification à des concentrations de l’ordre des nM, ainsi que l’élargissement des gammes dynamiques. Nous avons pu démontrer grâce à l’utilisation de dendrimères de différentes tailles que la sensibilité des biocapteurs ne provient pas uniquement de l’affinité qui existe entre les biorécepteurs et leurs molécules cibles, mais aussi des propriétés physico-chimiques du biocapteur. / This aim of this work is to develop ultrasensitive electrochemical biosensors with high affinity toward ochratoxine (OTA) and aflatoxine M1 (AFM1). In order to obtain the best analytical performances, we associated nano-materials in the transducer construction: conducting polypyrrole polymer and poly(amido-amine) dendrimères. Thanks to this association, we benefited from the conducting material’s electrical properties, and the large active detection surface dendrimers. For the bimolecular sensing part, we used specific DNA aptamers which allowed us to quantify mycotoxines at nM concentrations. In addition, the different aptamer based biosensors present a very large dynamic ranges. We also demonstrated through the use of different sizes of dendrimers, that the sensitivity depend not only in the affinity between bioreceptors and their target molecules, but also in the physico-chemical properties of the biosensor.

Hsp27 appartient à la famille des protéines dites de survie comme Bcl2 ou la survivine. C'est une protéine anti-apoptotique qui subit une dérégulation de son expression dans de nombreux types tumoraux. Elle est caractérisée comme étant une cible thérapeutique majeure. Au cours de ma thèse, j'ai isolé des peptides stabilisés, dit aptamères, capables d'inhiber fonctionnellement les activités anti-apoptotiques et tumorigènes d'Hsp27. Ces aptamères perturbent la biochimie structurale de Hsp27 et induisent le blocage du cycle cellulaire in vivo. Parallèlement à cette étude, j'ai caractérisé les effets de la déplétion de Hsp27 sur la formation de métastases et de tumeurs osseuses. J'ai aussi montré que la modification du taux de Hsp27 induisait la dégradation de différentes protéines, dites clientes, comme la caspase3, HDAC6 et STAT2.

Hsp27 appartient à la famille des protéines dites de survie comme Bcl2 ou la survivine. C’est une protéine anti-apoptotique qui subit une dérégulation de son expression dans de nombreux types tumoraux. Elle est caractérisée comme étant une cible thérapeutique majeure. Au cours de ma thèse, j’ai isolé des peptides stabilisés, dit aptamères, capables d’inhiber fonctionnellement les activités anti-apoptotiques et tumorigènes d’Hsp27. Ces aptamères perturbent la biochimie structurale de Hsp27 et induisent le blocage du cycle cellulaire in vivo. Parallèlement à cette étude, j’ai caractérisé les effets de la déplétion de Hsp27 sur la formation de métastases et de tumeurs osseuses. J’ai aussi montré que la modification du taux de Hsp27 induisait la dégradation de différentes protéines, dites clientes, comme la caspase3, HDAC6 et STAT2. / Hsp27 belongs to the class of survival proteins like Bcl2 or survivin. This protein was well categorized as a major anti apoptotic protein as displaying a high level of expression in lot of tumor types. Moreover, Hsp27 is referenced as a major therapeutic target in cancer. During my PhD, I characterized stable peptides called aptamers, which functionally blocked Hsp27 antiapoptotic and tumorigenic properties. These aptamers disrupted biochemical and structural states of Hsp27 and promoted cell cycle arrest in xenografts. In the same time, I have characterized the effect of Hsp27 depletion in metastasis establishment and bone marrow tumor growth. I have shown that targeting level of Hsp27 induced degradation of several of its client proteins like caspase3, HDAC6 and STAT2