Diagnostiquer précocement les maladies est un défi à relever pour améliorer la prise en charge des patients concernés et leur offrir une meilleure qualité de vie. Les analyses 'omiques', qui quantifient globalement, simultanément et sans a priori l'abondance de milliers de molécules dans les liquides biologiques, s'avèrent très prometteuses pour l'identification de biomarqueurs précoces des maladies complexes. Dans ce contexte, mon travail de thèse avait pour objectif de développer des outils de diagnostics, à partir d'analyses du peptidome et métabolome urinaire, pour détecter précocement la présence d'une maladie rénale chronique (MRC) et la survenue de ses complications cardiovasculaires. La première étude, insérée dans le projet européen 4C (Cardiovascular Complications in Children with Chronic kidney disease), s'est centrée sur les complications cardiovasculaires associées à la MRC en pédiatrie. Ces complications constituent la principale cause de mortalité des enfants en insuffisance rénale, et leur diagnostic précoce est impossible à ce jour. En analysant par électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse (CE-MS) le peptidome urinaire de 86 enfants souffrant, ou non, de complications cardiovasculaires secondaires à la MRC, nous avons identifié des peptides qui permettent de prédire à l'avance les patients à haut risque cardiovasculaire : 190 peptides étaient associés à l'épaississement de la paroi carotidienne (AUC 0.87, sensibilité 80%, spécificité 100%) et 22 peptides prédisaient l'augmentation de la rigidité artérielle (AUC 0.83, sensibilité 83%, spécificité 70%). Le second projet relevait de la médecine vétérinaire. Dans cette étude menée sur 50 chiens avec et sans MRC, nous avons caractérisé pour la première fois le peptidome urinaire canin via la technologie CE-MS et nous avons découvert 133 peptides urinaires associés à la MRC. Ces derniers ont permis de diagnostiquer la présence d'une MRC dans 80% des chiens. Les métabolites sont mieux corrélés au phénotype que les autres strates moléculaires. Cependant l'apport de la métabolomique en clinique est encore limité, dû au manque de technologies analytiques performantes. Le troisième objectif de ma thèse était donc de mettre au point une procédure de dosage par CE-MS des métabolites urinaires. Grâce à une méthode unique de normalisation interne, basée sur l'utilisation de métabolites endogènes stables, il est maintenant possible d'analyser le contenu en métabolites d'un même échantillon urinaire avec une très haute reproductibilité sur le long terme (4 ans). Comme preuve de concept, nous avons mis en évidence, via cette procédure, la présence d'une combinaison de 32 métabolites dans l'urine qui permet de repérer avec une sensibilité de 76% et une spécificité de 86% les nouveau-nés porteurs d'une malformation rénale obstructive. Enfin, la quatrième problématique s'inscrivait dans une démarche translationnelle. Son but était de développer des aptasenseurs capables de détecter avec de hautes affinités et spécificités les biomarqueurs d'origine omique, pour un diagnostic simple, rapide et à moindre coût. La cible choisie était un fragment urinaire de l'alpha-1-antitrypsine, qui est ~1000 fois plus abondant chez les adultes atteints de MRC que les chez les sains. La sélection de l'aptasenseur s'est faite par le Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX). Nous présentons ici les travaux préliminaires de la mise au point du SELEX sur cette cible. En conclusion, cette thèse démontre le potentiel de l'analyse du contenu urinaire en peptides et métabolites pour le diagnostic précoce des pathologies complexes telles que la MRC et les complications cardiovasculaires associées. De plus l'obtention d'aptasenseurs dirigés contre ces biomarqueurs précoces et utilisables au chevet du patient devrait révolutionner dans le futur les méthodes diagnostiques. / Early diagnosis of diseases is a big challenge to improve patients' health and quality of life. 'Omics' analyses, which allow the global and simultaneous quantification of the relative abundance of thousands of molecules in biological fluids are promising for the identification of early biomarkers of complex diseases. In this context, the objective of my thesis was to develop diagnostic tools, based on urinary peptidome and metabolome analyses, for the early detection of chronic kidney disease (CKD) and associated cardiovascular complications. The first study, as part of the 4C European project (Cardiovascular Complications in Children with Chronic kidney disease), focused on analyzing the cardiovascular complications associated to CKD in children. These complications are the main cause of mortality in children with CKD and their early diagnosis is impossible for now. Analysis of the urinary peptidome of 86 children with or without cardiovascular complications associated to CKD by capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry (CE-MS), led to the identification of two sets of peptides for the early prediction of high cardiovascular risk in pediatric patients: 190 peptides were associated to an increase of the carotid intima-media thickness (AUC 0.87, sensitivity 80%, specificity 100%) and 22 peptides were associated to an increase in arterial stiffness (AUC 0.83, sensitivity 83%, specificity 70%). The second study falls in the field of veterinary medicine. In this study, carried out on 50 dogs with or without CKD, we analyzed for the first time the canine urinary peptidome using the CE-MS technology. We identified 133 urinary peptides associated to CKD allowing an accurate diagnosis of CKD in 80% of the dogs. Metabolites correlate best to phenotype compared to other molecular traits. However, the use of metabolomics for identification of clinically relevant biomarkers is very limited due to the lack of high-performance analytical technologies. The third part of my thesis was to develop a procedure for the quantification of urinary metabolites by CE-MS. Using a unique method of internal normalization based on endogenous and stable metabolites, we can now analyze the metabolite content of the same urine sample with a high reproducibility over the long-term (4 years). As a proof-of-concept, we demonstrated that this developed procedure led to the identification of a set of 32 urinary metabolites that allow the early identification of newborns with an obstructive kidney anomaly with a sensitivity of 76% and a specificity of 86%. Finally, the fourth study was dedicated to improving translational research. The aim was to develop aptasensors able to detect 'omics'-identified biomarkers with a high affinity and specificity to obtain a simple, rapid and low-cost diagnostic test. The biomarker chosen as target is a urinary fragment of alpha-1-antitrypsin, which is ~1000 more abundant in adults with CKD compared to healthy subjects. Aptasensors were selected by the Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX). Here we present preliminary work on the development of the SELEX for our target. In conclusion, this thesis shows the strength of the urinary content, in terms of peptides and metabolites, for the early diagnosis of complex pathologies like CKD and the associated cardiovascular complications. Moreover, the selection of aptasensors targeting these early biomarkers and that can be used at bedside, will revolutionize future diagnostic methods.

Pour aider à la protection de l’environnement et au diagnostic de maladies, il est nécessaire de disposer de méthodes d’analyse performantes. Ces méthodes doivent être rapides et peu coûteuses afin d’analyser un grand nombre d’échantillons et détecter la présence éventuelle de la molécule recherchée. C’est dans ce cadre qu’un bio-essai à double reconnaissance dédié aux petites molécules a été développé. Il repose sur l’utilisation d’aptamères comme élément de reconnaissance moléculaire et sur la formation de « kissing complex ». Les aptamères sont des oligonucléotides qui possèdent une grande spécificité et une grande affinité pour leur cible. Les « kissing complexes » désignent, quant à eux, l’interaction de deux séquences au niveau de leur boucle apicale. L’objectif de la thèse est de continuer l’étude et l’optimisation de ce schéma d’analyse, puis montrer sa potentialité et sa versatilité. Dans un 1er temps, la détection en multiplexe de plusieurs petites molécules a été mise en place. L’optimisation du système de détection a ensuite été effectuée pour la détection de l’adénosine avec le développement d’une nouvelle stratégie de détection. Enfin, un test colorimétrique basé sur l’utilisation de nanoparticules d’or a été décrit. / Bioanalytical tools based on molecular recognition elements constitute one of the most important strategies used to routinely quantify low molecular weight analytes in biological fluids or environmental matrices as disease-related biomarkers, drugs or toxins/contaminants. Recently, a novel aptamer-based sensing design has been reported. It is based on a dual recognition mechanism that involves the formation of functional nucleic acid architectures, named “kissing complex”. Aptamers are single stranded oligonucleotides that possess high affinity and high selectivity for their target. The aim of this thesis is to pursue the study and the optimization of this sandwich like scheme and to prove its potential. Firstly, the simultaneous detection of multiple small analytes by fluorescence anisotropy using the sandwich like scheme has been reported. Then, this novel bioassay has been optimized through the development of a new strategy. Finally, a gold nanoparticle colorimetric

Les aptamères correspondent à de courtes séquences d'oligonucléotides possédant une forte affinité et spécificité envers un ligand (petites molécules organiques, peptides, acides nucléiques, protéines, cellules). Du fait de leurs remarquables propriétés, ils sont utilisés comme alternative aux anticorps dans les dispositifs de type biocapteur/biopuce, notamment pour la détection de petites molécules (PM < 2000 Da). L'imagerie de résonance des plasmons de surface (SPRi) est une technique de détection optique qui a gagné une attention croissante ces dernières années. Elle est basée sur un principe de variation de l'indice de réfraction d'une surface sélective lors de l'interaction sonde/cible. Sa sensibilité est néanmoins limitée aux molécules de poids moléculaire supérieur à 2000 Da. Dans le cadre de ces travaux, nous avons développé une biopuce à aptamères pour à la détection d'une petite molécule, l'adénosine, au moyen de la technique de résonance des plasmons de surface (SPR). Pour cela, deux différentes stratégies ont été développées. La première combine l'utilisation de nanoparticules d'or (AuNPs) pour l'amplification du signal SPRi avec l'ingénierie des séquences d'aptamères. La seconde stratégie est basée sur l'exploitation de la stabilité thermodynamique apportée par l'interaction de la cible (adénosine) avec les séquences d'aptamères. Le dispositif SPR est alors couplé à un système de régulation de température, permettant ainsi d'assurer la dissociation des complexes et d'établir des profils de dénaturation caractéristiques. Nos résultats initient ainsi une nouvelle approche dans la détection de petites molécules par SPRi et ouvrent de nouvelles perspectives de développement des biocapteurs à aptamères. / Aptamers are single-stranded DNA (ssDNA) or RNA molecules capable of binding to target molecules, including proteins, metal ions and drugs. Because of their specific binding abilities and many advantages over antibodies (higher stability, lower cost, easy chemical modification…), they provide a great opportunity to produce sensing surfaces for effective and selective detection of small molecules. Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi) has become one of the most widely used label-free method for the study of biorecognition events on sensor surfaces. This technique provides a rapid approach, however, limited by low refractive index changes occurring when small molecules (<2000 Da) are captured on the sensor. Whereas significant reflectivity variation is observed upon the interaction of large molecules like proteins with the sensing interface, for small molecules targets such adenosine, the reflectivity variation is often too small to be detected by SPRi. Thereby, only few studies have been reported so far on SPRi-based biosensor for small molecules detection using aptamers. In this work, we developed two bioassay strategies for the detection of a model small molecule, adenosine, using Surface Plasmon Resonance imaging. The first one combines the SPRi signal enhancement effect induced by gold nanoparticles (AuNPs) with the advantage of using engineered DNA aptamers. The experimental results have demonstrated that the presence of gold nanoparticles and adenosine, which works as a molecular linker between engineered aptamer fragments, can significantly increase the SPRi response. The second strategy is based on the thermodynamics of binding between adenosine and its aptamer. To that end, SPRi technique was coupled with rigorous temperature control and aptamer duplex stability was monitored (affected by target binding) by quantification of melting transitions. Our results initiate a new approach for small molecule detection using SPRi with the aim to validate future prospects for integration in parallelized platform.

Le SELEX est une technique d’évolution moléculaire dirigée qui permet, après plusieurs tours de sélection, d’enrichir une banque d’acides nucléiques en séquences capable de se lier de manière spécifique à une cible. Le séquençage est utilisé pour identifier ces séquences que l’on nomme « aptamères ». Depuis l’arrivée récente du séquençage à haut débit (HD), il est possible d’analyser des millions de séquences. L’objectif de la thèse était de développer des méthodes pour traiter et analyser les données de séquençage HD afin de faciliter l’identification des meilleurs aptamères d’un SELEX. Au cours de cette thèse, un test robotisé de liaison sur cellules adhérentes vivantes a été mis au point pour mesurer l’affinité d’aptamères issus de SELEX ciblant des cellules (cell-SELEX). Puis, l’évolution de l’abondance des séquences d’un cell-SELEX a été analysée par séquençage HD. Ceci nous a permis de concevoir une nouvelle approche phylogénétique baptisée FREDROGRAM. Cette approche évolutive a permis d’identifier des mutants avec une meilleure affinité au sein d’une famille d’aptamères issu de ce cell-SELEX. Enfin, le séquençage HD de deux SELEX dirigés contre des protéines a contribué à mieux comprendre l’impact des paramètres de sélection sur la population de séquences et à identifier de nouveaux aptamères, notamment en réduisant le nombre de tours de SELEX. En conclusion, ces travaux montrent l’utilité du séquençage HD pour l’identification des meilleurs aptamères et suggèrent de nouvelles pratiques pour la conduite des SELEX futurs. / SELEX is a directed molecular evolution technic which allows, after several rounds of selection, enriching a library from random nucleic acids to sequences able to bind specifically a target. Sequencing technics are then used to identify these sequences called « aptamers ». Since the arrival of High-Throughput Sequencing (HTS), it is now possible to analyse millions of sequences. The aim of the thesis was to develop methods for the treatment and the analysis of HTS data, in order to facilitate the identification of the best aptamers inside a SELEX. During this thesis, a semi-automatic binding test on adherent living cells has been developed to measure the affinity of aptamers identified in SELEX directed against specific cells (cell-SELEX). Then, the evolution of the sequence enrichment during a cell-SELEX has been analysed by HTS. This analysis gave us the possibility to design a new phylogenetic approch named FREDROGRAM. This evolutive approch allowed to identify variants of an aptamer’s family with a better affinity. Finally, HTS of two SELEX directed against proteins has contributed to a better understanding of the impact of selection parameters on the library and to identified new aptamers, notably by reducing the number of SELEX rounds. To conclude, this work shows the importance of HTS in the identification of the best aptamers and suggests new protocols to monitor the next SELEX in a different manner.

La maladie de Parkinson (PD) est considérée comme la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente. L'examen post-mortem de patients parkinsoniens et des modèles physiologiques d’études de la maladie de Parkinson suggèrent la participation de la mort cellulaire programmée, l'inflammation et l'autophagie dues au stress oxydatif, à des mutations ou l’agrégation de protéines au sein des neurones DA. Les aptamères peptidiques sont de petites protéines combinatoires, consistitués d’une plateforme (dans notre cas, la thiorédoxine humaine, hTRX) et une boucle variable insérée dans le domaine actif de hTRX. Deux aptamères peptidiques ont été identifiés par la sélection fonctionnelle. L’aptamère peptide 32 (Apta-32) ,est spécifique liant deux paralogues T32 impliqués dans le processus d'endocytose. L’aptamère peptidique 34(Apta-34) lie à une cible "T34", une protéine pro-apoptotique ayant un rôle dans la voie apoptotique provenant du noyau. Le travail de cette thèse visait à étudier la fonction anti-apoptotique de nos deux aptamères peptidiques dans deux modèles d’étude de la maladie de Parkinson: un modèle cellulaire (in vitro) et un modèle transgénique D. melanogaster (in vivo). Deux toxines majeures ont été appliquées dans ce travail, 6-hydroxindopamine (6-OHDA) et le paraquat, un pesticide couramment utilisé. Nos observations montrent que la drosophile exprimant Apta-32 dans tous les neurones ont montré une meilleure résistance après 48h de traitement avec le paraquat comparé à deux autre aptamères peptidiques, Apta-34 et Apta-TRX (sans boucle de contrôle variable). Une autre étude a révélé un défaut dans la phagocytose des corps apoptotiques au cours du développement embryonnaire de la drosophile exprimant Apta-32 dans les macrophages, ce qui suggère qu’Apta-32 pourrait participer à et peut-être interférer avec le processus de l’autophygie, et que Apta-32 pourrait protéger contre l'autophagie induite par paraquat dans les neurones. / Parkinson’s disease is considered as the second most common neurodegenerative disease. Although the cause of the progressive cell loss of PD remains unclear to date, programmed cell death, inflammation and autophagy due to oxidative stress, gene mutations or protein aggregations within DA neuron have been suggested as potential causes. Peptide aptamers are small combinatorial proteins, with a variable loop inserted into a scaffold protein, human thioredoxin, hTRX. They are used to facilitate dissection of signaling networks by modulating specific protein interactions and functions. Two peptide aptamers were identified by functional selection which inhibit Bax-dependent cell death in mammalian models. One peptide aptamer (Apta-32) is binding two paralogues involved in endocytotic trafficking T32. The second peptide aptamer (Apta-34) is binding to a target "T34", a pro-apoptotic protein mediating apoptosis emanating from the nucleus. The work of my PhD thesis aimed to investigate the anti-apoptotic function of our two peptide aptamers in different PD models including cell model (in vitro), brain tissue slice and D. melanogaster (in vivo) ; in particular their impact on neuron survival after exposure to specific toxins. Two major toxins were applied in this work, 6-hydroxindopamine (6-OHDA) and Paraquat, a commonly used pesticide. Our observations indicated that Drosophila expressing Apta-32 in all neurons showed more resistance 48h after treatment with Paraquat, compared to drosophila expressing Apta-34 or TRX. Another study revealed a defect in phagocytosis of apoptotic bodies in drosophila embryo’s expressing Apta-32 in macrophage, suggesting Apta-32 could be involved in, and perhaps interfere with, the process of autophagy. This suggests that Apta-32 could protect against paraquat induced autophagy in neurons.

La séparation d'énantiomères est d'un grand intérêt pour les industries pharmaceutiques, chimiques et agroalimentaires. Les aptamères sont utilisés au sein du Département de Pharmacochimie Moléculaire (DPM) en tant que nouveaux sélecteurs chiraux spécifiques d'une cible prédéterminée. Il s'agit d'oligonucléotides, en série ADN et ARN, générés par la procédure SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), ayant la capacité à fixer leurs molécules cibles avec une affinité égale voir supérieure à celle des anticorps. Ce travail a pour objectif d'étudier les propriétés énantiosélectives des aptamères, en série ADN et ARN, par micro-CLHP et EC. Une phase stationnaire chirale aptamère L-ARN anti-D-histidine a été créée en utilisant une stratégie d'immobilisation biotine-streptavidine dans le but d'étudier les propriétés énantiosélectives de cet oligonucléotide récemment isolé. Une nouvelle stratégie d'immobilisation covalente de l'aptamère a été développée afin d'élargir les conditions d'utilisation et d'améliorer la stabilité de ces colonnes aptamères. L'utilisation de ces nouveaux sélecteurs chiraux a ensuite été étendue à une analyse par EC. La première étude a été réalisée sur un aptamère test L-ARN anti-D-arginine caractérisé par de très fortes affinité (Kd = 330 nM) et énantiosélectivité (α = 12000). Ce travail a permis d'apprécier les caractéristiques exceptionnelles de cet aptamère et d'envisager son utilisation dans un essai énantiosélectif par compétition. Une impureté énantiomérique de 0,01% a ainsi été détectée. Un essai similaire, où un contact direct entre l'aptamère et son énantiomère cible est favorisé, a permis d'augmenter la sensibilité de la méthode et pourrait permettre d'abaisser la limite de détection grâce à l'utilisation d'une détection par fluorescence.

La détection de petites molécules est d'un grand intérêt dans les domaines pharmaceutique, environnemental, alimentaire et de la biologie clinique. Les aptamères, sélectionnés par la méthode SELEX (pour Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), sont des oligonucléotides qui se lient à une cible donnée avec une affinité et une spécificité importantes. L'objectif de ce travail est d'établir de nouvelles méthodologies analytiques basées sur l'utilisation des aptamères pour la détection de petites molécules. Dans un premier temps, une méthodologie par électrophorèse capillaire, dérivée du concept de déplacement du brin complémentaire de l'aptamère, est décrite pour la détection simultanée de plusieurs analytes dans un seul capillaire. La deuxième étude se focalise sur le développement d'un aptacapteur colorimétrique simple, rapide et peu coûteux, qui utilise le concept général de protection enzymatique de l'aptamère et les nanoparticules d'or en tant que système de transduction. Enfin, deux méthodes par polarisation de fluorescence, basées sur le concept de déplacement (du brin complémentaire ou de l'aptamère lui-même), sont présentées afin d'accroitre les potentialités des aptacapteurs dédiés à la détection des petites molécules.

Fur (Ferric Uptake Regulator) est un régulateur transcriptionnel spécifique des bactéries qui intervient dans le contrôle de l'homéostasie du fer, ce qui en fait une cible antibactérienne intéressante. Avant mon arrivée au laboratoire, quatre inhibiteurs interagissant spécifiquement avec Fur avaient été isolés. La partie active de ces inhibiteurs consiste en des peptides de 13 acides aminés. Au cours de cette thèse, j'ai utilisé une double-approche : théorique et expérimentale pour étudier l'interaction de ces peptides avec Fur afin de comprendre le mécanisme d'inhibition. J'ai synthétisé plusieurs séquences peptidiques, montré par des tests biochimiques que certaines inhibaient Fur et déterminé les interactions importantes à l'activité inhibitrice. J'ai obtenu des modèles théoriques des complexes Fur/peptides par amarrage moléculaire, cohérents avec les résultats expérimentaux, qui ont mis en évidence une zone d'inhibition de Fur. Des criblages in silico dans cette zone ont permis de sélectionner de petites molécules, inhibitrices potentielles de Fur et donc intéressantes pour des applications thérapeutiques.

Fur (Ferric Uptake Regulator) est un régulateur transcriptionnel spécifique des bactéries qui intervient dans le contrôle de l'homéostasie du fer, ce qui en fait une cible antibactérienne intéressante. Avant mon arrivée au laboratoire, quatre inhibiteurs interagissant spécifiquement avec Fur avaient été isolés. La partie active de ces inhibiteurs consiste en des peptides de 13 acides aminés. Au cours de cette thèse, j'ai utilisé une double-approche : théorique et expérimentale pour étudier l'interaction de ces peptides avec Fur afin de comprendre le mécanisme d'inhibition. J'ai synthétisé plusieurs séquences peptidiques, montré par des tests biochimiques que certaines inhibaient Fur et déterminé les interactions importantes à l'activité inhibitrice. J'ai obtenu des modèles théoriques des complexes Fur/peptides par amarrage moléculaire, cohérents avec les résultats expérimentaux, qui ont mis en évidence une zone d'inhibition de Fur. Des criblages in silico dans cette zone ont permis de sélectionner de petites molécules, inhibitrices potentielles de Fur et donc intéressantes pour des applications thérapeutiques. / Fur (Ferric Uptake Regulator) is a transcriptional regulator involved in the control of iron homeostasis. Specific to bacteria, Fur is an attractive antibacterial target. Before my arrival in the laboratory, four inhibitors interacting specifically with Fur had been isolated. The active part of these inhibitors consists of peptides of 13 amino acids. In this thesis I have used both theoretical and experimental approaches to study interactions of these peptides with Fur in order to understand the inhibition mechanism. I have synthesized several peptide sequences, shown through biochemical assays that some of them could inhibit Fur and I have identified residues important to the inhibitory activity. I‘ve obtained theoretical models of Fur/peptide complexes consistent with experimental results, which reveal an inhibition pocket in Fur. Small molecules have then been selected though In silico screening of this pocket, that could potentially inhibit Fur, and thus be interesting for therapeutic applications.

La détection de petites molécules est d'un grand intérêt dans les domaines pharmaceutique, environnemental, alimentaire et de la biologie clinique. Les aptamères, sélectionnés par la méthode SELEX (pour Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), sont des oligonucléotides qui se lient à une cible donnée avec une affinité et une spécificité importantes. L'objectif de ce travail est d'établir de nouvelles méthodologies analytiques basées sur l'utilisation des aptamères pour la détection de petites molécules. Dans un premier temps, une méthodologie par électrophorèse capillaire, dérivée du concept de déplacement du brin complémentaire de l'aptamère, est décrite pour la détection simultanée de plusieurs analytes dans un seul capillaire. La deuxième étude se focalise sur le développement d'un aptacapteur colorimétrique simple, rapide et peu coûteux, qui utilise le concept général de protection enzymatique de l'aptamère et les nanoparticules d'or en tant que système de transduction. Enfin, deux méthodes par polarisation de fluorescence, basées sur le concept de déplacement (du brin complémentaire ou de l'aptamère lui-même), sont présentées afin d'accroitre les potentialités des aptacapteurs dédiés à la détection des petites molécules. / Small biomolecule detection is of great interest and importance in the pharmaceutical, environmental, food and clinical fields. Aptamers, selected by SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), are oligonucleotides that bind to a target with high affinity and specificity. The objective of the work is to establish novel methodologies of aptamer-based assays for the small biomolecule detection. In the first work, a rationalized capillary electrophoresis strategy, derived from the structure-switching aptamer concept, is described for the design of simultaneous detection of multiple analytes. The second work based on a gold nanoparticle colorimetric sensing strategy allows a rapid, label-free, homogeneous assay for small molecule using an aptamer enzymatic cleavage protection strategy. In the third work, two aptamer-based fluorescence polarization approaches, using the displacement concept, are described to improve the potentialities of the small molecule-dedicated aptasensors.