Control of retrotransposon expression in the mammalian germline is regulated by Argonaute family PIWI proteins and their associated small non-coding RNAs known as PIWI-interacting RNAs (piRNAs). To date, no study has demonstrated clear PIWI protein expression nor identified a cellular function(s) for PIWI proteins in the mammalian soma. In contrast to the germline-restricted expression of piRNA associated proteins, we observed that Miwi2 mRNA was induced specifically in epithelial cells during pneumococcal pneumonia. Further investigation showed that similar to its mRNA, MIWI2 protein was indeed expressed outside of the mammalian germline, and was localized to the cytoplasm of a discrete population of multiciliated lung epithelial cells. Immunoprecipitation of MIWI2 from whole lung lysates indicated that it was bound to a small RNA that was longer than a traditional piRNA. Microarray analysis revealed that depletion of MIWI2 in a murine epithelial cell line or in a whole animal model had no effect on retrotransposon expression, further suggesting that lung MIWI2 is independent of nuclear piRNA silencing pathways. Under basal conditions, MIWI2 was required for the normal maintenance of airway epithelial cell fate. In fact, Miwi2 deficiency resulted in an increase in club cells and decrease in ciliated cells indicating that MIWI2 could play a primary role in mucociliary homeostasis or clearance. Similarly, as MIWI2 is induced during lung infection we sought to determine if it participated in host innate immune responses to bacterial infection. Using a clinically relevant model of community acquired pneumonia, Miwi2 deficient mice exhibited an increased expression of inflammatory mediators and immune cell recruitment thus leading to enhanced bacterial clearance. Taken together, these data support the notion that MIWI2 exerts piRNA-independent functions outside of the germline in the ciliated lung epithelium to regulate innate immunity during pneumonia. More broadly, these studies shed light on new areas in PIWI protein and lung ciliated cell biology, and may have implications for multiple diseases including cancer, inflammatory disorders, and infectious diseases.

Die Genexpression ist die Voraussetzung für die Proteinbiosynthese in allen Zellen. Eine schnelle und feingesteuerte Kontrolle der Genexpression, die Genregulation, ist dabei als Reaktion auf Umweltveränderungen von großer Bedeutung. Unter Zuhilfenahme von kleinen RNAs spielen die RNA-Interferenz (RNAi) und verwandte Geninaktivierungsprozesse (gene silencing pathways) eine wichtige Rolle bei der Genregulation in Eukaryoten. Die gezielte Abschaltung von Genen durch RNAi wird durch die Erzeugung von kleinen doppelsträngigen RNAs (dsRNAs) in sogenannten RNA-induced-silencing complexes (RISCs) initiiert. Es konnte gezeigt werden, dass ein minimaler H. sapiens Komplex, der RISC -loading -Komplex (RLC), bestehend aus Dicer , Ago2 und TRBP2, in der Lage ist, Vorläufer-RNAs in etwa 21-23 Nukleotid lange dsRNAs zu zerkleinern, diese in ihre Einzelstränge zu trennen, den entsprechenden Führungsstrang auf Ago2 zu laden und eine komplementäre Ziel-mRNA endonukleolytisch zu schneiden. Somit kann dieser minimale Komplex die Verarbeitung der Vorläufer-RNA in kleine dsRNAs durch Dicer mit der Beladung dieser kleinen RNA-Produkte auf Ago2 verbinden/koppeln. Innerhalb des RLC wirken Dicer und Ago2 als Endoribonukleasen, während das dsRNA-Bindungsprotein TRBP2 die Dicer-RNA Komplexe zu Ago2 rekrutiert und für die Beladung der entsprechenden kleinen RNAs in den Komplex und auf Ago2 wichtig ist. Strukturinformationen des RLCs, der Subkomplexe sowie die einzelnen RLC-Proteine sind kaum vorhanden, und über die RNA-Transfermechanismen innerhalb des RLCs ist wenig bekannt. Innerhalb dieser Arbeit wurde ein Expressions- und Reinigungssystem für die einzelnen rekombinanten Proteine etabliert. Die menschlichen Proteine Dicer und Ago2 wurden als N-terminal Hexahistidin markierte Proteine in Sf9- bzw. High Five-Insektenzellen hergestellt, und menschliches TRBP2 wurde als N-terminal GST-markiertes Protein in E. coli BL21(DE3)Star-Zellen exprimiert. Die einzelnen Proteine wurden gereinigt und der RLC präpariert. Der RLC und dessen Komponenten wurden strukturell durch makromolekulare Röntgenkristallographie und Einzelpartikel Elektronenmikroskopie untersucht. Da die Kristallisation von diesem großen und hochflexiblen Komplex während dieser Arbeit nicht möglich war, wurden die Hauptstrukturarbeiten am RLC mit Hilfe von Einzelpartikel Elektronenmikroskopie-Studien durchgeführt. So konnte eine dreidimensionale Struktur des H. sapiens RLCs mit einer Auflösung von 22,8 Å rekonstruiert werden. Diese Rekonstruktion zeigt, dass der RLC eine C- förmige Gestalt mit verschiedenen flexiblen Regionen aufweist. Ein Vergleich mit einer früheren Rekonstruktion des RLC zeigt, dass die in dieser Arbeit bestimmte Struktur des RLC (RNA-gebundener Komplex) eine offenere Konformation einnimmt. Zusätzlich lässt die erreichte höhere Auflösung die Bestimmung neuer struktureller Details, des RLC zu, so dass einzelne Domänen erkennbar sind. Um die RLC-Komponenten innerhalb der hier bestimmten RLC-Rekonstruktion zu lokalisieren, sollten Referenzdichten der Subkomplexe und von Dicer berechnet werden. Aufgrund der hohen Heterogenität der Subkomplexe und von rekombinantem Dicer, waren zuverlässige Rekonstruktionen bisher nicht möglich. Die in dieser Arbeit bestimmte Struktur des humanen RLC und weitere in der Zwischenzeit erlangte biochemische und strukturelle Ergebnisse anderer Gruppen, bedingen ein neues mögliches Modell für die RNA-Transfer–Mechanismen innerhalb des RLCs, welches diskutiert wird.  Das große human Dicer Protein enthält eine N-terminale DExD/H-Helikase Domäne, dessen Funktion noch immer unklar ist. Interessanterweise interagiert diese Domäne mit TRBP2. Mit Hilfe dieser Interaktion wird die Endonuklease-Aktivität von Dicer aktiviert. Um die Wechselwirkung zwischen Dicer und TRBP2 im Detail zu verstehen, wurden in dieser Arbeit zusätzlich zu dem vollständigen Dicer-TRBP2 Komplex, minimale Dicer-TRBP2 Komplexes für strukturelle Analysen präpariert. Ein Atommodell der Interaktionsfläche mit verschiedenen minimalen Dicer-TRBP2 Komplexen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erhalten werden. Es kann aber gezeigt werden, dass dieses Dicer-Fragment die Bindung von TRBP2 zu einzelsträniger RNA vermindert, was auf eine Rolle von TRBP2 bei der Substratwahl von Dicer schließen lässt.  H. sapiens TRBP2 besitzt drei dsRBDs, die für RNA- und Proteinbinding sowie die eigene Homodimerisierung verantwortlich sind. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Kristallstruktur der zweiten dsRNA-Bindungsdomäne (dsRBD2) von TRBP2 gelöst und bis zu einer Auflösung von 2.28 Å verfeinert werden. Die Domäne hat eine typische α-β-β-β-α dsRBD Faltung, wobei die α-Helices gegen eine Seite des dreisträngigen antiparallelen β-Faltblattes packen. Die asymmetrische Einheit enthält vier Moleküle der dsRBD2, die untereinander zwei verschiedene Dimerisierungstellen bilden. Durchgeführte SAXS- und MALS-Messungen zeigen allerdings, dass die dsRBD2 in Lösung als Monomer vorliegt. Die identifizierten Dimerisierungsstellen scheinen daher nur Kristallisationsartefakte zu sein. Die Ergebnisse in dieser Arbeit deuten darauf hin, dass nicht die dsRBD2 allein sondern auch die Loop-Regionen zwischen den dsRBDs von hTRBP2 für die Dimerisierung wichtig sind. Ein Vergleich dieser Struktur mit der zuvor gelösten Struktur der dsRBD2 von TRBP2 im Komplex mit einem kurzen CG-Duplex zeigt, dass RNA-induzierte strukturelle Umlagerungen im Bereich der RNA-Bindungsstellen innerhalb der Domäne möglich sind. Zusätzlich zeigt die ermittelte SAXS Struktur der dsRBD2, dass genau diese Regionen, welche für RNA-Bindungen wichtig sind, sehr flexibel sind und so die Bindung von verschiedenen RNA-Substraten erlauben.

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MicroRNAs are small non-coding RNAs that regulate gene expression through RNA interference. These small RNAs enact gene silencing by forming a RNA-inducing silencing complex together with the effector protein Argonaute. The function of the Argonautes in the social amoeba Dictyostelium discoideum is not yet fully understood. In this study, we look closer at Argonaute B by investigating if it is possible to extract the protein from the cells by the addition of a polypeptide protein tag called 3xFlag. At the same time, we also look into if Argonaute B is important for cell growth. Sequences of the 3xFlag tag with or without the Argonaute B gene (agnB) attached had previously been cloned into a vector and transformed into Dictyostelium discoideum cell. The 3xFlag::agnB sequence was confirmed in wild type and agnB knock-out strains through polymerase chain reaction. We then verified the expression of the fusion protein in the cells by western blot. The cell growth was measured by how the number of cells changed over time. The experiment suggested that Argonaute B is important for growth. Our result show that the construct 3xFlag::agnB sequenced had correctly been transformed into the strains and is highly expressed under tested conditions. We could also see that Argonaute B is an important factor in cell growth.

L'interférence ARN est un ensemble de mécanismes de régulation essentiel pour denombreux processus au cours du développement. Ces mécanismes sont caractérisés par lʼinhibition séquence-spécifique de lʼexpression de gènes via lʼaction de petites molécules dʼARN. Parmi les différentes voies de l'interférence ARN, la voie des trans-acting siRNAs dérivés du précurseurTAS3,qui combine des caractéristiques des voies des miRNAs et siRNAs, est spécifique des plantes et en contrôle divers aspects essentiels du développement. Dans cette voie, AGO7, un membre de la famille des protéines ARGONAUTE, interagit spécifiquement avec miR390 pour cibler et cliver le transcrit TAS3 amorçant ainsi la production de tasiARFs par lʼaction de SGS3, RDR6 et DCL4. Cette voie est conservée chez toutes les plantes terrestres. Par leur activité de répression sur des membres des facteurs de réponse à l'auxine ARF2, ARF3 et ARF4, les tasiARFS contrôlent la transition de phase et la régionalisation des feuilles. Notre laboratoire et dʼautres ont montré que TAS3 était également exprimé dans la racine dʼArabidopsis, posant la question du rôle joué par la voie TAS3dans le développement des racines. Nous avons établi que la voie TAS3, par lʼaction des tasiARFs, joue un rôle essentiel dans le contrôle de la croissance des racines latérales. Nous avons démontré que la voie TAS3 agit en aval de lʼauxine pour maintenir la correcte zone et abondance des facteurs de réponse à l'auxine, ARF2, ARF3 et ARF4. De plus nous avons élucidé un ensemble complexe de rétroactions de ces ARFs sur lʼexpression de miR390. Bien que les mécanismes de la voie TAS3 ont été identifié par divers screen génétiques, notre connaissance de lʼorganisation subcellulaire de cette voie reste essentiellement méconnue. Pour cette raison, nous avons choisi dʼétudier la localisation subcellulaire de la voie TAS3, en nous focalisant sur AGO7 qui en constitue un composant spécifique. Nous avons montré que AGO7, RDR6 et SGS3 sʼaccumulent dans des focicytoplasmiques spécifiques, les siRNA bodies. Nous avons observé une colocalisation entre cessiRNA bodies et des marqueurs des stress granules ainsi qu'une protéine virale associée aux membranes. Finalement nous avons démontré lʼimportance de la localisation cytoplasmique dʼAGO7pour la biogenèse des tasiARFs. Notre travail a permis de mieux comprendre les mécanismes de lʼaction de la voie TAS3 au cours du développement dʼArabidopsis. / RNA silencing is a regulatory mechanism essential for many processes during development. This mechanism is characterized by the sequence-specific inhibition of gene expression by small RNA molecules. Among the several pathways of RNA silencing, the TAS3 trans-acting small interfering RNA (ta-siRNA) pathway, which combines features of both micro (mi)RNA and siRNA pathways, is unique to plants and controls several key aspects of plant development. In this pathwayAGO7, a member of the ARGONAUTE family of RNAse, interacts specifically with miR390 to target and cut the TAS3 transcript, priming it for production of tasiARFs by SGS3, RDR6 and DCL4 action. This pathway is conserved across all land plants. By their repressing activity on Auxin Response Factors members, ARF2, ARF3 and ARF4, the tasiARFs control phase change and leaf patterning. Our lab and others have shown that TAS3 is also expressed in the root of Arabidopsis, raising the question of the role played by the TAS3 pathway in root development. We have shown that theTAS3 pathway, through the tasiARFs action, plays an essential role in the control of lateral rootgrowth. We have demonstrated that the TAS3 pathway acts downstream of auxin, to maintain the proper zonation and abundance of the Auxin Response Factors ARF2, ARF3 and ARF4. In addition,we unravelled a complex set of feedbacks of these ARFs on miR390 expression. Although the mechanisms of TAS3 processing have been identified through various genetic screens our knowledge of the subcellular organization of this pathway remains essentially unknown. For this reason we have chosen to study the subcellular localization of the TAS3 pathway, and focused on AGO7 which represents a specific element of this pathway. We have shown that AGO7, RDR6 and SGS3 accumulate in cytoplasmic foci, dubbed siRNA bodies. We have observed colocalization between these siRNA bodies and markers of the stress granules and a membrane-associated viral protein. Finally we have demonstrated the functional relevance of the cytoplasmic localization of AGO7 for the biogenesis of tasiARFs. Our work has led to a better understanding of the mechanisms underlying the action the TAS3 pathway during the development of Arabidopsis.

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Les microARN jouent un grand rôle dans la régulation de l'expression des gènes bien que leur mécanisme d'action soit encore sujet à débat. Des premières études chez le vers C. elegans aux différents systèmes in vitro qui ont ensuite été développés, plusieurs modèles ont été proposés, comme l'inhibition de la traduction au niveau de l'initiation ou de l'élongation, et la déstabilisation du transcrit par déadénylation. Cependant, à la lumière des découvertes récentes, un consensus semble apparaître et indique que les miARN inhiberaient d'abord la traduction avant d'induire la déadénylation du transcrit, provoquant ainsi sa dégradation prématurée. D'autre part, le blocage traductionnel semble impliquer à la fois la coiffe en 5' et la queue poly(A) en 3' de l'ARNm ainsi que les facteurs qui s'y lient, c'est à dire le facteur d'initiation de la traduction eIF4F et la Poly(A) Binding Protein (PABP). Ces résultats ont conduit au modèle selon lequel, les miARN seraient capables d'empêcher la liaison entre ces deux facteurs et donc la circularisation du transcrit qui est essentielle à la fois au recrutement de la machinerie traductionnelle et à la stabilité de l'ARNm. Afin de mieux comprendre ce mécanisme, notre laboratoire a développé un système in vitro basé sur l'utilisation du lysat de réticulocytes de lapin qui permet d'étudier l'effet traductionnel des miARN en s'affranchissant de dégradation du transcrit. L'étude de l'effet de drogues et d'enzymes virales, capables de bloquer spécifiquement la fonction de chaque facteur d'initiation dans ce système, a permis de déterminer le rôle clé de eIF4G et PABP dans l'inhibition traductionnelle par les miARN. Cependant, leur interaction n'est pas requise et le blocage s'effectue plutôt au cours de l'étape de balayage de la région 5' non codante par la petite sous-unité ribosomique. En parallèle de cette étude in vitro, un travail sur des lignées cellulaires a permis de déterminer l'influence de la queue poly(A) sur l'effet miARN. De façon très surprenante, l'expression des transcrits non polyadénylés n'est plus inhibée et est même stimulée par les miARN. Cet effet est dépendant de l'association du domaine MIF4G du facteur eIF4G avec le facteur eIF3, ce qui suggère qu'en l'absence de queue poly(A), les miARN seraient capables de stimuler le recrutement de la petite sous-unité ribosomique sur l'ARNm. L'ensemble de ces résultats révèle la complexité de l'effet miARN sur la traduction et ouvre de nouvelles voies / The mechanism by which microRNAs (miRNAs) can control gene expression has been a great matter of debate. From the first studies in worm to the in vitro systems that are used today, many models have been proposed that include regulation at the level of translation or at the level of mRNA stability by controlling 3' deadenylation and decay. Recent studies provided a consensus model of all these discrepancies and suggested that translation inhibition occured first and is followed by deadenylation and further degradation of the target transcript. Moreover, translation silencing seems to occur at the initiation level, and requires eIF4F and PABP initiation factors. This led to the hypothesis that miRNAs could interfere with the interaction between these two factors thus affecting the circularisation of the mRNA, which is essential for translation efficiency. In order to gain insight into this mechanism, we have used an in vitro system based on the rabbit reticulocyte lysate that fully recapitulates miRNA effects on translation with virtually no effect on deadenylation and decay. Using this system and a wide spectrum of translational inhibitors, we have narrowed down the step of initiation at which repression is exerted and we found that miRNAs affect mainly ribosomal scanning. This effect requires the presence of both eIF4G and PABP but does not rely on their physical interaction. Further analysis of miRNA repression in cells revealed that the poly(A) tail was an absolute requirement for miRNA action. To most of our surprise, we observed that removal of the poly(A) resulted in a shift from repression to stimulation of mRNA expression. This effect seems to require the middle domain of eIF4G and the presence of the Ago proteins. Altogether, these results reveal the complexity of miRNA effect and open new prospects on translation regulation

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Résumé : Pour se propager dans les cellules de son hôte et évader les réponses immunitaires, les virus végétaux ont développé plusieurs stratégies de défense. Ici, nous avons investigué les structures génétiques du Apple stem pitting virus (ASPV). Nous avons aussi étudié la diversité moléculaire des isolats d’ASPV provenant des poires en regardant les séquences des gènes CP et TGB afin de mieux comprendre les mécanismes évolutionnaires utilisés par ASPV. Nos études ont démontré que les mutations, incluant les insertions et les délétions, la sélection purificatrice et la recombinaison furent des facteurs importants dans l’évolution du l’ASPV en Chine et possiblement mondialement. Comme tous les virus végétaux, l’ASPV se défend contre le RNA silencing de l’hôte grâce à un suppresseur de RNA silencing (VSR) et nous avons montré que le VSR de l’ASPV est la protéine de capside (CP) du virus. Nous avons aussi établi que la diversité moléculaire cause non seulement une variété de symptômes chez son hôte, Nicotiana occidentalis. Cependant elle cause aussi de la variabilité antigénique chez différents isolats, ce qui mène à des écarts de réactivité sérologique entre isolats. Les plantes ont développé plusieurs stratégies pour se défendre contre les virus. Ici, nous avons étudié comment la plante Arabidopsis se défend contre le Tobacco rattle virus (TRV) via le RNA silencing. Nous avons constaté que les phénomènes de susceptibilité, récupération et virus induced gene silencing (VIGS) sont des mécanismes séparables. Nous avons démontré que les protéines AGO2 et AGO4 sont nécessaires à la susceptibilité initiale au TRV, tandis qu’AGO1 est importante pour les VIGS, tandis que la récupération est médiée par d’autres acteurs qui n’ont pas encore été identifiés. Nos résultats suggèrent l’existence de complexes distincts ciblant différentes populations d’ARN viral et cellulaire. De plus, nous avons montré que la répression de la traduction est un mécanisme important durant la récupération de la plante suite à une infection virale, et que les complexes de décoiffage et de RNA processing jouent des rôles importants dans la dégradation des ARNs viraux. Finalement, nous avons montré que les plantes ayant une mutation dans le gène DCP2 présentent un niveaux de VIGS accrue, ainsi qu’une augmentation des niveaux d’ARN viral. Puisque DCP2 fait partie des complexes de décoiffage qui se trouvent dans des granules spécialisés nommés processing bodies (PBs), cela suggère que les PBs jouent un rôle important dans l’élimination les virus. / Abstract : To live in host cells or to escape from host immunity, plant viruses involved a series of defense strategies. Here we investigated Apple stem pitting virus (ASPV) population structures and molecular diversity of ASPV pear isolates based on its function important gene CP and TGB in China, so as to infer the evolution mechanisms of ASPV. Our study showed that mutations (including insertions or deletions), purifying selection, and recombination were important factors driving ASPV evolutions in China or maybe even in the world. And also ASPV defends against it hosts by encoding a VSR. We also showed that ASPV molecular diversity not only induced different biological properties on its herbaceous host N. occidentails but also resulted in antigenic variation of different ASPV CP isolates, which leaded to differences in serological reactivity among rCPs of different ASPV isolates. Plants have developed a series of mechanisms to defend themselves against viruses. Here we how Arabidopsis defend against. We show that virus susceptibility, recovery, and virus induced gene silencing (VIGS) appear to be separable phenomena, with AGO2 and AGO4 playing important roles in the initial susceptibility to TRV, AGO1 playing an important role in VIGS, and as yet unidentifid players mediating recovery. These results suggest the existence of distinct RNA-induced silencing complexes that target different RNA populations within the cell and over time. Furthermore, we showed that translational repression of viral RNA is likely to play an important role in virus recovery and that decapping function plays an important role in clearing viral RNA from the cell. We also showed that a decapping mutant (DCP2) displayed an increased VIGS and virus RNA accumulation, an important role for PBs in eliminating viral RNA.