Fungal exposure had been repeatedly associated with a wide range of harmful health effects. The first association between mould exposure and asthma exacerbations was reported almost 300 years ago and since then, they are numerous data on the link between mould sensitization and asthma severity. Most of the data on fungi and asthma concern A. alternata, C. herbarum and A. fumigatus. However, some mould species are known for their more pronounced indoor tropism and since people tend to increase their time spent indoors, the impact of exposure to these “indoor” species cannot be neglected. In the first part of this work, we developed and validated a dot-blot assay for the detection of mould sensitizations against a panel of species. We worked with the classical A. alternata, C. herbarum and A. fumigatus but in addition, we included indoor-related species such as P. chrysogenum, P. brevicompactum, C. sphaerospermum, C. cladosporioides, A. versicolor and more ubiquitous A. niger, and A. flavus. The development of such an assay allowed us to detect sensitizations against species that are not routinely investigated or not available for testing with classical methods such as skin prick tests or CAP tests. In addition, to cope with cross-reactions, a well-described phenomenon with regard to response against moulds, we developed and validated the concept of “major sensitization”, defined as the antigenic response with the highest difference as compared to the variation of response of the negative control. As there are few data on mould sensitization in healthy individuals, the dot-blot assay was used in a large cohort of healthy subjects. The most frequent sensitizations were observed against A. alternata, A. flavus and A. niger and the commonest “major sensitizers” were A. niger and A. alternata. Of note, in this cohort, no “major sensitization” against A. fumigatus was detected while “major sensitization” against a group of species more specifically linked to the indoor environment (Penicillium spp, A. versicolor, C. cladosporioides) reached more than 25.1% of all sensitizations.These findings were quite surprising and since our laboratory had previous expertise with mouse-model of A. alternata-induced asthma, we investigated the inflammatory and allergenic properties of several fungal species to determine if they display different inner inflammatory potential. Six species were included in the panel A. alternata, A. fumigatus, C. cladosporioides, C. sphaerospermum, A. versicolor and P. chrysogenum. Results showed real differences between moulds and while the classification is not clear-cut, A. fumigatus or P. chrysogenum triggered a typical pro-Th2 response, A. alternata and C. sphaerospermum rather induced a neutrophilic inflammation and A. versicolor and C. cladosporioides induced a mixed Th2/Th17 response. In parallel, the sensitization rates and profile were also investigated in a group of mould-sensitized asthmatics and they both differed notably with the healthy cohort. Indeed, in asthmatic patients, the two most frequent major sensitizations were against A. fumigatus (32%) and A. alternata (28%). The last part of the work consisted in a case-control study to evaluate and compare asthma severity markers and indoor mould exposure between the group of mould-sensitized asthmatics (cases) and a group of asthmatics without mould sensitization (controls). Some interesting findings emerged from this study. First, the overall mould contamination (airborne, in settled dust or through visible mould marks) was very high and more than 90% of the visited dwellings were contaminated by at least one mould species/genus (Penicillium spp, A. versicolor, A. fumigatus and C. sphaerospermum) in at least one type of sample (air, dust and visible mould imprints). Of note, overall “indoor mould exposure” was not associated with markers of asthma severity. Second, exposure and sensitization but also sensitization alone to A. fumigatus in asthmatics were associated with asthma severity markers compared to the absence of mould sensitization which confirmed its noxious potential. This contrasted with the absence of significant severity markers associated with other sensitizations. Lastly, we observed a positive link between overall indoor exposure to Penicillium spp and a reduced lung function in asthmatics even in the absence of sensitization. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les maladies allergiques sont en constante augmentation tant en prévalence qu'en gravité. Les mécanismes physiopathologiques connus impliquent l'induction d'une réponse Th2 par les cellules dendritiques, conduisant à une production d'IgE et une inflammation. L'immunité innée a récemment été mise en avant dans le contrôle de l'immunité adaptative, spécifique de l'antigène. Cependant, le rôle des cellules Natural Killer (NK), cellules de l'immunité innée connues essentiellement pour leurs fonctions anti-tumorales et anti-microbiennes, est encore inconnu dans la pathologie allergique. Néanmoins, quelques études ont montré une modification de certaines sous-populations de cellules NK chez les patients asthmatiques allergiques. Le but général du travail de thèse était d'étudier le rôle des cellules NK dans l'asthme allergique. Dans un premier temps, les variations quantitatives et qualitatives des cellules NK, ainsi que l'effet de leur déplétion ont été évalués dans l'asthme expérimental. Dans un deuxième temps, l'effet de CCL18, chimiokine impliquée dans l'asthme allergique, a été étudié sur les cellules NK de sujets non allergiques et de sujets allergiques. Tout d'abord, le premier modèle murin d'asthme expérimental utilisé était celui très largement décrit chez les souris BALB/cByJ, consistant en deux sensibilisations systémiques d'ovalbumine (OVA) et d'alum suivies de trois provocations allergéniques d'OVA par aérosols. Chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA, une augmentation du nombre de précurseurs de cellules NK, mais également du nombre de cellules NK, et plus particulièrement des cellules NK immatures, a été observé dans les ganglions médiastinaux (ganglions drainant les poumons). Celle-ci était accompagnée d'une augmentation du pourcentage de cellules NK ayant incorporé du BrdU. Outre ces variations quantitatives, nous avons également montré que les cellules NK étaient activées. Dans les poumons, le nombre de cellules NK n'était pas significativement modifié chez les souris sensibilisées et challengées à l'OVA comparativement aux souris contrôle. Néanmoins, une diminution non significative du nombre de cellules NK, et plus particulièrement des cellules NK les plus matures chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA a été observée. De plus, comme dans les ganglions médiastinaux, les cellules NK pulmonaires étaient activées. Nous avons ensuite évalué l'effet de la déplétion des cellules NK par administration de l'anticorps anti-ASGM1 avant les provocations allergéniques sur l'inflammation pulmonaire allergique. Chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA, la déplétion en cellules NK diminuait significativement l'éosinophilie dans les lavages bronchoalvéolaires, sans affecter pour autant l'hyperréactivité bronchique et les taux sériques d'immunoglobulines spécifiques de l'OVA (IgE, IgG2a et IgG1) (Article soumis). La déplétion des cellules NK par l'anti-ASGM1 n'étant pas totale (73%), nous avons choisi de reproduire ces expériences chez les souris NKDTR qui expriment le récepteur de la toxine diphtérique dans le promoteur du gène NKp46, permettant la déplétion spécifique et plus efficace (>90%) des cellules NK (Collaboration Pr E Vivier et Dr T Walzer). Ces souris étant de fond génétique C57BL/6, nous avons mis au point un autre modèle de sensibilisation allergique pulmonaire. Les souris ont reçu deux sensibilisations systémiques d'ovalbumine (OVA) et d'alum suivies de deux séries de trois provocations allergéniques d'OVA par voie intranasale. Dans les ganglions médiastinaux, contrairement au modèle précédent, aucune modification du nombre de cellules NK et de la distribution des sous-populations n'a été observée chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA. D'un point de vue phénotypique, chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA, les cellules NK étaient activées et l'expression membranaire du CD107a augmentée témoignant ainsi d'une dégranulation. Dans les poumons, le pourcentage de cellules NK les plus matures était diminué chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA. Les cellules NK pulmonaires étaient également activées et l'expression membranaire de CD107a augmentée. Le pourcentage de cellules NK exprimant l'IFN-g était diminué. Concernant CCL18, cette dernière est une chimiokine produite préférentiellement au niveau du poumon. Dans le laboratoire, il a été montré que la production de CCL18 était augmentée chez les patients asthmatiques, et qu'elle recrutait les lymphocytes Th2 et les basophiles, suggérant le rôle de cette chimiokine dans l'asthme allergique. Notre objectif était d'évaluer la réponse des cellules NK isolées du sang périphérique de sujets allergiques vis-à-vis de CCL18 et de la comparer à celle de sujets non allergiques. Le récepteur de CCL18 étant encore inconnu, nous avons analysé son expression par les cellules NK par la fixation de CCL18 biotinylé. L'étude en cytométrie en flux a révélé que des cellules NK de donneurs allergiques et non allergiques exprimaient un récepteur pour CCL18. De plus, nous avons montré que les cellules NK de sujets allergiques et non allergiques migraient en réponse à CCL18, et ce dans une voie dépendante des protéines G. L'attraction des cellules NK par CCL18 était dépendante du donneur, mais indépendante du statut allergique. Aucune attraction préférentielle d'une sous-population de cellules NK (CD56hi ou CD56lo) par CCL18 n'a été mise en évidence. CCL18 était également capable de stimuler la cytotoxicité des cellules NK de sujets allergiques et de donneurs non allergiques, vis-à-vis des cellules cibles Jurkat. Les réponses étaient variables en fonction du donneur, mais une fois encore étaient indépendantes du statut allergique. Enfin, CCL18 n'induisait pas de production de cytokines (IFN-g et TNF-a) par les cellules NK de sujets allergiques et non allergiques. Au vu de l'ensemble de ces résultats, nous pouvons conclure que les cellules NK de sujets allergiques sont attirées et activées par CCL18 de façon similaire aux cellules NK de sujets non allergiques. En résumé, ces travaux ont permis de montrer que, dans un modèle murin d'asthme allergique, les cellules NK s'accumulent dans les ganglions médiastinaux et semblent réguler l'éosinophilie pulmonaire. Nous avons également montré que les cellules NK de sujets allergiques ne présentaient pas de dysfonctionnement dans la réponse vis-à-vis de CCL18 comparativement aux sujets non-allergiques.

Une cellule dendritique (CD) qui exprime le facteur de transcription GILZ durant l’apprêtement de l’antigène et sa présentation aux cellules effectrices, génère des lymphocytes T régulateurs (LTregs) CD25high Foxp3+ sécréteurs d’IL-10. La production de GILZ est dépendante de l’action des glucocorticoïdes, de l’IL-10 et du TGF-.Nous avons mis en évidence chez l’homme qu’une corticothérapie orale de 48h induit l’expression de GILZ dans les cellules présentatrices de l’antigène circulantes (CPAs) de sujets allergiques. Les CPAs isolées après la corticothérapie génèrent des LTregs CD25high Foxp3+ IL-10+ spécifiques de l’allergène.Nous également constaté in vitro que les mastocytes participent à l’activation des CDs au cours des réactions allergiques en régulant l’expression de GILZ. Les médiateurs d’origine mastocytaire, dont l’histamine, diminuent l’expression de GILZ dans les CDs et altèrent ainsi leur capacité à activer des LTregs. Nous avons identifié le mécanisme par lequel l’histamine diminue l’expression de GILZ dans les CDs humaines. L’histamine inhibe l’activité transcriptionnelle de Foxo3, un facteur de transcription régulant l’expression de GILZ. Enfin, nous avons démontré que des souris transgéniques qui surexpriment GILZ constitutivement dans les CDs sont protégées contre le développement de l’asthme allergique. L’ensemble de ces résultats permet d’envisager de nouvelles stratégies d’immunomodulation dans l’allergie, centrée sur la régulation de l’expression de GILZ dans les CDs. / We previously showed in vitro that DCs with a high level of GILZ activate regulatory T cells (Tregs) whereas DCs with low level of GILZ trigger effector T lymphocytes. Glucocorticoids (GCs), IL-10 and TGF- are potent inducers of GILZ expression. The aim of this thesis is to extend the above findings to induction of tolerance to allergens. Modulation of GILZ expression by DCs should induce allergen-specific Tregs able to inhibit the activation and proliferation of allergen specific T cell clones. In order to validate this concept we demonstrated that:- allergen-specific tolerance can be achieved in allergic patients treated with oral GC through the induction of GILZ expression in their antigen-presenting cells, and the role of allergen-specific Tregs in this effect,- mast cells play a role in the activation of DCs by inhibiting their expression of GILZ and thus their ability to stimulate Tregs against harmless environmental allergens,- GILZ-expressing DCs protect against allergic asthma in a model of transgenic mice over-expressing GILZ in their DCs.The present study supports the concept of an immune regulation of allergic responses through the modulation of GILZ expression by DCs and opens new perspectives in the development of innovative immunotherapies in the treatment of allergic diseases.

Une cellule dendritique (CD) qui exprime le facteur de transcription GILZ durant l'apprêtement de l'antigène et sa présentation aux cellules effectrices, génère des lymphocytes T régulateurs (LTregs) CD25high Foxp3+ sécréteurs d'IL-10. La production de GILZ est dépendante de l'action des glucocorticoïdes, de l'IL-10 et du TGF-.Nous avons mis en évidence chez l'homme qu'une corticothérapie orale de 48h induit l'expression de GILZ dans les cellules présentatrices de l'antigène circulantes (CPAs) de sujets allergiques. Les CPAs isolées après la corticothérapie génèrent des LTregs CD25high Foxp3+ IL-10+ spécifiques de l'allergène.Nous également constaté in vitro que les mastocytes participent à l'activation des CDs au cours des réactions allergiques en régulant l'expression de GILZ. Les médiateurs d'origine mastocytaire, dont l'histamine, diminuent l'expression de GILZ dans les CDs et altèrent ainsi leur capacité à activer des LTregs. Nous avons identifié le mécanisme par lequel l'histamine diminue l'expression de GILZ dans les CDs humaines. L'histamine inhibe l'activité transcriptionnelle de Foxo3, un facteur de transcription régulant l'expression de GILZ. Enfin, nous avons démontré que des souris transgéniques qui surexpriment GILZ constitutivement dans les CDs sont protégées contre le développement de l'asthme allergique. L'ensemble de ces résultats permet d'envisager de nouvelles stratégies d'immunomodulation dans l'allergie, centrée sur la régulation de l'expression de GILZ dans les CDs.

L’asthme est répandu chez 250 millions de personnes dans le monde, dont la majorité souffre d’asthme allergique à médiation IgE. La diaphonie neuro-immune a récemment fait l’objet d’études approfondies. La présente thèse comprend des études sur des modèles de souris, y compris nos travaux publiés portant sur l’interaction neurone sensoriel-cellule B, un manuscrit soumis sur l’interaction neurones pruricepteurs vagaux-basophiles, ainsi que nos méthodes de recherche publiées sous forme de chapitre de livre. Dans le chapitre 1, nous avons démontré que la perte de fonction des neurones sensoriels atténuait l’inflammation allergique des voies respiratoires induite par les acariens et l’activation des cellules IgE+ B. Les données in vitro suggèrent que l’activation des lymphocytes B et la production d’anticorps étaient améliorées par la substance P. Dans le chapitre 2, nous avons démontré que les neurones sensoriels vagaux répondent aux pruritogènes, à l’analogue du LPA xy-17, à la β-alanine et à la chloroquine, suggérant que le pruricepteur-comme le comportement de certains neurones sensoriels vagaux, comme le prédisent les récents résultats de séquençage d’ARN unicellulaire. Plus important encore, nous avons démontré que l’oncostatine M est produite par les basophiles sous stimulation basée sur FcεRI et peut sensibiliser plusieurs populations sensorielles vagales, y compris les sous-ensembles jugulaires TRPV1+Tac1+ et MrgprA3+. Enfin, dans le chapitre 3, nous illustrons les méthodes détaillées d’étude des neurones sensoriels vagaux, y compris les approches génétiques et pharmacologiques de perte de fonction, et l’analyse transcriptomique des neurones sensoriels vagaux issus du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Prises ensemble, nos données suggèrent que les neurones sensoriels peptidergiques participent à l’établissement de l’immunité humorale et que les neurones pruricepteurs vagaux répondent aux médiateurs inflammatoires allergiques, y compris la cytokine amplificatrice des démangeaisons, l’oncostatine M, produite par les basophiles activés par FcεRI. Des études supplémentaires sont nécessaires pour déchiffrer le rôle des neurones pruricepteurs vagaux dans la transmission du signal du tronc cérébral, l’inflammation périphérique et la mécanique pulmonaire globale de l’asthme. / Asthma is prevalent among 250 million people globally, the majority of which feature IgE-mediated allergic asthma. The neuro-immune crosstalk has been under intense study recently. The present thesis comprises studies of mouse models, including our published work focusing on sensory neuron-B cell interaction, a submitted manuscript on vagal pruriceptor neurons-basophil interaction, as well as our research methods published as a book chapter. In chapter 1, we demonstrated that loss of function of sensory neurons dampened house dust mite-induced allergic airway inflammation, IgE+ B cell activation. In vitro data suggests that the B cell activation and antibody production were enhanced by substance P. In chapter 2, we demonstrated that vagal sensory neurons respond to pruritogens, the LPA analog xy-17, β-alanine, and chloroquine, suggesting the pruriceptor-like behavior of some vagal sensory neurons, as predicted by recent singlecell RNA sequencing results. Most importantly, we demonstrated that oncostatin M is produced by basophils under FcεRI-based stimulation, and can sensitize multiple vagal sensory populations, including the jugular TRPV1+Tac1+ and MrgprA3+ subsets. Finally, in chapter 3, we illustrate the detailed methods for studying vagal sensory neurons, including the genetic and pharmacological loss-of-function approaches, and transcriptomic analysis of vagal sensory neurons yield from fluorescence-activated cell sorting (FACS). Taken together, our data suggests that peptidergic sensory neurons participate in the humoral immunity establishment and vagal pruriceptor neurons respond to allergic inflammatory mediators, including the itch-amplifying cytokine, oncostatin M, produced by FcεRI-activated basophils. Further studies are needed to decipher the role of vagal pruriceptor neurons in brainstem signal transmission, peripheral inflammation, and overall asthmatic lung mechanics.