La photochimiothérapie extracorporelle (PCE) est une immunothérapie autologue, basée sur la réinjection de cellules photochimiquement modifiées. La PCE a démontré son efficacité dans le traitement des formes avancées du CTCL, dans la GvHD ainsi que dans d’autres pathologies médiées par la présence de lymphocytes T pathogènes (rejets de greffes d’organes, pathologies auto-immunes), sans provoquer d’immunossupression généralisée. Bien qu’utilisée depuis de nombreuses années, les mécanismes d’action de la PCE restent peu connus. L’objectif de ma thèse était de les étudier et de mettre en place un modèle chez la souris pour permettre une optimisation des protocoles cliniques. Deux hypothèses ont été testées pour expliquer l’efficacité de la PCE : la mort « tolérogène » où l’effet obtenu serait lié à la génération de lymphocytes T régulateurs et la mort « immunogène » où l’effet pourrait s’expliquer par la génération de lymphocytes T cytotoxiques.L’utilisation de cellules mononucléées humaines obtenues chez des donneurs sains nous a permis de générer des lymphocytes T alloréactifs activés et de montrer que les lymphocytes T traités PUVA émettaient une partie des molécules dites de danger (DAMPs), décrites comme immunogènes, telles que la Calréticuline ou encore le HMGB1. Ces cellules sont phagocytées par les macrophages et les moDCs, mais ne sont pas capables d’induire leur maturation, ce qui n’engendre donc pas de stimulation du système immunitaire.L’utilisation d’un modèle murin de polyarthrite rhumatoïde (CIA) nous a permis de montrer l’efficacité de la PCE dans le traitement de cette pathologie. De plus, nos résultats montrent que l’efficacité du traitement repose sur la présence de lymphocytes T issus de souris « arthritique » dans l’échantillon traité.En conclusion, les mécanismes d’action de la PCE ne semblent pas être associés au concept de mort immunogène. Le modèle de polyarthrite rhumatoïde induite par le collagène chez la souris permettra de poursuivre l’étude des mécanismes d’action et d’optimisation de la PCE. / Extracorporeal photopheresis (ECP) is an autologous immunotherapy based on the reinfusion of photochemical modified mononuclear cells. ECP efficacy is demonstrated in treatment of CTCL, in GvHD and in others T-cell mediated diseases (organ transplant rejection and auto-immune diseases). ECP does not generate generalized immunosuppression. Although it has been used for years, mechanisms of action of ECP are not totally understood. The objective of my thesis was to study these mechanisms of action and set up a murine model to allow an optimization of the clinical protocols. Two hypotheses have been tested to explain the effectiveness of ECP: “Tolerogenic” cell death where the effect would be related to the generation of regulatory T lymphocytes and "immunogenic" death where the effect could be explained by the generation of cytotoxic T lymphocytes.The use of human mononuclear cells obtained from healthy donors enabled us to generate activated alloreactive T cells and to show that the PUVA-treated T-cells emitted a part of the danger molecules (DAMPs), described as immunogenic, such as Calreticulin or HMGB1. These cells are phagocytosed by macrophages and moDCs but do not induce their maturation, which does not therefore generate any stimulation of the immune system.The use of a murine model of rheumatoid arthritis (CIA) allowed us to show the effectiveness of PCE in the treatment of this pathology. Moreover, our results show that the effectiveness of the treatment is based on the presence of T lymphocytes derived from "arthritic" mice in the treated sample.In conclusion, the mechanisms of action of PCE do not seem to be associated with the concept of immunogenic death. The model of collagen-induced rheumatoid arthritis in mice will allow further study of the mechanisms of action and optimization of PCE.

Le costimulateur inductible (ICOS) est un récepteur costimulatoire des cellules T crucial pour l’immunité humorale. Chez l’humain, une déficience de ICOS est associée à des infections récurrentes dû à des défauts de différentiation des lymphocytes T auxiliaires folliculaires (Tfh) et un manque d’anticorps protecteurs. Paradoxalement, certains patients déficients en ICOS développent des signes d’autoimmunité causés par des autoanticorps. Ces observations sont en accord avec des résultats suggérant que ICOS joue un double rôle dans la promotion des fonctions de cellules T effectrices et de cellules T régulatrices. L’arthrite rhumatoïde (RA) est une maladie autoimmune caractérisée par l’inflammation articulaire et la destruction progressive des os. Dans la première étude présentée au Chapitre 2, nous avons démontré que ICOS est requis pour l’initiation et la maintenance de l’arthrite induite par le collagène (CIA), un modèle murin de la RA. Nous avons démontré que des événements clés de l’initiation de la CIA incluant la production d’anticorps contre le collagène et la prolifération de cellules T inflammatoires sont dépendants de la voie de signalisation ICOS-PI3K. Aussi, nous avons trouvé que la signalisation par ICOS-PI3K promouvoit le maintien de la CIA. De plus, nous avons établi que l’inhibition de la glycolyse réduit la sévérité de la CIA, ce qui suggère un chevauchement entre la signalisation ICOS-PI3K et le métabolisme du glucose dans la pathogenèse de l’arthrite autoimmune. Dans la deuxième étude présentée au Chapitre 3, nous avons utilisé des souris dont les cellules T régulatrices sont déficientes en ICOS (ICOS FC) pour évaluer l’impact de ICOS dans les cellules Tfr. Nous avons trouvé que les souris ICOS FC possèdent un taux réduit de cellules Tfr, mais aucune diminution des cellules T régulatrices (Treg) précurseurs. De plus, les souris ICOS FC ont un taux élevé de cellules B du centre germinatif (GC) non-spécifiques ainsi qu’une production accrue d’anticorps anti-nucléaires. Nous avons aussi observé une perturbation des réponses anti-virales et de la production d’anticorps spécifiques dans les souris ICOS FC ce qui suggère des rôles non-régulateurs pour les cellules Tfr. Nous avons effectué une analyse de transcriptome de cellule unique avec des Tregs et nous avons observé une accumulation de précurseurs de Tfr dans les souris ICOS FC, ce qui suggère un défaut de la transition Treg à Tfr. Nos données suggèrent que ICOS participe à la différentiation des cellules Tfr en régulant KLF2 et NFAT2, ce qui contribue à l’établissement de traits folliculaires. En résumé, nous avons démontré que ICOS promouvoit le développement de l’arthrite autoimmune en soutenant les fonctions des cellules T inflammatoires par la voie de signalisation ICOS-PI3K. De plus, nos résultats prouvent que ICOS peut prévenir la production d’autoanticorps en supportant la différentiation des cellules Tfr. Notre travail contribue à l’avancement des connaissances en ce qui concerne le rôle double de ICOS dans l’immunité cellulaire et humorale et fournit des paramètres importants à considérer lors de la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques. / The inducible costimulator (ICOS) is a T cell costimulatory receptor crucial for humoral immunity. In humans, ICOS deficiency is associated with recurrent infections due to defects in T follicular helper (Tfh) differentiation and lack of protective antibodies. Paradoxically, some ICOS-deficient patients were found to exhibit signs of antibody-mediated autoimmunity. These observations are congruent with findings suggesting that ICOS plays a dual role in promoting T effector and T regulatory cell functions. Due to this ambivalence, the role of ICOS in autoimmunity remains unresolved. Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease characterized by joint inflammation and progressive bone destruction. The number of ICOS+ T cells in the synovial tissues of RA patients was found to be elevated, suggesting a potential involvement of ICOS signaling in the pathogenesis of RA. In the first study presented in Chapter 2, we showed that ICOS is required for the initiation and maintenance of collagen-induced arthritis (CIA), a murine model of RA. We found that key CIA initiation events such as anti-collagen antibody production and inflammatory T cell proliferation were dependent on ICOS-PI3K signaling. Further, we found that ICOS-PI3K signaling promotes maintenance of established CIA. Additionally, we show that glycolysis inhibition ameliorates CIA, thus suggesting potential overlaps between ICOS-PI3K signaling and glucose metabolism in the pathophysiology of autoimmune arthritis. The initiation of autoimmunity depends on the action of autoimmune effector cells, but also on a failure of regulatory cells. Amongst the latter, T follicular regulatory (Tfr) cells are thought to prevent autoantibody production. In the second study presented in Chapter 3, we used regulatory T cell-specific ICOS knockout (ICOS FC) mice to investigate the impact of ICOS signaling in Tfr cells. We found that ICOS FC mice display a significant reduction in Tfr cell numbers, but no depletion of their T regulatory (Treg) precursors. Further, ICOS FC mice exhibited a rise of extraneous germinal center (GC) B cells numbers and increased production of anti-nuclear antibodies. We also observed disruptions of anti-viral responses and antigen-specific antibody production in ICOS FC mice, suggesting non-regulatory roles for Tfr cells. We performed single-cell transcriptome analysis of regulatory T cells and observed an accumulation of Tfr precursors in ICOS FC mice suggestive of a Treg-to-Tfr transition defect. Mechanistically, we found that ICOS participates in Tfr differentiation by regulating KLF2 and NFAT2, thereby contributing to the establishment of follicular T cell traits. In sum, we demonstrate that ICOS promotes the development of autoimmune arthritis by fostering inflammatory T cell responses in a PI3K-dependent manner. In addition, our work shows that ICOS can prevent autoantibody production by supporting Tfr differentiation. Thus, we contribute insights into the dual role of ICOS in the cellular and humoral arms of autoimmunity, providing important parameters to be considered when searching for novel therapeutic targets.

L’Ins(1,4,5)P3 joue un rôle évident dans la signalisation cellulaire :il permet la libération du Ca 2+ des stocks intracellulaires par son action au niveau de récepteurs spécifiques. Pour mettre fin à son action, l’Ins(1,4,5)P3 peut être dégradé par une Ins(1,4,5)P3 5-phosphatase en Ins(1,4)P2, un métabolite inactif. L’Ins(1,4,5)P3 peut aussi être transformé en Ins(1,3,4,5)P4 par une Ins(1,4,5)P3 3-kinase. L’Ins(1,3,4,5)P4 semble posséder des capacités de signalisation propres ou au contraire liées à celles de l’Ins(1,4,5)P3.<p>L’Ins(1,3,4,5)P4 est aussi le point de départ de toute une série d’inositol hautement phosphorylés, dont les rôles ne sont pas clairs. Trois isoformes de l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase existent (A, B et C). Ces isoformes possèdent un domaine catalytique carboxy-terminal bien conservé. Par contre, les domaines amino-terminaux sont spécifiques et leur permettraient d’établir des interactions ou de subir des régulations propres. Pour tenter d’élucider le rôle fonctionnel de l’Ins(1,3,4,5)P4, nous avons généré et analysé des souris déficientes pour les isoformes B et C de cette enzyme.<p>Les souris déficientes pour l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase C ne présentent pas de phénotype évident, ce qui suggère que son rôle n’est pas crucial ou que son absence peut être compensée par une autre enzyme.<p>Les souris déficientes pour l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase B, par contre, présentent une immunodéficience caractérisée par une absence spécifique des lymphocytes T αβ périphériques. Cette absence fait suite à un blocage dans la différenciation du précurseur du lymphocyte, le thymocyte. Les caractéristiques de la signalisation induite par le récepteur de surface (TCR) permettent la sélection des thymocytes, de manière à constituer un pool de lymphocytes T restreints pour le MHC et tolérants pour le soi. Nous avons montré que ces phénomènes de sélection étaient défectueux dans les thymocytes mutants, du fait de leur hyporéactivité à la stimulation par le TCR. Le mécanisme responsable de cette hyporéactivité n’est pas encore élucidé. A première vue, la mobilisation de Ca 2+ ne semble pas altérée dans ces thymocytes mutants en réponse à des stimulations classiques. Cependant, d’autres types de stimulation, se rapprochant plus de celles réellement rencontrées par le thymocyte in vivo, doivent encore être investigués. L’intégrité d’autres voies de signalisation cruciales du lymphocyte T doit aussi être vérifiée.<p>En conclusion, l’isoforme B de l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase et l’Ins(1,3,4,5)P4 qu’il produit jouent un rôle crucial dans la différenciation du thymocyte, par un mécanisme qui reste encore à déterminer. / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'apoptose lymphocytaire joue un rôle essentiel dans le contrôle de la réponse immunitaire et de la prolifération cellulaire. De nombreuses voies interviennent dans sa régulation, dont certaines dépendantes de l’oncogène RAS. Un défaut d'apoptose lymphocytaire induit l'apparition de maladies auto-immunes et lympho-prolifératives comme l'Autoimmune LymphoProliferative Syndrome (ALPS). L'ALPS fait suite à des anomalies du principal récepteur membranaire de mort FAS, pivot de l'apoptose lymphocytaire. Le RAS-Associated Lymphoproliferative Disease (RALD) est une entité décrite récemment, se rapprochant de l'ALPS par la symptomatologie et la physiopathologie sous-jacente. Cependant, dans le RALD, le défaut d'apoptose lymphocytaire n’est pas lié à des mutations de FAS mais à une hyperactivation de la voie RAS, mettant ainsi en lumière le rôle essentiel de cette voie dans la régulation du processus en question. Dans les Leucémies Myélo-Monocytaires Juvéniles Chroniques (JMML), les mêmes mutations que celles observées dans les RALD sont trouvées, sur les mêmes populations cellulaires. Il existe une hétérogénéité clinique et biologique au sein des JMML, certaines étant indolentes (LS-JMML) et d'autres sévères (S-JMML). A cette hétérogénéité au sein même des JMML s'ajoute celle observée entre JMML et RALD. L'objectif de ce travail a été de comprendre les tenants des différences phénotypiques observées, au travers du scope de l'apoptose des lymphocytes T activés, en comparant les trois entités résultant de mutations activatrices de RAS dans des cellules pluripotentes hématopoïétiques : RALD, LS-JMML et S-JMML. Nous rapportons des conséquences distinctes pour des mutations identiques ou équivalentes, avec différentes voies de l'apoptose touchées, différenciant les phénotypes induits. Ce travail a permis de démontrer que l’hyperactivation de la voie RAS seule n’entraîne pas nécessairement une dérégulation de la réponse immunitaire T. Des événements additionnels aux mutations présentes sont nécessaires au développement des symptômes. Ces événements ont bien des conséquences sur l'apoptose lymphocytaire, au niveau post-traductionnel, qu’ils concernent la voie RAS ou non. Les différences observées entre les trois phénotypes sur le plan expérimental pourraient être une aide au pronostic. De plus, ce travail ouvre la voie à l'identification en détails des facteurs additionnels et voies défaillantes et permettrait ainsi d'obtenir des thérapeutiques spécifiques actuellement inexistantes. / Lymphocytes apoptosis is essential in maintaining homeostasis and avoiding abnormal proliferation. When defective, autoimmune diseases as the Autoimmune LymphoProliferative Syndrome (ALPS), due to mutations of the death receptor FAS, can occur. Several pathways are important actors influencing the apoptosis cascade, including the RAS proto-oncogene signaling. The RAS Associated Lymphoproliferative Disease (RALD) is a newly described entity, similar to ALPS but with RAS mutations instead of FAS mutations, enlightening the primary role of RAS in apoptosis regulation. Interestingly, the same RAS mutations as observed in RALD are also the cause of a malignant proliferation, the Juvenile Myelo Monocytic Leukemia (JMML). In the case of JMML, RAS mutations can lead either to a mild (LS-JMML) or a severe (S-JMML) phenotype. Thus, three different phenotypes can be caused by the same oncogenic RAS mutations. In order to better understand and characterize the influence of oncogenic RAS mutations in lymphocytes’ apoptosis we studied it in patients presenting with RALD, LS-JMML and JMML. We showed that isolated RAS hyperactivity is not sufficient to induce an immune deregulation. Additional factors are required to do so. These factors influence both mitochondrial and extrinsic apoptosis pathways at a post-transcriptional level. They are due to probable genetic events, and their identification can lead to new therapeutic strategies. Furthermore, activated lymphocytes’ in vitro apoptosis assessment can help differentiating the three phenotypes and thus facilitate prognosis prediction.