Les bactériophages sont des maîtres manipulateurs, prenant le contrôle complet d'une cellule bactérienne, contournant les systèmes de défense et détournant la machinerie de transcription et de traduction du génome bactérien pour la réplication virale. Les grandes étapes de la multiplication des phages sont connues, pourtant les mécanismes intrinsèques de cette prise de contrôle restent un mystère bien préservé. Malgré la petite taille et la simplicité relative des génomes de phages, seuls les gènes associés à la structure des virions sont amplement caractérisés. Toutefois, les protéines non structurales qui sont susceptibles d'être responsables de la prise de contrôle sont rarement étudiées. C'est effectivement le cas pour le phage modèle 2972, infectant la souche Streptococcus thermophilus DGCC7710 largement utilisée en industrie laitière. Son génome code pour 44 protéines putatives, dont 14 protéines sont classées comme étant non structurales et dont aucune fonction n'est encore associée. Lors de ce projet de maîtrise, le système CRISPR-Cas de type II-A, naturellement présent chez S. thermophilus, a été utilisé à des fins d'édition du génome de ce phage pour étudier le rôle des protéines non structurales. Ce système est idéal pour les manipulations génétiques des phages virulents généralement complexes à modifier. Ainsi, une connaissance approfondie des interactions entre le phage et son hôte sera un outil indispensable pour développer de meilleures méthodes de contrôle des phages en industrie laitière. / Bacterial viruses are master manipulators of bacterial cells. They are able to take complete control of a bacterium, bypassing bacterial immune systems, hijacking core transcription and translation machinery, and typically resulting in lysis of the host. Although the major steps of phage replication are well understood, very little is known about the mechanisms of the host-cell takeover. Despite phages having relatively small and 'simple' genomes, generally only the structural proteins have been well characterized. In contrast, non-structural proteins, which include those involved in host cell takeover, tend to be completely uncharacterized. This is certainly the case for the model of Streptococcus thermophilus phages, 2972, which infects the strain DGCC7710 widely used by the dairy industry. Its genome encodes for 44 putative proteins, 14 of which are non-structural and have no known function. In this master thesis, the type II-A CRISPR-Cas system naturally present in S. thermophilus was used for genome engineering purposes to investigate the role of non-structural proteins of phage 2972. This natural bacterial immune system provides an ideal means for genetic manipulation of virulent phages, which are otherwise intractable. This could lead to potentially valuable discoveries allowing us to further fine-tune the bacteria used in various biological processes.

Streptococcus thermophilus est la seconde bactérie lactique la plus utilisée en transformation laitière. Comme toutes les bactéries, elle peut être infectée par des virus appelés bactériophages ou phages. Les phages représentent un risque significatif en transformation laitière puisqu'ils sont ubiquitaires et peuvent mener à des produits fermentés de qualité inférieure. L'étude de la biologie des phages lactiques et de leurs mécanismes de réplication est nécessaire à la prévention et au contrôle de leur prolifération dans les procédés industriels. En général, les gènes viraux qui sont exprimés dès le début de l'infection sont les plus susceptibles d'encoder des protéines qui interagissent avec des composantes de la bactérie. Chez le phage 2972, plus de la moitié de ces gènes dits précoces n'ont pas de fonction connue. Le principal objectif de cette maîtrise était donc de débuter la caractérisation des protéines virales encodées par certains de ces gènes. Puisque la nature du ou des partenaires d'interaction d'une protéine est souvent directement liée à la fonction de cette dernière, nous avons travaillé au développement de méthodes servant à investiguer les interactions protéine-protéine entre le phage 2972 et sa souche hôte S. thermophilus DGCC7710. Les méthodes adaptées sont basées sur la purification d'affinité avec les étiquettes de type Strep-III® ou s'inspirent de la méthode du BioID. Pour la réalisation de certaines approches, le phage 2972 a dû être modifié génétiquement à l'aide du système CRISPR-Cas de type II-A naturellement présent chez sa bactérie hôte. La caractérisation de quelques-uns de ces phages modifiés génétiquement nous a permis de vérifier ou de formuler des hypothèses qui concernent les relations phage-hôte et la résistance aux phages chez S. thermophilus. L'extraction du protéome bactérien est une étape importante dans l'étude des interactions protéine-protéine. La lyse de notre bactérie modèle, soit DGCC7710, a représenté un défi inattendu dans le développement de notre méthode. En effet, cette bactérie à Gram positif s'est avérée résistante à plusieurs techniques standard de lyse. Toutefois, nous avons démontré que les endolysines, des enzymes utilisées par les phages pour lyser la bactérie en fin d'infection, peuvent être purifiées et utilisées pour la lyse de la souche DGCC7710. Finalement, nous avons travaillé à résoudre la structure de différentes protéines de fonction inconnue du phage 2972 par cristallographie à rayons X. Bien que la structure d'aucune des protéines à l'étude n'ait encore été résolue, nos essais laissent croire qu'une protéine précoce de 2972 interagit avec des acides nucléiques. / Streptococcus thermophilus is one of the most widely used bacterium in the dairy transformation industry. This bacterium is primarily used in the production of yogurt and speciality cheeses such as mozzarella. Like all bacteria, strains of S. thermophilus can be infected by bacterial viruses commonly known as bacteriophages or phages. Phages are ubiquitous and represent a significant risk for the dairy industry as they can greatly impact the quality of fermented dairy products. The study of phage biology is crucial for the development of efficient phage control methods in dairy factories. In general, early expressed phage genes encode viral proteins that are the most likely to interact with host molecules. More than half of such early expressed genes encode proteins of unknown function in lactic phage 2972. The main objective of this thesis was to investigate the function of some of these viral proteins. Because the nature of the binding partner of a given protein often reflects its function, we are developing methods based on affinity purification for the study of protein-protein interactions between the phage 2972 and its host S. thermophilus DGCC7710. Our methods are based on affinity purification with Strep-III® tags or inspired from BioID. In order to achieve some of our objectives, we genetically modified the genome of phage 2972 using the endogenous type II-A CRISPR-Cas system of DGCC7710. The characterization of some of these genetically modified phages gave us insights on phage-host relationships and phage resistance in S. thermophilus. In developing our methods, the proteome extraction of S. thermophilus cells were surprisingly challenging. Indeed, this Gram-positive bacterium was resistant to many standard lysis techniques. Here, we show that purified phage endolysins are very efficient in lysing the strain DGCC7710. Endolysins are phage enzymes that lyse their bacterial host at the end of the phage lytic cycle. Finally, we worked on solving the structure of different proteins of unknown function encoded in the genome of phage 2972 by X-ray crystallography. While we have yet to solve any structure, we observed that one of the early-expressed protein of phage 2972 interacts with nucleic acids.

Pour bien comprendre et contrôler les aérosols contenant des virus (viroaérosol), un modèle de laboratoire approprié est requis. Pour cette étude, trois bactériophages : P008 couplé au SYBR Gold, PP01 exprimant la GFP et ʎ exprimant la EYFP ont été comparés entre eux et à des microsphères fluorescentes non-biologiques pour leur potentiel en tant que modèle de laboratoire en aérovirologie. Les modèles viraux ont été aérosolisés à partir d’un tampon de phage en utilisant un nébuliseur de TSI (modèle 9301) connecté à une chambre d’aérosols. La taille aérodynamique des aérosols ainsi que leur distribution ont été déterminées à l’aide d’un spectromètre de particules aérodynamique (APS, TSI modèle 3321). Les échantillons de viroaérosols ont été capturés à l’aide d’un impacteur Andersen à six étages contenant soit du tampon de phage à l’intérieur des plaques de chaque étage ou un milieu solide (agar à 1.5%). Les techniques des plages de lyse, du qPCR et la microscopie à fluorescence ont été utilisées pour quantifier les virus récupérés sur les étages de l’impacteur. La microscopie à fluorescence a aussi été utilisée pour quantifier et analyser les modèles viraux sur des particules seules et sur milieu solide. L’ADN viral, des plages de lyse ainsi que des particules fluorescentes ont été observées sur les étages 3 à 6 de l’échantillonneur ce qui corrélait avec les données obtenues par l’APS. La microscopie à fluorescence a permis de visualiser les modèles viraux sur ou à l’intérieur des particules d’aérosols. Ces résultats confirment que les virus peuvent être présents dans l’atmosphère sous forme d’aérosol dont la dimension est bien plus grande que celle de leur propre taille, et que les virus en aérosol peuvent être quantifiés et observés en utilisant la microscopie à fluorescence. L’ensemble de ces résultats suggèrent qu’un bactériophage fluorescent serait un excellent modèle de laboratoire pour étudier le comportement des virus dans l’air. / In order to understand and control virus aerosols (viroaerosols), an appropriate laboratory model is required. In this study, fluorescent bacteriophages P008 coupled to SYBR Gold, PP01 expressing GFP and ʎ expressing EYFP were compared to non-biological fluorescent microspheres for their potential as viral models in aerovirology. The test viruses were aerosolized in phage buffer using TSI’s 9301 model atomizer attached to a commercially available aerosol chamber. The aerodynamic particle size distribution of the viroaerosols was determined with an aerodynamic particle sizer (APS, TSI’s 3321 model). Samples were collected with a Sixstage Andersen impactor loaded with Petri dishes containing either phage buffer or a solid 1.5% agar medium. Plaque assays, qPCR and fluorescence microscopy were used to quantify the virus load on each stage of the impactor. Fluorescence microscopy was also used to quantify and analyze single aerosol particles in liquid or solid media. Viral DNA, infectious particles and fluorescent particles were detected on stages 3 to 6 of the sampler and correlated with the aerodynamic particle distribution. Fluorescence microscopy permitted visualization of viruses on or encapsulated inside aerosol particles and on a solid medium. These results confirm that viruses may be present in the atmosphere as aerosols, which are much larger than their own particle size, and that viruses could be visualized and quantified in aerosols using fluorescence microscopy. These findings suggest that a fluorescence-expressing bacteriophage would be an excellent laboratory model for the study of viruses in aerosols.

Depuis des décennies, l’ingestion d'aliments contaminés par Listeria monocytogenes est le principal vecteur reconnu d’éclosions de listériose et de cas isolés recensés à travers le monde, conduisant à des risques importants de mortalité. La création d'un bio-assainisseur spécifique et naturel pour lutter contre ce pathogène représente une solution de contrôle mettant à profit la lutte biologique entre les listériaphages et leurs bactéries hôtes. Cette thèse de doctorat est divisée en deux volets : formuler un phagoassainisseur capable d'éradiquer L. monocytogenes infectant divers matériaux (acier inoxydable et polypropylène) et développer une technique de production de phages simple, efficace et sécuritaire favorisant leur utilisation à l'échelle industrielle. L'étude consistait d'abord à monter une banque de listériaphages à large spectre d'action et à étudier leur effet lorsqu'en contact avec différentes souches de Listeria. Diverses formulations de phagoassainisseurs à base de listériaphages (phages individuels, phages multiples et mélanges de phages et d'ammonium quaternaire) ont été élaborées, comparées et évaluées afin de sélectionner les combinaisons les plus efficaces. Les résultats obtenus ont démontré a posteriori que l'utilisation de listériaphages comme assainisseurs de surfaces solides est aussi efficace que l'emploi d'une solution de 20 ppm d'ammonium quaternaire. La méthode de production de phages par immobilisation de bactéries dans des billes d'alginate a permis des amplifications phagiques, via des Listeria incluses, comparables à l'utilisation de cellules libres comme substrat de production. Du fait que les phages ont la capacité de détruire les Listeria dans les aliments et sur les surfaces, leur production en continu pourrait donc renforcer leur utilisation dans le secteur agroalimentaire. La nécessité d’élaborer des formulations d’antimicrobiens à base de phages ainsi que des moyens de production applicables à une grande diversité de phages devient un enjeu incontournable puisque les preuves expérimentales de leur efficacité dans la lutte contre les bactéries pathogènes sont croissantes et les besoins, de plus en plus pressants. / For decades, ingestion of foods contaminated by Listeria monocytogenes has been known as the main vector of listeriosis outbreaks worldwide, with high risks of mortality. The design of a phage-based sanitizer against this specific bacterial pathogen would represent a unique and natural way to reduce the risk of food poisoning, thereby increasing food safety. This PhD thesis was subdivided in two objectives: the formulation of a bio-disinfectant able to eradicate L. monocytogenes on solid materials (such as stainless steel and polypropylene) and the development of a simple, safe and efficient listeriaphage production technique which could be used on an industrial scale. First, a bank of phages was collected and used to study their efficacy against a panel of diverse Listeria strains. Then, phago-sanitizers with listeriaphages were formulated, compared and evaluated (individually, in phage cocktails and in phage/quatal mixtures) in order to select the most efficient combinations. The results showed that using listeriaphages as solid surface sanitizers was as efficient as using a 20 ppm solution of quaternary ammonium compound. Finally, a production technique by cellular immobilization of host bacteria in alginate beads was developed foreseeing an industrial production of phagosanitizers. The amplification of listeriaphages mediated by bead-immobilized Listeria cells has been at least as efficient as the utilization of free cells as a production substrate. This method offers multiple advantages, including the possibility of continuous production. The listeriaphages capacity to eradicate Listeria populations in foods and on working surfaces, as well as the possibility to produce them in a continuous way, could encourage their utilization, especially in the food industry. The knowledge gain in this work could be applied to other phages as well as other fields related to human and animal health.

Brevibacterium aurantiacum est l'un des principaux micro-organismes utilisés dans la production de fromages à croûte lavée dans le monde. L’utilisation de cette bactérie est dû à sa richesse métabolique, car elle produit des composés soufrés volatils, des pigments caroténoïdes et des enzymes lipolytiques et protéolytiques, qui sont nécessaires à la maturation d’une variété de fromages. Des souches de cette espèce bactérienne sont inoculées à la surface de fromages au cours de l'affinage et sont sensibles à des infections virales. Les bactériophages (phages), virus qui infectent les bactéries, sont omniprésents dans divers écosystèmes. Dans l'industrie laitière, ils sont reconnus pour perturber les procédés de production lors de l'infection de ferments lactiques, mais leur implication sur des fromages présentant des défauts de couleur et de saveur reste à démontrer. Ces anomalies de maturation de fromages à croûte lavée ont conduit à cette thèse. Le premier objectif de cette thèse de doctorat consistait à analyser le génome de la souche industrielle B. aurantiacum SMQ-1335 et qui est aussi sensible à des phages. Le deuxième objectif de la thèse visait à étudier les phages virulents infectant cette souche. D’ailleurs, cette étude rapporte la première description et caractérisation de phages infectant cette espèce bactérienne. Malgré la similitude entre ces phages, des répétitions en tandem d'ADN ont été identifiées dans des génomes viraux et une analyse approfondie a montré que ces segments d'ADN sont répandus parmi les phages. Le troisième objectif visait à étudier l'interaction phage-hôte via l’analyse du génome de souches mutantes insensibles aux phages. En étudiant ces souches mutantes, des gènes potentiellement nécessaires pour l'infection phagique ont été identifiés. Enfin, le quatrième et dernier objectif visait à évaluer l'impact des phages de B. aurantiacum dans la production de fromages à croûte lavée et ce, à l'aide des caillé modèles. À noter que le reclassement de la souche SMQ-1335, avant identifiée auparavant comme Brevibacterium linens, est décrit en annexe de cette thèse. Malgré des décennies d'études sur les phages laitiers, les phages de B. aurantiacum étaient encore inconnus. Mes travaux auront permis le développement d’un protocole reproductible pour isoler ces phages. Ces travaux ont également apporté de nouvelles connaissances sur les interactions phage-hôte et de leur impact dans les fromages affinés en surface. / Brevibacterium aurantiacum is one of the key players in the production of washed rind cheeses produced worldwide. The importance of this bacterium to the dairy industry is due to its metabolic richness, as it produces volatile sulfur compounds, carotenoid pigments, and lipolytic and proteolytic enzymes, which play roles in the maturation of washed rind cheeses .As strains of this species are regularly inoculated on the cheese surface during ripening, there is a significant risk of viral attacks. Bacteriophage (phages), viruses that infect bacteria, are ubiquitous in the cheese environment. In the dairy industry, virulent phages have long been known to disrupt cheese processes by infecting lactic acid bacteria. The recent observations of color and flavor defects in washed rind cheeses suggested that phages may also infect strains of B. aurantiacum. These observations led to this thesis.The first objective of this PhD dissertation was to study the genomics of B. aurantiacum SMQ-1335, an industrial strain used in the production of washed rind cheeses. The second objective of the thesis was to study the diversity and biology of virulent phages infecting this industrial strain. This study was the first report of phages infecting B. aurantiacum. Despite the low diversity of the isolated B. aurantiacum phages, DNA tandem repeats were found in an intragenic region of the viral genomes and extended analysis showed that these DNA segments are widespread among phages. The third objective was to investigate phage-host interactions through the genome analyses of bacteriophage insensitive mutants, which were selected by challenging SMQ-1335 with phage AGM1. Host genes likely necessary for phage infection were identified and may explain why some of these mutants are phage-resistant. Finally, the fourth objective of this thesis evaluated the impact of virulent phages on the production of washed rind cheeses using model curds. Of note, the reclassification of the strain SMQ-1335, long believed to be Brevibacterium linens, is described in the annex of the thesis. Despite decades of studies on dairy phages, B. aurantiacum phages were still unknown. Here, a reproducible protocol to isolate these phages was developed, which may allow the isolation of new phages. This work also led to increased knowledge on phage-host interactions as well as on and their roles in surface-ripened cheeses.

Les génomes de bactériophages ont une capacité remarquable d'évolution. L'objectif de ma thèse a été d'étudier le rôle des recombinases de bactériophages dans cette évolution. Notre hypothèse était que les recombinases phagiques diffèrent de la recombinase bactérienne RecA par une fidélité relâchée lors de la réaction de recherche d'homologie, qui pourrait expliquer en partie la très grande plasticité des génomes de bactériophages. Nous avons tout d'abord utilisé une approche bioinformatique basée sur la recherche d'homologies lointaines pour prédire un maximum de gènes de recombinases dans les génomes entièrement séquencés, puis nous avons confirmé l'activité de recombinaison de certaines d'entre elles, par un test d'appariement d'ADN simple brin entre séquences identiques in vivo. Ceci nous a permis de conclure qu'il existait trois superfamilles de recombinases chez les bactériophages, de type Rad52, Rad51/RecA et Gp2.5, présentes dans 42% des 465 génomes analysés. Dans un deuxième temps, nous avons comparé six de ces recombinases à RecA et avons montré que toutes étaient capables de faire de l'appariement simple brin in vivo, contrairement à RecA. Pour deux d'entre elles, Redβ de Lambda (type Rad52) et Sak4 de HK620 (type Rad51/RecA), nous avons observé que l'appariement simple brin continuait à se produire, avec une efficacité diminuée, jusqu'à 13% de divergence entre les séquences. L'appariement d'ADN simple brin est donc une propriété commune aux recombinases de bactériophages qui les distingue de RecA, et semble pouvoir se maintenir pour un niveau élevé de divergence, ce qui soutient l'hypothèse d'une recombinaison homologue différente et plus relâchée dans sa fidélité chez les bactériophages.

Les génomes de bactériophages ont une capacité remarquable d’évolution. L’objectif de ma thèse a été d’étudier le rôle des recombinases de bactériophages dans cette évolution. Notre hypothèse était que les recombinases phagiques diffèrent de la recombinase bactérienne RecA par une fidélité relâchée lors de la réaction de recherche d’homologie, qui pourrait expliquer en partie la très grande plasticité des génomes de bactériophages. Nous avons tout d’abord utilisé une approche bioinformatique basée sur la recherche d’homologies lointaines pour prédire un maximum de gènes de recombinases dans les génomes entièrement séquencés, puis nous avons confirmé l’activité de recombinaison de certaines d’entre elles, par un test d’appariement d’ADN simple brin entre séquences identiques in vivo. Ceci nous a permis de conclure qu’il existait trois superfamilles de recombinases chez les bactériophages, de type Rad52, Rad51/RecA et Gp2.5, présentes dans 42% des 465 génomes analysés. Dans un deuxième temps, nous avons comparé six de ces recombinases à RecA et avons montré que toutes étaient capables de faire de l’appariement simple brin in vivo, contrairement à RecA. Pour deux d’entre elles, Redβ de Lambda (type Rad52) et Sak4 de HK620 (type Rad51/RecA), nous avons observé que l’appariement simple brin continuait à se produire, avec une efficacité diminuée, jusqu’à 13% de divergence entre les séquences. L’appariement d’ADN simple brin est donc une propriété commune aux recombinases de bactériophages qui les distingue de RecA, et semble pouvoir se maintenir pour un niveau élevé de divergence, ce qui soutient l’hypothèse d’une recombinaison homologue différente et plus relâchée dans sa fidélité chez les bactériophages. / Bacteriophage genomes have a remarkable ability to evolve. The aim of my thesis was to study the role of bacteriophage recombinases in this evolution. Our hypothesis was that such recombinases differ from the bacterial RecA recombinase by a relaxed fidelity during homology search, which may partly explain the high plasticity of bacteriophage genomes. We first used a bioinformatics approach based on remote homology search to predict a maximum of recombinase genes in completely sequenced genomes, and confirmed the recombination activity of some of them by a single-strand DNA annealing assay between identical sequences in vivo. This allowed us to conclude that there were three superfamilies of bacteriophage recombinases, Rad52-like, Rad51/RecA-like and Gp2.5-like, which were present in 42% of the 465 genomes analyzed. In a second step, we compared six of these recombinases to RecA and showed that all were able to anneal single-stranded DNA in vivo, in contrast to RecA. For two of them, Redβ of Lambda (Rad52-like) and Sak4 of HK620 (Rad51/RecAlike), we also observed that they were able to anneal non identical (13% of divergence) single-stranded DNA, with a reduced efficiency. We conclude that the single-stranded DNA annealing is a property common to recombinases of bacteriophages, which is absent in RecA, and seems to tolerate diverged sequences. This supports the hypothesis of a different and more relaxed recombination in bacteriophages.

Propriétés interfaciales des virus, concept de particules molles multicouches, corrélation avec les capacités d'agrégation Hors de leur cellule hôte, les virus se comportent comme des particules biologiques inertes dont le comportement est principalement guidé par les propriétés physico-chimiques dites de surface, en particulier la charge et la balance hydrophile/hydrophobe. A l'heure actuelle, il est impossible de prédire le comportement de virus en arguant uniquement de leur charge de surface. Très récemment, des auteurs proposent que les virus devraient plutôt être assimilés à des particules molles perméables et fortement hétérogènes (Biophysical Journal 94, 2008, 3293) et non de simples sphères dures. L'objectif de ce travail est de caractériser les propriétés interfaciales des bactériophages selon le concept de particules molles multicouches afin de pouvoir les classer/hiérarchiser selon leur réactivité en terme de capacités d'adhésion sur des surfaces abiotiques ou leur agrégation. Les phages ARN F-spécifiques tout comme les virus entériques pathogènes sont constitués d'une capside protéique à l'intérieur de laquelle se trouve un génome à ARN. Dans un premier temps, il a été démontré que les éléments situés à l'intérieur de la capside ont une influence majeure sur les propriétés physico-chimiques en particulier électrocinétiques. En effet, nous avons comparé pour la première fois les propriétés électrohydrodynamiques de phages MS2 avec celles de Virus Like Particles correspondantes (VLPs, particules virales dépourvues de génome) dans différentes conditions de pH et de force ionique. Selon des principes précédemment établis et basés sur un formalisme pour l'électrophorèse de particules molles multicouches, on démontre entre autre que les phages complets portent une charge volumique plus importante que les VLPs. Les profils d'agrégation pour chaque type de particules sont différents avec une survenue de l'agrégation uniquement au point isoélectrique et à faible force ionique pour les VLPs, montrant ainsi l'impact du génome sur les propriétés de stabilité de suspensions virales. Nous avons ensuite caractérisé l'influence de la méthode de purification sur les différences observées de propriétés électrocinétiques et d'agrégation. La confrontation de trois méthodes distinctes révèle que les purifications par dialyse et par gradient de chlorure de césium maintiennent les différences de comportement entre les deux types de particules tandis que la précipitation au polyéthylène glycol atténue ces différences pour ce qui est des caractéristiques électrocinétiques mais les différences persistent au niveau du comportement d'agrégation. Dans une seconde partie nous avons d'une part étudié les propriétés interfaciales de différents virus ARN F-spécifiques (MS2, GA et Qbêta) à structures similaires. Au moyen du concept de particules molles multicouches, nous avons montré que les trois phages présentent une charge électrostatique similaire et leur degré d'hydrophobicité respectif est établi selon la séquence MS2 < Qbêta < GA, GA étant le plus hydrophobe. Ces propriétés ont ensuite été corrélées aux capacités d'adhésion sur des supports industriels (verre, inox, polypropylène) dont les propriétés de surface ont été caractérisées par AFM. L'étude met en évidence l'impact de la rugosité et de l'hydrophobicité des surfaces de dépôt qui tendent à augmenter l'adhésion virale. Des virus à structures multicouches différentes (Phi X 174, PRD1, MS2) ont également fait l'objet d'investigation en termes de propriétés électrocinétiques, d'agrégation et d'adhésion. Les résultats montrent la séquence suivante concernant la charge électrostatique Phi X 174 < PRD1 < MS2 (MS2 étant le plus chargé négativement). Par ailleurs, une corrélation positive entre ces propriétés et les capacités d'adhésion des phages sur des surfaces chargées et des supports strictement hydrophiles ou hydrophobes a été établie. / The aim of this work is to characterize the interfacial properties of phages using the soft multilayer particles concept in order to interrelate appropriately their reactivity and their physico-chemical features. It was demonstrated that the RNA inside the capsid do have a major impact on the physico-chemical properties of the virus, in particular its electrophoretic mobility. We further compared electrohydrodynamic features of MS2 phage with those of the corresponding VLPs (virus particles without RNA). In line with theoretical predictions based on the soft particles concept, it is shown that MS2 are more negative than VLPs. The aggregation profiles of both particles significantly differ demonstrating the major influence of the genome on stability of viral suspensions. We then analyzed the influence of the virus purification method on the observed differences in terms of stability and electrohydrodynamics. We also studied the interfacial properties of phages exhibiting similar structures. It appeared that the phages display similar electrostatic charge while their hydrophobicity degree follows the sequence MS2<Qbeta<GA. These properties were then correlated to adhesion capacities onto industrial substrates whose surface characteristics were addressed by AFM. The results highlight the impact of roughness and hydrophobicity of the deposition surfaces which tend to increase viral adhesion. Viruses with different soft multilayered structures were then investigated with as result the following sequence for the electrostatic charge: Phi X 174<PRD1<MS2. A positive correlation between these properties and adhesion capacities onto charged surfaces and onto hydrophilic or hydrophobic materials has further been established

Bien que les microorganismes pathogènes soient rarement détectés au sein de réseaux de distribution d'eau potable, ils peuvent constituer un danger pour la santé humaine en cas de contamination accidentelle. Le devenir des virus entériques au sein d'un système de distribution d'eau est largement méconnu, alors que de telles informations sont nécessaires pour améliorer les procédures de prise en charge en cas d'incidents. Dans ce contexte, trois bactériophages ARN F-spécifiques, MS2, GA et Q[bêta], ont été utilisés comme modèles des virus entériques pathogènes, dans des conditions expérimentales mimant un système de distribution d'eau. Ce travail visait d'une part à comparer l'accumulation des phages sur des surfaces en polyéthylène haute densité (PEHD) colonisées ou non par des biofilms d'eau potable et d'autre part à évaluer, sur les bactériophages adhérés, l'efficacité de protocoles de nettoyage basés sur une chloration ainsi qu'une augmentation des contraintes hydrodynamiques. En résumé, les différentes vitesses d'eau étudiées n'ont pas conduit à des différences significatives dans l'accumulation des bactéries et des phages sur les surfaces, mais ont toutefois abouti à des concentrations surfaciques en phages significativement supérieures à celles observées en conditions hydrostatiques. Quelles que soient les conditions expérimentales (vitesses d'eau à la surface, présence ou absence d'un biofilm), le bactériophage MS2 présente systématiquement les plus faibles concentrations sur les surfaces. La séquence d'adhésion des trois bactériophages sur biofilms est en accord avec leur séquence d'hydrophobicité. Le protocole de chloration (4 à 5 mg Cl2.L-1) évalué dans cette étude peut être ponctuellement appliqué en cas de contamination de l'eau. Après 60 minutes de chloration, l'abattement est de 0,7 log10 pour les bactéries et il est compris entre 2 et 3 log10 pour les phages adsorbés sur les surfaces, alors qu'aucun phage infectieux n'est plus détecté dans l'eau dès 5 minutes de chloration. Ces résultats soulignent l'effet protecteur du biofilm, même jeune. Enfin, la chloration apparaît être plus efficace que l'augmentation des contraintes hydrodynamiques pour éliminer les bactériophages adhérés aux surfaces / Although pathogens remain widely uncommon in water distribution networks, they may constitute a real threat for human health when accidentally introduced in the system. There is a lack of knowledge about virus behaviour into water distribution systems whereas such information is critical for a better viral risk management. In this context, three F-specific RNA bacteriophages -MS2, GA and Qbeta- were used as models, in experimental conditions mimicking water distribution systems. The purpose of the present work was at first to compare the viral accumulation of bacteriophages on high-density polyethylene (HDPE) colonised or not with drinking water biofilms. The second objective was to evaluate, on phages adsorbed in the biofilm, the efficiency of a cleaning protocol, based on chlorination and increase in the hydrodynamic strengths. To sum up, the water velocities tested in this work had little influence on both the bacterial and virus accumulation on surfaces, but applying a water flow led to an increase in the number of adsorbed phages in comparison with hydrostatic conditions. Whatever the conditions (water velocity, colonisation or not with a biofilm) MS2 phage was found to be the less adherent one. On HDPE colonised with a two-month old biofilm, the adhesion sequence was consistent with the sequence of hydrophobicity of the phages. The chlorination protocol tested in our study (4 to 5 mg CL2/L) can be applied punctually in distribution networks. After 60 minutes of chlorination the log-reduction was about 0.7 log10 for bacteria and between 2 and 3 log10 for bacteriophages, while no more infectious phages were detected in water after 5 minutes. Those results highlight that even two-month-old biofilms provide to viruses a protection against disinfection protocol. At last, the chlorination appears to be more efficient to inactivate viruses adsorbed on surfaces than an increase in the water flow velocity

Les Escherichia coli producteurs de Shiga-toxines (STEC) sont responsables d'infections humaines, allant d'une diarrhée aqueuse bénigne pouvant se compliquer en syndrome hémolytique et urémique (SHU), parfois mortel. La transmission de STEC à l'Homme s'effectue principalement par l'ingestion d'aliments contaminés. Le principal facteur de virulence des STEC est le gène stx (codant la Shiga-toxine), localisé dans le génome d'un prophage. La thèse a été centrée sur les STEC O26:H11, deuxième sérotype à l'origine de SHU dans le monde, et premier retrouvé dans les fromages au lait cru.Le premier objectif était de caractériser génétiquement les STEC O26:H11 et leurs phages Stx (variants du gène stx et sites d'insertion des phages Stx) afin d'identifier d'éventuelles différences entre ces souches selon leur origine. La majorité des souches alimentaires et bovines étudiées possèdent le variant stx1a et leurs phages Stx sont intégrés dans wrbA et yehV. Les souches humaines possèdent les variants stx1a et stx2a en proportions équivalentes. Leurs phages Stx sont aussi intégrés dans wrbA et yehV mais à la différence des souches alimentaires et bovines, le site yecE a été identifié comme site d'insertion. Toutes les souches humaines qui possédaient un phage Stx2a intégré dans wrbA et yecE ont causé des SHU ; ce qui pourrait être un indicateur de haute virulence. Des études ont montré que des souches E. coli Attachant/Effaçant (AEEC) O26:H11 sont isolées à partir d'aliments identifiés comme « stx+ » par PCR. En dehors de l'absence du gène stx, ces souches AEEC sont similaires aux STEC. Leur caractérisation a montré ici que la majorité d'entre elles ont leurs sites d'insertion intacts, caractéristique compatible avec une perte de phage Stx par excision spontanée. La stabilité des phages Stx a donc été évaluée chez les STEC O26:H11. La présence/absence de phages Stx a été quantifiée par PCRq pour chaque souche au niveau de la population bactérienne entière montrant que les STEC ont la capacité de perdre leurs phages Stx. En revanche, cette instabilité n'est pas liée aux sites d'insertion. Plusieurs essais visant à introduire des phages Stx dans les souches AEEC pour les convertir en STEC ont été réalisés mais les résultats ont montré qu'il était difficile d'infecter ces souches. L'étude du taux d'induction des phages Stx in vitro chez les STEC O26:H11 a montré, qu'en présence de mitomycine C, les phages Stx2 étaient plus inductibles que les phages Stx1. En revanche, il n'a pas été mis en évidence de différences en fonction de l'origine des souches testées et du site d'intégration des phages Stx. L'analyse morphologique de quelques phages Stx a montré que le type Stx1 ou Stx2 n'était pas lié à une forme spécifique de phage. L'étude des stress relatifs à la technologie fromagère a montré que le stress salin et le stress oxydatif, lié à la libération potentielle d'H2O2 par d'autres bactéries, entrainaient l'induction des phages Stx. Comme des souches AEEC sont fréquemment isolées à partir d'aliments qualifiés de « stx+» par PCR, le processus analytique d'isolement des STEC a aussi été étudié. La production de phages Stx lors de la phase d'enrichissement semble possible à partir d'un aliment contaminé. En revanche, aucun composant de cette méthode, testé individuellement, n'a pu être identifié comme inducteur des phages Stx. Ces travaux ont permis d'acquérir des connaissances sur la diversité des phages Stx issus de STEC O26:H11 isolées chez l'Homme et dans la filière laitière. Des différences au niveau des variants du gène stx mais aussi des sites d'insertion des phages Stx ont pu être observées en fonction de l'origine des souches. De plus les niveaux d'induction des phages Stx diffèrent selon le variant du gène stx. Ces différences pourraient refléter l'existence de clones distincts, aux potentiels de virulence différents, circulant dans les aliments, chez les bovins et les patients / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) are responsible for human infections, ranging from mild diarrhea to hemolytic-uremic syndrome (HUS), sometimes with fatal outcome. Transmission of STEC to humans occurs mainly through the ingestion of contaminated food. The main virulence factor of STEC is the stx gene (encodes Shiga-toxin) located in the genome of a prophage. The PhD thesis was focused on STEC O26:H11, which is the second serotype causing HUS in the world, and the first one found in raw milk cheeses. The first objective was to characterize genetically STEC O26:H11 strains and their Stx phages (stx gene subtypes and insertion sites of Stx phages) in order to identify any differences between these strains according to their origin. The majority of the investigated food and bovine strains possessed stx1a subtype and their Stx phages were integrated into wrbA and yehV. Human strains possessed the stx1a and stx2a subtypes in equivalent proportions. Their Stx phages were also integrated into wrbA and yehV but unlike food and bovine strains, yecE site were identified as insertion site. All the human strains carrying an Stx2a phage integrated into wrbA and yecE caused HUS, which could indicate a high virulence. Studies showed that Attaching/Effacing E. coli (AEEC) O26:H11 strains were isolated from foods identified as "stx +" by PCR. Except for the absence of stx gene, these AEEC strains are similar to STEC. Their characterization showed, in this study, that the majority of them had intact insertion sites, in agreement with a possible loss of Stx phage by spontaneous excision. The stability of Stx phages was evaluated in STEC O26:H11. Presence/absence of Stx phages was quantified for each strain in the total bacterial population, showing that STEC were capable of losing their Stx phages. However, this instability was not related to the insertion sites. Several attempts to introduce Stx phages in AEEC strains in order to convert them into STEC were conducted but the results showed that it was difficult to infect these strains. The induction rate of Stx phages in vitro in STEC O26:H11 showed that, with mitomycin C, the Stx2 phages were more inducible than Stx1 phages. However no difference was found with the origin of the strains tested and the Stx phage integration site used. The morphological analysis of some Stx phages showed that Stx1 or Stx2 type was not related to a specific phage shape. Study of various stress related to the cheese-making process showed that the osmotic and oxidative stress related to the potential release of H2O2 by other bacteria, led to the induction of Stx phages. Because AEEC strains are frequently isolated from food qualified as "stx+" by PCR, the analytical STEC isolation procedure was studied for its ability to induce Stx phages. Production of Stx phages during the enrichment phase seemed possible from contaminated food. However, none of the components of this method, tested individually, could be identified as an inducer of Stx phages. This work highlighted the diversity of Stx phages from STEC O26:H11 isolated from humans and dairy sector. Differences in stx subtypes and Stx phages insertion sites present among the STEC O26:H11 strains were observed depending on the origin of the strains. Moreover the induction levels of Stx phages differed according to the stx subtypes. These differences might reflect the existence of distinct clones, with varying virulence potential, circulating in foods, cattle and patients