Reproduction de : Thèse de doctorat : Biométrie : Lyon 1 : 2002. / Titre provenant de l'écran titre. 279 réf. bibliogr.

Thèse de doctorat : Procédés biotechnologiques et alimentaires : INPL : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Orientadores: Fabiano Lopes Thompson, Marcelo Brocchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T10:05:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tonon_LucianeAlessandraChimetto_D.pdf: 11157072 bytes, checksum: 9af9fa6e5b1ce542596bb28c5a9bf67e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Microrganismos têm um papel fundamental na saúde de cnidários, estabelecendo relações ecológicas diversas, de parasitismo até mutualismo. O conhecimento acerca da diversidade de procariontes associados com cnidários e corais no Brasil ainda é escasso. Este é o primeiro estudo enfocando a caracterização taxonômica de bactérias heterotróficas incluindo fixadoras de nitrogênio (N2) e especialmente vibrios isolados do muco do coral endêmico Mussismilia hispida e de zoantídeos simpátricos Palythoa caribaeorum, Palythoa variabilis e Zoanthus solanderi da região de São Sebastião-SP, Brasil. Ao todo, foram obtidos 488 isolados bacterianos destes cnidários, empregando-se os meios de cultivo Ágar Marinho (AM), Ágar Fixação de Nitrogênio (NFb) e Ágar Tiosulfato-Citrato-Bile-Sacarose (TCBS). Os cnidários foram coletados em três praias (Grande, Portinho e Preta) na região de São Sebastião em 2005 e 2006. A maioria dos isolados obtidos pertenciam à classe Gammaproteobacteria. Mais da metade foram identificados como vibrios com base em sequências parciais do gene 16S rRNA. Vibrios do grupo core corresponderam a 80 % das bactérias potencialmente fixadoras de N2 e revelaram alta similaridade de sequência no gene pyrH com V. harveyi e V. alginolyticus. Dezenove isolados representativos, pertencentes às espécies V. harveyi, V. alginolyticus, V. campbellii e V. parahaemolyticus foram capazes de crescer 6 vezes sucessivas em meio NFb e alguns deles mostraram forte atividade da nitrogenase pelo teste de redução de acetileno (ARA). Cerca de 150 vibrios isolados em TCBS foram caracterizados por meio de sequências de 16S rRNA, recA e pyrH. Os taxa mais abundantes foram V. harveyi, V. rotiferianus, V. campbellii, V. alginolyticus, V. mediterranei (=V. shillonii), V. chagasii, V. tubiashii e uma espécie nova de Vibrio. Com exceção de V. chagasii que foi encontrado apenas no muco de M. hispida, as demais espécies foram observadas nos diferentes hospedeiros, não havendo fortes evidências da presença de espécies hospedeiro-específicas. A variabilidade intra-específica dos vibrios foi avaliada por meio de padrões de banda de elementos palindrômicos extragênicos repetitivos (rep-PCR). Esta análise revelou alta diversidade genômica entre os isolados. Cada isolado apresentava um padrão de rep-PCR distinto, indicando uma grande diversidade de populações co-existindo no mesmo habitat. As identificações geradas pelo rep-PCR concordaram com as identificações obtidas pelo MLSA (Multilocus Sequence Analysis). Diversos isolados de diferentes grupos microbianos apresentaram menos de 97 % de similaridade em sequências do gene 16S rRNA com espécies conhecidas, indicando que elas seriam possíveis espécies novas. Ao todo, sete espécies novas foram descritas por meio da taxonomia polifásica: Marinobacterium coralli sp. nov., Marinomonas brasilensis sp. nov., Photobacterium swingsii sp. nov., P. jeanii sp. nov., Vibrio communis sp. nov., V. variabilis sp. nov. e V. marinum sp. nov. Os dados fenotípicos, quimiotaxonômicos, genotípicos e filogenéticos obtidos a partir da descrição das sete espécies novas demonstraram que há uma ampla variabilidade fenotípica intra-específica. Este estudo determinou a identidade dos principais grupos de bactérias cultivadas do muco de corais, sobretudo, os vibrios. Uma das espécies de vibrios mais abundantes no muco dos corais é V. communis sp. nov. A fixação de N2 representa um fenótipo comum entre as espécies de vibrios estudadas, sugerindo uma função positiva no holobionte. / Abstract: Microorganisms have a key role in the health of cnidarians establishing ecologic relationships, of parasitism to mutualism. The knowledge on the diversity of prokaryotes associated with corals in Brazil is very limited. This is the first study on the taxonomic characterization of heterotrophic bacteria, including putative N2-fixing and specially vibrios isolated from mucus of endemic coral Mussismilia hispida and the sympatric zoanthids Palythoa caribaeorum, Palythoa variabilis and Zoanthus solanderi. Cnidarian specimens were isolated in the beaches Grande, Portinho and Preta from São Sebastião region, SP, Brazil, in 2005 and 2006. A total of 488 isolates were obtained using different culture media, i.e. Marine Agar (MA), Nitrogen Fixation (NFb) and Thiosulphate-Citrate- Bile-Sucrose Agar (TCBS). The majority of the isolates fell within the class Gammaproteobacteria and more than half of them were vibrios based on 16S rRNA gene sequences. Based on pyrH gene sequences 80 % of the putative N2-fixing bacteria clustered with the Vibrio core species group (i.e. V. harveyi and V. alginolyticus). Nineteen representative isolates of V. harveyi, V. alginolyticus, V. campbellii and V. parahaemolyticus) were capable of growing six successive times in nitrogen-free medium and some of them showed strong nitrogenase activity by means of the acetylene reduction assay (ARA). About 150 vibrios isolated on TCBS were characterized by means of 16S rRNA, recA and pyrH gene sequences. The most abundant taxa were V. harveyi, V. rotiferianus, V. campbellii, V. alginolyticus, V. mediterranei (=V. shillonii), V. chagasii, V. tubiashii and a new Vibrio species. With the exception of V. chagasii which was found only in the mucus of M. hispida, the other species appeared in different hosts with no strong evidence for the presence of host-specific species. A high genomic diversity was observed using rep-PCR. Each vibrio isolate represented a different co-occuring population, suggesting huge intra-especific diversity. There was a complete agreement between the grouping based on rep-PCR and identification based on MLSA (Multilocus Sequence Analysis). Several isolates had less than 97 % similarity towards know species based on 16S rRNA gene sequence, indicating that they are possibly new species. In total, seven new species were described based on polyphasic taxonomy: Marinobacterium coralli sp. nov., Marinomonas brasilensis sp. nov. Photobacterium swingsii sp. nov., P. jeanii sp. nov., Vibrio communis sp. nov., V. variabilis sp. nov. and V. marinum sp. nov. The new species were characterized by polyphasic taxonomy. Based on phenotypic, chimiotaxonomic, genotypic and phylogenetic data obtained from description of new species, it was demonstrated a huge intra-specific phenotypic variability. This study determined the taxonomic identity of heterotrophic bacteria, especially Vibrio, isolates from cnidarians. V. communis sp. nov. is one of the most frequently found species in the corals. Nitrogen fixation is a common phenotypic trait among vibrios, suggesting that these bacteria may have a positive function in the holobiont. / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

La bioremédiation est une réelle alternative aux techniques invasives de réhabilitation des sols pollués par des hydrocarbures. Cependant, la mise en place et l'optimisation de tels procédés nécessitent une meilleure connaissance des communautés microbiennes impliquées dans la biodégradation de ces polluants. Ainsi, nous avons étudié la structure et la dynamique des communautés bactériennes au cours d'un procédé de biostimulation d'un sol pollué aux hydrocarbures aliphatiques. Outre la caractérisation d' un core set bactérien présent tout au long du procédé, cette étude nous a permis d'identifier des phylotypes potentiellement impliqués dans la biodégradation de ces polluants. Enfin nous nous sommes attachés à mettre au point des outils moléculaires à haut débit, afin d'étudier plus globalement ces communautés environnementales, et ce par le développement d'un logiciel de sélection de sondes sensibles, spécifiques et exploratoires pour biopuces phylogénétiques (PhylArray)

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'intégration et la dégradation des virus (ou phages) au sein des génomes bactériens (alors nommés prophages) constituent un flux de gènes promouvant la diversification génétique de leurs hôtes. Les mécanismes à l'origine de l'impact évolutif des prophages sur leurs hôtes restent cependant mal compris. La première partie de la thèse s'est attachée à comprendre comment les prophages sont adaptés aux contraintes liées à l'organisation génétique et structurelle des chromosomes d'Escherichia et de Salmonella. Ces résultats ont mis en évidence une forte conservation des positions d'intégration des prophages, ainsi que différentes adaptations des phages à l'organisation chromosomique hôte. L'origine de la diversité génétique des phages tempérés a été au centre de la deuxième partie de la thèse. L'étude des phages lambdoïdes a révélé l'existence de deux stratégies de recombinaison chez ces phages: utilisation du système de recombinaison RecBCD de l'hôte via la présence de sites Chi ou utilisation de leur propre système de recombinaison. Ceci suggère que l'utilisation de l'une ou l'autre des stratégies a un impact important sur la diversification et le mosaïcisme génomique phagique. Enfin, la détection et l'analyse de prophages hérités verticalement au sein des génomes hôtes ont montré que de nombreux prophages partiellement dégradés sont conservés et évoluent sous sélection purificatrice. Ces résultats suggèrent que de nombreux prophages sont potentiellement des éléments fonctionnels domestiqués par la bactérie. L'ensemble de ces analyses permet de préciser les mécanismes permettant aux prophages de contribuer à la diversification des répertoires de gènes de leurs hôtes. / The integration and degradation of viruses (or phages) constitute a genetic influx of genes within bacterial genomes (then named prophages). This process is thought to promote bacterial diversification. The mechanisms promoting the evolutionary impact of prophages on their hosts remain poorly understood. The first part of my thesis focused on the adaptation of prophages to the genetic and structural organization of the chromosome of Escherichia and Salmonella. These results showed a strong conservation of prophage integration positions and different adaptations of prophages to the chromosome organization of their hosts. In a second study, I focused on the mechanisms of genetic diversification of phages. The study of lambdoid phages revealed the existence of two recombination strategies among these phages: using the host recombination system RecBCD through the presence of Chi sites or using their own recombination system. This work suggests that using one or the other recombination strategy has an important impact on the genomic diversification and mosaicism of these phages. Finally, by detecting and analyzing vertically inherited prophages within their host genomes, I showed that many degraded prophages are conserved and evolve under purifying selection. This suggests that many prophages are potentially domesticated by bacteria. Altogether, these analyses are improving our understanding of the contribution of prophages to the genetic diversification of their hosts.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Longtemps considéré comme une structure stable hautement optimisée, le génome des procaryotes nous apparaît, au regard de récentes découvertes, comme extrêmement changeant au cours du temps. Chez certaines bactéries, les gènes acquis récemment d'espèces distantes par transmission horizontale sont estimés à plus de 15 % du génome et les phylogénies construites à partir de différents gènes présentent fréquemment des incongruences importantes. De ce point de vue, la cohérence interne des génomes et la durabilité des interactions entre gènes au cours des temps évolutifs sont mises en question. Certains auteurs proposent que les transferts horizontaux se produisent à une fréquence telle que le concept même d'histoire des espèces ne s'applique pas aux procaryotes. Cependant, il a été suggéré que certaines catégories de gènes pouvaient être plus ou moins sensibles au transfert. Nous avons testé cette hypothèse au moyen de méthodes phylogénétiques et tenté de reconstruire une phylogénie des procaryotes en utilisant les génomes complets. Les résultats suggèrent que certains gènes conservent une information congruente sur l'histoire des bactéries et que la combinaison de ces informations peut permettre de reconstruire une phylogénie des bactéries. La nature des gènes détectés comme ayant été acquis récemment pose également problème. En effet, plusieurs auteurs ont remarqué que ces gènes avaient tendance à être enrichis en nucléotides A et T en comparaison du reste du génome. Nous avons analysé la structuration en nucléotides de nombreux génomes complets et montré que certaines caractéristiques intrinsèques aux génomes pourraient, dans certains cas, conduire à une surestimation de la quantité de gènes acquis par transferts horizontaux. Si d'un point de vue qualitatif, l'importance des transferts horizontaux dans l'évolution des procaryotes a été amplement démontrée, nous pensons qu'elle a été surestimée du point de vue quantitatif du fait de problèmes méthodologiques. Détectés par une méthode phylogénétique, les gènes récemment acquis montrent des caractéristiques qui les rapprochent de séquences parasites (phages notamment) ou non fonctionnelles, suggérant que certaines catégories de gènes pourraient être « spécialisées » dans le transfert horizontal.

Dans l'océan, la respiration microbienne est considérée comme le principal processus représentatif de l’oxydation biologique de la matière organique. La production correspondante de CO2 métabolique a été estimée à environ 22 Pg C a-1. Cependant, les intensités respiratoires qui se déroulent in situ sont généralement trop faibles (de plusieurs ordres de grandeur) pour être accessibles aux méthodes de mesure directes actuellement disponibles. Certaines sondes fluorescentes, comme le DiOC6(3) (Molecular Probes, USA) se sont révélées être très sensibles à l’intensité de la différence de potentiel électrochimique du proton (?µH+), qui caractérise les membranes mitochondriales et plasmiques qui portent le système respiratoire chez les cellules eucaryotes et procaryotes. Chez les mitochondries, le ?µH+ présente une relation linéaire avec le flux d'oxygène. À notre connaissance, aucune relation de ce type n'avait été établie dans le cas de cellules entières marines (micro-organismes). Lors de travaux antérieurs, G. Grégori s’est intéressé à la vitesse de respiration à l’obscurité d’une culture monospécifique de la Chlorophyceae Dunaliella tertiolecta (Butcher) en utilisant un oxygraphe à haute résolution (Oroboros) et une coloration des cellules par le DiOC6(3). Une relation linéaire a été mise en évidence et standardisée, entre la vitesse d’absorption d'oxygène par D. tertiolecta et son intensité de fluorescence verte spécifique induite par le DiOC6(3), permettant ainsi la mesure par cytométrie de flux de la vitesse de respiration de D. tertiolecta. L'étape suivante consiste à étendre la méthode aux procaryotes hétérotrophes, principaux responsables de la minéralisation de la matière organique dans l'océan. Dans le présent travail sont présentés les résultats obtenus sur l’eubactérie Pseudomonas nautica 617, une souche qui a été isolée dans notre laboratoire par P. Bonin en 1987. / In the Ocean, microbial respiration is considered as the major process representative of the organic matter biological oxidation. The corresponding metabolic CO2 production was estimated to be about 22 Pg C y–1. However, the in situ respiration rate is generally too low (by several orders of magnitude) to be accessible to the available direct measurement methods. Some fluorescent probes, such as DiOC6(3) (Molecular Probes, USA) have been shown to be very sensitive to changes in the proton electrochemical potential difference (?µH+), characterising mitochondrial and plasmic membranes bearing the cell respiratory system in eukaryotic and prokaryotic cells. In mitochondria, ?µH+ is linked to the flux of oxygen uptake by a linear relationship. To our knowledge, no such relationship has been established in the case of whole marine cells. In a previous works, G. Grégori addressed the dark respiration rate of the Chlorophyceae Dunaliella tertiolecta (Butcher) in axenic culture, both directly by using a highly sensitive oxygraph (Oroboros) and by staining cells with DiOC6(3). A linear relationship was established and standardized between the oxygen uptake by D. tertiolecta and its green fluorescence induced by DiOC6(3), enabling the measure by flow cytometry of the respiration rate of D. tertiolecta. The next step is to extend the method to heterotrophic prokaryotes which are responsible for most of the mineralization of the organic matter in the ocean. In the present work are presented results obtained on the eubacteria Pseudomonas nautica 617, a strain that has been isolated in our laboratory by P. Bonin in 1987.

Au cours des dernières anneés, la taxonomie bactérienne a subi de profonds changements mais peu de consensus existent quant à la description précise des procaryotes. La diversité des procaryotes a été estimeé à 107 espèces, et la classification actuelle contient plus de 12 900 espèces officiellement reconnues. Ceci souligne l'absence d'un répertoire des procaryotes isolés chez l'homme. Nous avons constitué ce répertoire qui contient 2 156 espèces différentes réparties en 12 phyla,Notre second travail est la caractérisation du microbiote digestif par 5 approches varieés (cytométrie de flux, coloration de gram, TEM, qPCR, pyroséquençage). Nous avons analysé 16 selles de patients en comparant le taux de procaryotes de type gram positif/négatif. La moitié des procaryotes de type gram négatif n'est pas détecté par le pyroséquençage,alors qu'ils sont décrits comme les constituants majeurs de ce microbiote d'après les 1ères études réaliseés utilisant la culture.Dans notre 3ème travail, nous avons voulu montrer que l'utilisation de la culture bactérienne n'est pas inférieure aux techniques de séquençage pour étudier la diversité du microbiote digestif. Au total, depuis 4 ans, 685 échantillons ont été analysés et plus de 500 000 colonies ont été identifieés par MALDI-TOF. Ce travail a permis d'augmenter de 77,5 % le nombre d'espèces identifieés dans le tube digestif. Les nouvelles espèces sont décrites suivant le concept « taxonogenomics » incluant des donneés phénotypiques et le séquençage du génome. / Bacterial taxonomy has undergone tremendous changes over time, with little historical consensus regarding specific descriptions of prokaryotes. The prokaryotes have been estimated about 107 species, and the current classification contained more than 12,900 species. This highlights the absence of an exhaustive and specific database listing all prokaryotes associated with humans. We found than the human prokaryotic repertoire contained 2,156 species, divided among 12 different phyla.The second aim of our work was to characterize the human gut microbiota using 5 different techniques, including morphologic and molecular approaches (flow cytometry, gram staining, electron microscopy, qPCR and pyrosequencing). We analyzed 16 stools samples of patient and we copared the rate of gram-positive and gram-negative prokaryotes obtained with each technique. We found than by pyrosequencing only a half of gram-negative prokaryotes was detected.Our third goal was to demonstrate that bacterial culture was not inferior to pyrosequencing to describe the gut diversity. Culturomics concept created during the pioneer study has revolutionized the approach of the microbiota exploration. Since 4 years, we have performed the analyze of 685 different samples and identified more than 500,000 colonies using the MALDI-TOF mass spectrometry. We have increased by 77.5% the number of species isolated in the gut. Each new species will be described following our new concept named "taxonogenomics", including phenotypic data and genome sequencing.