Os manguezais são ecossistemas costeiros de transição formados entre o ambiente marinho e terrestre de zonas tropicais e intertropicais, e estão sujeitos ao regime de marés. Devido a tais condições, os microrganismos que vivem nos sedimentos sofrem constante pressão adaptativa. Nesse contexto, os Elementos Genéticos Móveis (EGMs) (fagos, plasmídeos e transposons) são fatores genéticos diretamente relacionados com a transferência horizontal de genes e podem facilitar processos de adaptação. Neste trabalho foram estudados os EGMs dos sedimentos de três áreas de manguezais do estado de São Paulo, duas localizadas no município de Bertioga e uma na reserva ambiental da Ilha do Cardoso, em Cananeia. Foram avaliadas a frequência e expressão dos diferentes tipos de EGMs no microbioma dos manguezais a partir de metagenomas e metatranscriptomas dos sedimentos, além da utilização de uma biblioteca de fosmídeos, montada a partir de DNA do sedimento de uma das áreas de Bertioga. As sequências de DNA e mRNA foram obtidas de três pontos amostrados por área, sequenciadas em equipamento Illumina HiSeq2000 e anotadas automaticamente na plataforma do MG-RAST. Para a biblioteca de fosmídeo, foi sequenciado um pool de todos os clones em equipamento Illumina HiSeq 2000. Contigs dessas sequências foram montados e fagos e profagos foram preditos e anotados automaticamente pelo pipeline VirSorter. As sequências preditas como fagos ou profagos foram anotadas manualmente. A partir da análise das sequências de metagenômica foi possível verificar que a participação dos EGMs no metabolismo total do microbioma dos manguezais corresponde de 6 a 15 % dos genes preditos, sendo que fagos e profagos correspondem a 90% dos genes associados aos EGMs. A partir dos contigs montados para as sequências da biblioteca, foram preditos e anotados automaticamente 27 fagos, dos quais nove fagos foram anotados manualmente em etapa posterior. Foram encontrados genes que codificam proteínas típicas de fagos, como capsídeo, transposase e integrase, além de genes acessórios potencialmente importantes, como relacionados ao sistema de transporte ABC e sistema de transporte tipo II. A partir da anotação manual, genes conservados de fagos foram utilizados como base para predição da linhagem viral. Foram identificados 6 tipos de vírus pertencentes à ordem Caudovirales, que infectam Proteobacteria e Firmicutes. Esse trabalho sustenta a hipótese de que os fagos infectam os grupos bacterianos mais abundantes nos manguezais e podem carregar genes importantes consigo, desempenhando papel chave na evolução das bactérias nesse ambiente. / Mangroves are coastal transitional ecossystems between marine and terrestral environments of tropical and intertropical zones and are subject to tidal regime. Due those condictions, microorganisms that lives in the sediments suffer constant adaptative pressure. In this context, Mobile Genetic Elements (MGEs) (phages, plasmids and transposons) are genetic fators directly related with horizontal gene transfer and can facilitate adaptation processes. In this work MGEs were studied in the sediments of three mangrove areas in São Paulo state, two located in Bertioga county and one in environmental reserve of Ilha do Cardoso, in Cananeia. Frequency and expression were avaliated for diferente EGMs types in mangrove microbiome from the sediments metagenomes and metatranscriptomes, besides utilization os a fosmid library assembled from a Bertioga area sediment DNA. The sequences of DNA and mRNA were obtained from three sampled points, sequenced in Illumina HiSeq2000 equipment and automatically anotaded in MG-RAST plataform. A pool of all clone were sequenced for fosmid library in Illumina HiSeq2000 equipment. Contigs were assembled and phages and prophages were automatically predicted in VirSorter pipeline. The phages or prophages predicted sequences were manually anotaded. From the analisys os metagenomic sequences was possible to verify that the MGEs participation in total microbiome metabolism stands for 6 to 15% of predicted genes, wich 90% corresponds to phage associated genes. From contigs assembled of library sequences, 27 phages were predicted and annotaded, wich nine code for phage typical proteins, as capsid, transposase and integrase, besides accessory genes potencially important, as ABC transporter and type II transport related. Phage conserved genes were used as base for viral lineage prediction. 6 viral types belonging do Caudovirales order were identified, which infects Proteobacteria and Firmicutes. This work supports the hypothesis that phages infect the most abundant bacterial groups in mangroves and can carry important genes playing a key role in bacterial evolution in this environment.

Os manguezais são ecossistemas costeiros de transição formados entre o ambiente marinho e terrestre de zonas tropicais e intertropicais, e estão sujeitos ao regime de marés. Devido a tais condições, os microrganismos que vivem nos sedimentos sofrem constante pressão adaptativa. Nesse contexto, os Elementos Genéticos Móveis (EGMs) (fagos, plasmídeos e transposons) são fatores genéticos diretamente relacionados com a transferência horizontal de genes e podem facilitar processos de adaptação. Neste trabalho foram estudados os EGMs dos sedimentos de três áreas de manguezais do estado de São Paulo, duas localizadas no município de Bertioga e uma na reserva ambiental da Ilha do Cardoso, em Cananeia. Foram avaliadas a frequência e expressão dos diferentes tipos de EGMs no microbioma dos manguezais a partir de metagenomas e metatranscriptomas dos sedimentos, além da utilização de uma biblioteca de fosmídeos, montada a partir de DNA do sedimento de uma das áreas de Bertioga. As sequências de DNA e mRNA foram obtidas de três pontos amostrados por área, sequenciadas em equipamento Illumina HiSeq2000 e anotadas automaticamente na plataforma do MG-RAST. Para a biblioteca de fosmídeo, foi sequenciado um pool de todos os clones em equipamento Illumina HiSeq 2000. Contigs dessas sequências foram montados e fagos e profagos foram preditos e anotados automaticamente pelo pipeline VirSorter. As sequências preditas como fagos ou profagos foram anotadas manualmente. A partir da análise das sequências de metagenômica foi possível verificar que a participação dos EGMs no metabolismo total do microbioma dos manguezais corresponde de 6 a 15 % dos genes preditos, sendo que fagos e profagos correspondem a 90% dos genes associados aos EGMs. A partir dos contigs montados para as sequências da biblioteca, foram preditos e anotados automaticamente 27 fagos, dos quais nove fagos foram anotados manualmente em etapa posterior. Foram encontrados genes que codificam proteínas típicas de fagos, como capsídeo, transposase e integrase, além de genes acessórios potencialmente importantes, como relacionados ao sistema de transporte ABC e sistema de transporte tipo II. A partir da anotação manual, genes conservados de fagos foram utilizados como base para predição da linhagem viral. Foram identificados 6 tipos de vírus pertencentes à ordem Caudovirales, que infectam Proteobacteria e Firmicutes. Esse trabalho sustenta a hipótese de que os fagos infectam os grupos bacterianos mais abundantes nos manguezais e podem carregar genes importantes consigo, desempenhando papel chave na evolução das bactérias nesse ambiente. / Mangroves are coastal transitional ecossystems between marine and terrestral environments of tropical and intertropical zones and are subject to tidal regime. Due those condictions, microorganisms that lives in the sediments suffer constant adaptative pressure. In this context, Mobile Genetic Elements (MGEs) (phages, plasmids and transposons) are genetic fators directly related with horizontal gene transfer and can facilitate adaptation processes. In this work MGEs were studied in the sediments of three mangrove areas in São Paulo state, two located in Bertioga county and one in environmental reserve of Ilha do Cardoso, in Cananeia. Frequency and expression were avaliated for diferente EGMs types in mangrove microbiome from the sediments metagenomes and metatranscriptomes, besides utilization os a fosmid library assembled from a Bertioga area sediment DNA. The sequences of DNA and mRNA were obtained from three sampled points, sequenced in Illumina HiSeq2000 equipment and automatically anotaded in MG-RAST plataform. A pool of all clone were sequenced for fosmid library in Illumina HiSeq2000 equipment. Contigs were assembled and phages and prophages were automatically predicted in VirSorter pipeline. The phages or prophages predicted sequences were manually anotaded. From the analisys os metagenomic sequences was possible to verify that the MGEs participation in total microbiome metabolism stands for 6 to 15% of predicted genes, wich 90% corresponds to phage associated genes. From contigs assembled of library sequences, 27 phages were predicted and annotaded, wich nine code for phage typical proteins, as capsid, transposase and integrase, besides accessory genes potencially important, as ABC transporter and type II transport related. Phage conserved genes were used as base for viral lineage prediction. 6 viral types belonging do Caudovirales order were identified, which infects Proteobacteria and Firmicutes. This work supports the hypothesis that phages infect the most abundant bacterial groups in mangroves and can carry important genes playing a key role in bacterial evolution in this environment.

A relação entre bacteriófagos e virulência bacteriana é um modelo muito intrigante e pouco estudado na patogênese periodontal, uma vez que um patógeno periodontal pode ser lisogênico. O objetivo do nosso estudo é determinar a capacidade de fibroblastos gengivais humanos de induzir as cepas lisogênicas de Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Dois experimentos foram realizados seguidos da titulação de fago. Os experimentos consistiram da co-cultura com fibroblastos gengivais humanos e três cepas de Aa [Aa29524, Aa2112, Aa29524(Ø2112)], não lisogênica, lisogênica e lisogênica induzida em laboratório, respectivamente. Em três momentos distintos (no experimento 1: 0, 2 e 4 horas; e no experimento 2: 2, 4 e 6 horas), o sobrenadante da co-cultura foi filtrado e cultivado overnight com a bactéria indicadora (Aa29524) e analisado para a capacidade de lisar a célula indicadora. Em ambos os experimentos, o sobrenadante da co-cultura de fibroblastos gengivais humanos com Aa lisogênico e Aa lisogênico induzido em laboratório, ao ser cultivado com a bactéria indicadora, promoveu lise da mesma, resultando no aumento da produção de fago. Pode-se concluir que, nesse estudo os fibroblastos gengivais humanos foram capazes de induzir cepas lisogênicas de Aggregatibacter actinomycetemcomitans. / The relationship between bacteriophages and bacterial virulence is a very intriguing, but rarely studied model in periodontal pathogenesis, as a periodontal pathogens can be lysogenic. The aim of our study is to determine the ability of human gingival fibroblasts to induce lysogenic strains of Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Two experiments were performed followed by titration of phage. The experiments consisted of co-culture with human gingival fibroblasts and three strains of Aa [Aa29524, Aa2112, Aa29524 (Ø2112)], not lysogenic, lysogenic and lysogenic induced in the laboratory, respectively. In three different times (in experiment 1: 0, 2 and 4 hours, and in experiment 2: 2, 4 and 6 hours), the co-culture supernatant was filtered and cultured overnight with the indicator strain (Aa29524) and analyzed for ability to lyse the cell indicator. In both experiments, the supernatant of the co-culture of human gingival fibroblasts with Aa lysogenic and Aa lysogenic induced in the laboratory to be cultured with the indicator bacteria, caused lysis of the same, resulting an increased phage production. It can be concluded that in this study, human gingival fibroblasts were able to induce lysogenic strains of Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-03-24T18:01:18Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1356478 bytes, checksum: 51adfd6cd0f89b63346e1bda8f1b9c70 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-24T18:01:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1356478 bytes, checksum: 51adfd6cd0f89b63346e1bda8f1b9c70 (MD5) Previous issue date: 2015-02-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bacteriófagos são vírus específicos de bactérias, os considerados líticos infectam e promovem a lise celular e consequente morte da bactéria hospedeira. Diante disso o interesse da utilização de fagos no controle específico de bactérias patogênicas durante as fases de pré e pós-processamento e armazenamento de alimentos é crescente e muito pesquisado atualmente. O objetivo deste trabalho foi isolar bacteriófagos com especificidade em culturas de L. monocytogenes e avaliar a eficiência de diferentes concentrações dos mesmos no controle de populações L. monocytogenes em meio de cultura, em leite e em queijos. O bacteriófago foi isolado de intestinos de galinhas caipiras oriundas da Zona Rural de Viçosa-MG. Foram testadas concentrações de 105, 106 e 108 UFP·mL-1 do bacteriófago 105 no controle de L. monocytogenes em concentração de UFC· mL-1 . Os testes realizados em meio de cultura e leite demonstraram a eficiência do bacteriófago reduzindo aproximadamente 4 ciclos logarítmicos da população de L. monocytogenes no período de 9 a 12 horas. Em ambos os testes o tratamento mais eficiente foi quando utilizado a concentração 10 8 UFP·mL-1 de bacteriófagos. No teste em queijo observou-se redução de 3,26 e 1, 07 ciclos logarítmico na população de L. monocytogenes após 14 dias de armazenamento nas temperaturas de 15 °C e 5 °C respectivamente. Foram comparadas duas técnicas para enumeração de bacteriófagos, contagem em placas e contagem por microgotas, não sendo observada diferença entre as duas técnicas. Os resultados desta pesquisa demonstram que o uso de bacteriófagos líticos de no controle de populações L. monocytognes foi eficiente nas três matizes estudas, evidenciando o potencial da aplicação de fagos no biocontrole de populações microbianas. / Bacteriophages are viruses specific bacteria, the lytic considered infect and promote cell lysis and subsequent death of the host bacterium. Therefore the interest of the use of phages as agents for particular control of pathogenic bacteria during the phases of pre and post processing and storage of food is increasing and currently researched. The objective of this study was to isolate bacteriophages with specificity for L. monocytogenes cultures and evaluate the efficiency of different concentrations of the same in the control of L. monocytogenes populations in culture medium, milk and cheese. The bacteriophage was isolated from the intestines of hens arising from the Rural Area of Viçosa-MG. Concentrations tested were 105, 106 and 108 PFU.ml-1 bacteriophage in control of L. monocytogenes. The tests performed in culture medium and milk demonstrated bacteriophage efficiency by reducing approximately 4 log cycles of L. monocytogenes in the period from 9 to 12 hours. In both tests was the most effective treatment when used at a concentration of 108 PFU. ml-1 bacteriophages. In the test cheese was observed decrease of 3.26 and 1.07 logarithmic cycles in L. monocytogenes population after 14 days of storage at temperatures of 15 ° C and 5 ° C respectively. We compared two techniques for enumeration of bacteriophages, the count plating technique and score by droplets, with no observed difference between the two techniques. These results demonstrate that the use of lytic bacteriophages of L. monocytognes in the control population was efficient in three ways studies showed the potential application of the phage biocontrol microbial populations.

A relação entre bacteriófagos e virulência bacteriana é um modelo muito intrigante e pouco estudado na patogênese periodontal, uma vez que um patógeno periodontal pode ser lisogênico. O objetivo do nosso estudo é determinar a capacidade de fibroblastos gengivais humanos de induzir as cepas lisogênicas de Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Dois experimentos foram realizados seguidos da titulação de fago. Os experimentos consistiram da co-cultura com fibroblastos gengivais humanos e três cepas de Aa [Aa29524, Aa2112, Aa29524(Ø2112)], não lisogênica, lisogênica e lisogênica induzida em laboratório, respectivamente. Em três momentos distintos (no experimento 1: 0, 2 e 4 horas; e no experimento 2: 2, 4 e 6 horas), o sobrenadante da co-cultura foi filtrado e cultivado overnight com a bactéria indicadora (Aa29524) e analisado para a capacidade de lisar a célula indicadora. Em ambos os experimentos, o sobrenadante da co-cultura de fibroblastos gengivais humanos com Aa lisogênico e Aa lisogênico induzido em laboratório, ao ser cultivado com a bactéria indicadora, promoveu lise da mesma, resultando no aumento da produção de fago. Pode-se concluir que, nesse estudo os fibroblastos gengivais humanos foram capazes de induzir cepas lisogênicas de Aggregatibacter actinomycetemcomitans. / The relationship between bacteriophages and bacterial virulence is a very intriguing, but rarely studied model in periodontal pathogenesis, as a periodontal pathogens can be lysogenic. The aim of our study is to determine the ability of human gingival fibroblasts to induce lysogenic strains of Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Two experiments were performed followed by titration of phage. The experiments consisted of co-culture with human gingival fibroblasts and three strains of Aa [Aa29524, Aa2112, Aa29524 (Ø2112)], not lysogenic, lysogenic and lysogenic induced in the laboratory, respectively. In three different times (in experiment 1: 0, 2 and 4 hours, and in experiment 2: 2, 4 and 6 hours), the co-culture supernatant was filtered and cultured overnight with the indicator strain (Aa29524) and analyzed for ability to lyse the cell indicator. In both experiments, the supernatant of the co-culture of human gingival fibroblasts with Aa lysogenic and Aa lysogenic induced in the laboratory to be cultured with the indicator bacteria, caused lysis of the same, resulting an increased phage production. It can be concluded that in this study, human gingival fibroblasts were able to induce lysogenic strains of Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) é uma bactéria associada à Periodontite Agressiva (PA). Ela invade tecidos moles, com ocorrência de lisogenia e bacteriófagos presentes em até 69% das subespécies. Estudos in vitro sugerem que a indução do bacteriófago (Aa17) ocorre numa co-cultura de Aa lisogênico com fibroblastos humanos. Se esta interação ocorre in vivo, com liberação do vírus, uma reação imunológica contra o Aa17 aconteceria. O objetivo deste estudo é constatar se anticorpos (AC) contra proteínas do Aa17 existem e estão associados à doença periodontal. Um objetivo adicional foi testar a resposta de AC contra os sorotipos do Aa. 52 indivíduos participaram: 31 com PA, 5 com Periodontite Crônica (PC) e 16 com Periodonto Saudável (PS). Soro foi coletado após a classificação clínica. As proteínas do Aa17 foram obtidas de preparações purificadas. As subespécies do Aa utilizadas para amostras de proteínas através de sonicação foram: 43717(American Tissue Culture Collection - ATCC) sorotipo A, 43718 (ATCC) sorotipo B, 33384 (ATCC) sorotipo C, IDH781 sorotipo D, NJ9500 sorotipo E and CU1000 sorotipo F. As proteínas foram separadas em géis de poliacrilamida e transferidas para membranas de nitrocelulose. As reações de Western-blotting ocorreram com o AC primário sendo o soro de cada indivíduo. Todas as membranas foram lidas pelo sistema Odyssey que captura sinais no AC secundário (antihumano). A resposta de AC contra ao menos uma proteína do Aa17, assim como pelo menos um sorotipo do Aa foi observado em todos, com exceção de dois indivíduos (com PS), participantes. Um indivíduo do grupo PC e três do PA tiveram resposta de AC contra alguns, mas não todos os sorotipos do Aa. A resposta de AC contra todos os sorotipos foi o achado mais comum nos grupos PA (28/31), PS (14/16) e PC (4/5). A resposta de AC contra o complexo de proteínas do Aa17 foi observado em 7 indivíduos com PA, 2 com PC e 6 com PS. A presença de AC contra qualquer proteína do Aa17 tem significância estatística (p= 0,044), assim como a resposta de AC contra o sorotipo C (p= 0,044). Reações intensas foram vistas quando o soro reagiu contra proteínas do sorotipo C; em alguns casos um sinal tão forte que cobriu a maioria da faixa. Essa resposta intensa esteve presente em 17, 3 e 1 dos indivíduos com PA, PC e PS e tem significância estatística entre os grupos PA e PS (p= 0,001). A resposta de AC contra uma proteína do Aa17 ou seu complexo foi observado em todos os grupos. Esse achado sugere que a indução in vitro do Aa17 poderia também ocorrer in vivo, embora não sendo necessariamente associada à periodontite. A resposta de AC contra vários sorotipos do Aa foi um achado comum e não associado com a doença. Entretanto, a presença e a intensidade da resposta de AC contra o sorotipo C está associada à PA. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) is a bacteria associated with Aggressive Periodontitis (AP). It invades soft tissues, with occurrence of lysogeny and bacteriophage presence up to 69% of Aa subspecies. In vitro studies suggested that bacteriophage (Aa17) induction occurs upon co-culture of Aa lysogens subspecies with human fibroblasts. If such an in vivo interaction resulted in Aa17 induction and release of virions, an immunologic reaction to Aa17 proteins could ensue. The purpose of this investigation was to learn whether serum antibodies (AB) to Aa17 proteins are found in human sera, and whether they are associated with periodontal disease. An additional purpose was to test the AB response against known Aa serotypes.52 individuals took part: 31 with AP, 5 with Chronic Periodontitis (CP) and 16 with a Healthy Periodontium (HP). Serum was collected after clinical classification. Aa17 proteins were obtained from purified Aa17 preparations. The Aa strains used for protein sampling through sonication were: 43717(American Tissue Culture Collection - ATCC) serotype A, 43718 (ATCC) serotype B, 33384 (ATCC) serotype C, IDH781 serotype D, NJ9500 serotype E and CU1000 serotype F. Proteins were separated by SDS-PAGE gels and then transferred to nitrocellulose membranes. Western-blotting reactions were carried out with the primary AB being each subjects serum. All membranes were read through the Odyssey system which captures signals from a dye in a secondary (antihuman) AB. AB response against at least one Aa17 protein, as well as a response to at least one Aa serotype, was observed in all but two individuals (with HP) who participated in the study. Serum from one individual from the CP group and three from the AP group had AB response to some, but not all Aa serotypes. AB response against all Aa serotypes was the most common finding in AP (28/31), HP (14/16) and CP (4/5) groups. AB response to the full complex of Aa17 proteins was observed in 7 individuals with AP, 2 with CP and 6 with HP. Chi-square tests comparing the AP with HP groups indicated that the presence of AB against any Aa17 protein is statistically significant (p= 0,044), as well as AB response against serotype C (p= 0,044). Intense reactions were seen when sera reacted with proteins from serotype C; in some cases the signal was so strong that it covered much of the lane. This intense response was present in 17, 3, and 1 of the AP, CP and HP subjects, respectively and was statistically significant (p=0.001) between the AP and HP groups. AB response against a Aa17 protein or its whole complex was observed in all groups. This finding suggests that the in vitro Aa17 induction could also be occurring in vivo, although it is not necessarily associated with periodontitis. AB response against multiple Aa serotypes was a common finding and is not associated with disease. However, the presence and intensity of AB response against Aa serotype C, is associated with AP.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) é uma bactéria associada à Periodontite Agressiva (PA). Ela invade tecidos moles, com ocorrência de lisogenia e bacteriófagos presentes em até 69% das subespécies. Estudos in vitro sugerem que a indução do bacteriófago (Aa17) ocorre numa co-cultura de Aa lisogênico com fibroblastos humanos. Se esta interação ocorre in vivo, com liberação do vírus, uma reação imunológica contra o Aa17 aconteceria. O objetivo deste estudo é constatar se anticorpos (AC) contra proteínas do Aa17 existem e estão associados à doença periodontal. Um objetivo adicional foi testar a resposta de AC contra os sorotipos do Aa. 52 indivíduos participaram: 31 com PA, 5 com Periodontite Crônica (PC) e 16 com Periodonto Saudável (PS). Soro foi coletado após a classificação clínica. As proteínas do Aa17 foram obtidas de preparações purificadas. As subespécies do Aa utilizadas para amostras de proteínas através de sonicação foram: 43717(American Tissue Culture Collection - ATCC) sorotipo A, 43718 (ATCC) sorotipo B, 33384 (ATCC) sorotipo C, IDH781 sorotipo D, NJ9500 sorotipo E and CU1000 sorotipo F. As proteínas foram separadas em géis de poliacrilamida e transferidas para membranas de nitrocelulose. As reações de Western-blotting ocorreram com o AC primário sendo o soro de cada indivíduo. Todas as membranas foram lidas pelo sistema Odyssey que captura sinais no AC secundário (antihumano). A resposta de AC contra ao menos uma proteína do Aa17, assim como pelo menos um sorotipo do Aa foi observado em todos, com exceção de dois indivíduos (com PS), participantes. Um indivíduo do grupo PC e três do PA tiveram resposta de AC contra alguns, mas não todos os sorotipos do Aa. A resposta de AC contra todos os sorotipos foi o achado mais comum nos grupos PA (28/31), PS (14/16) e PC (4/5). A resposta de AC contra o complexo de proteínas do Aa17 foi observado em 7 indivíduos com PA, 2 com PC e 6 com PS. A presença de AC contra qualquer proteína do Aa17 tem significância estatística (p= 0,044), assim como a resposta de AC contra o sorotipo C (p= 0,044). Reações intensas foram vistas quando o soro reagiu contra proteínas do sorotipo C; em alguns casos um sinal tão forte que cobriu a maioria da faixa. Essa resposta intensa esteve presente em 17, 3 e 1 dos indivíduos com PA, PC e PS e tem significância estatística entre os grupos PA e PS (p= 0,001). A resposta de AC contra uma proteína do Aa17 ou seu complexo foi observado em todos os grupos. Esse achado sugere que a indução in vitro do Aa17 poderia também ocorrer in vivo, embora não sendo necessariamente associada à periodontite. A resposta de AC contra vários sorotipos do Aa foi um achado comum e não associado com a doença. Entretanto, a presença e a intensidade da resposta de AC contra o sorotipo C está associada à PA. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) is a bacteria associated with Aggressive Periodontitis (AP). It invades soft tissues, with occurrence of lysogeny and bacteriophage presence up to 69% of Aa subspecies. In vitro studies suggested that bacteriophage (Aa17) induction occurs upon co-culture of Aa lysogens subspecies with human fibroblasts. If such an in vivo interaction resulted in Aa17 induction and release of virions, an immunologic reaction to Aa17 proteins could ensue. The purpose of this investigation was to learn whether serum antibodies (AB) to Aa17 proteins are found in human sera, and whether they are associated with periodontal disease. An additional purpose was to test the AB response against known Aa serotypes.52 individuals took part: 31 with AP, 5 with Chronic Periodontitis (CP) and 16 with a Healthy Periodontium (HP). Serum was collected after clinical classification. Aa17 proteins were obtained from purified Aa17 preparations. The Aa strains used for protein sampling through sonication were: 43717(American Tissue Culture Collection - ATCC) serotype A, 43718 (ATCC) serotype B, 33384 (ATCC) serotype C, IDH781 serotype D, NJ9500 serotype E and CU1000 serotype F. Proteins were separated by SDS-PAGE gels and then transferred to nitrocellulose membranes. Western-blotting reactions were carried out with the primary AB being each subjects serum. All membranes were read through the Odyssey system which captures signals from a dye in a secondary (antihuman) AB. AB response against at least one Aa17 protein, as well as a response to at least one Aa serotype, was observed in all but two individuals (with HP) who participated in the study. Serum from one individual from the CP group and three from the AP group had AB response to some, but not all Aa serotypes. AB response against all Aa serotypes was the most common finding in AP (28/31), HP (14/16) and CP (4/5) groups. AB response to the full complex of Aa17 proteins was observed in 7 individuals with AP, 2 with CP and 6 with HP. Chi-square tests comparing the AP with HP groups indicated that the presence of AB against any Aa17 protein is statistically significant (p= 0,044), as well as AB response against serotype C (p= 0,044). Intense reactions were seen when sera reacted with proteins from serotype C; in some cases the signal was so strong that it covered much of the lane. This intense response was present in 17, 3, and 1 of the AP, CP and HP subjects, respectively and was statistically significant (p=0.001) between the AP and HP groups. AB response against a Aa17 protein or its whole complex was observed in all groups. This finding suggests that the in vitro Aa17 induction could also be occurring in vivo, although it is not necessarily associated with periodontitis. AB response against multiple Aa serotypes was a common finding and is not associated with disease. However, the presence and intensity of AB response against Aa serotype C, is associated with AP.

O uso de diferentes tipos de medicação intracanal para o controle do processo infeccioso, principalmente nos casos em que há presença de microrganismos resistentes às manobras de desinfecção, tem sido alvo de muitas pesquisas. A proposta deste estudo foi avaliar, in vitro, o efeito antimicrobiano de bacteriófagos específicos diante de cinco cepas de Enterococcus faecalis e a ação de um lisado híbrido polivalente na eliminação da infecção causada por essas cinco cepas da mesma espécie. Foram utilizados 37 dentes unirradiculares humanos, recentemente extraídos e de proporções aproximadas. As coroas foram removidas e os canais instrumentados até a lima tipo K de número 45. Os espécimes foram, então, esterilizados e utilizados em dois experimentos distintos. O primeiro experimento utilizou 25 raízes divididas em cinco grupos de cinco espécimes. Três espécimes de cada grupo foram inoculados com uma das culturas bacterianas e seus fagos correspondentes na proporção 1:1, por um período de três horas a 37 °C, enquanto os outros dois, receberam a cultura de microrganismos ou somente meio de cultura (controle positivo e negativo, respectivamente). No segundo experimento, 11 espécimes receberam um inóculo formado pelas cinco cepas por um período de 10 dias de incubação a 37 °C, com o propósito de manter condições apropriadas para a penetração das bactérias no interior dos túbulos dentinários, e um outro espécime recebeu apenas meio de cultura (controle negativo). Essa penetração foi confirmada empregando-se microscopia ótica e eletrônica realizada em dois espécimes. Após o período de incubação, o lisado polivalente, preparado com os cinco fagos, foi aplicado por 24 horas a 37 °C em 8 espécimes, e os demais preenchidos com meio de cultura (controle positivo e negativo). Alíquotas do interior de todos os canais foram colhidas antes e depois do contato com os fagos e no segundo experimento, também 24 e 48 horas depois, para semeadura e contagem de unidades formadoras de colônia. Os resultados do primeiro experimento mostraram 100% de redução do crescimento bacteriano nos espécimes que receberam a suspensão de fagos específicos, em comparação a seus respectivos controles positivos, em todos os grupos. No segundo experimento, foi comparado o crescimento obtido após os 10 dias de infecção com aquele posterior a aplicação dos fagos, redução que variou entre 50% e 100%. Diante desses resultados, conclui-se que os bacteriófagos foram eficazes na diminuição dos microrganismos presentes no interior de canais radiculares e nos túbulos dentinários de dentes humanos. / Many studies have investigated different intracanal medications to control infection processes, especially in cases of microbial resistance to disinfection procedures. The purpose of this study was to evaluate the in vitro antimicrobial effect of specific bacteriophages on five isolates of Enterococcus faecalis, as well as the activity of a lysate cocktail in eliminating the infection caused by these bacteria. Thirty-seven recently extracted human teeth of approximately equal size and with single roots were used. The crowns were removed and each canal was prepared using K files,up to # 45, and sterile physiological saline. Specimens were then sterilized and used in two separate studies. The first study utilized 25 individual roots divided into five groups of five specimens each. Three specimens of each group were inoculated with one of the bacterial cultures and the corresponding bacteriophage in a proportion of 1:1, and incubated for three hours at 37°C; the other two specimens were inoculated with only the bacterial culture or only the culture medium (positive and negative controls, respectively). In the second study, 11 specimens were inoculated with all five strains and incubated for ten days at 37°C in order to allow bacteria to penetrate the interior of the dental tubules, and another one, received just the culture medium (negative control). Penetration into the tubules was confirmed by optical and electron microscopy of two specimens. Following incubation, the lysate cocktail prepared using all five bacteriophages was applied to the other 8 specimens for 24 hours at 37°C, and 2 specimens were filled with the culture medium (positive and negative controls). In the first study, samples were taken from the lumen of all canals before and after contact with bacteriophages; in the second, aliquots were also taken 24 and 48 hours after the bacteria were exposed to the phages. All samples were diluted and plated and the number of colony forming units was counted. In the first study, there was a 100% reduction in bacterial growth in specimens that received the specific bacteriophage suspension compared to the positive controls within each group. In the second study, after ten days the number of bacteria was reduced by 50% to 100% following the bacteriophage application. These results suggest that bacteriophages are effective in reducing the number of bacteria inside the root canal and in the dental tubules of human teeth.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA12MA056.pdf: 526904 bytes, checksum: 7a4c82b6cb16c016c29f0182cfbbaa51 (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / The analysis methods for Salmonella spp. detection are of great importance in the system of animal products processing industries, because they reflect directly on the microbiological quality of food, impacting the storage time and therefore the release of the product for sale. The present study verified the efficiency of a new ELFA ELISA test using a recombinant protein from bacteriophage (VIDAS UP®) to detect the presence of Salmonella spp. in products of animal origin. Two hundred fifteen samples (15 samples artificially contaminated and 200 samples from agribusiness routine), from different products of animal origin were analyzed. The samples were tested by five methods of diagnosis: ELFA ELISA, conventional methodology in accordance with ISO 6579, polymerase chain reaction - PCR, semi-solid Rappaport-Vassiliadis Modified - MSRV and MSRV medium + supplement. Eleven out of 215 (5.12%) samples were positive in at least one test, which four samples were from agribusiness routine and seven were from artificially contaminated samples. The sensitivity and specificity of the ELFA ELISA when compared with the conventional method was 90.0% and 99.51% respectively. The ELFA ELISA was equivalent to the other methodologies, showing to be effective and rapid to detect Salmonella spp. in different products of animal origin / Os métodos de análise para detecção de Salmonella spp. são de grande importância no processo da agroindústria de produtos de origem animal, pois refletem diretamente na qualidade microbiológica dos alimentos, impactando no tempo de estocagem e por conseguinte na liberação do produto para venda. O presente trabalho verificou a eficiência de um novo teste ELFA ELISA utilizando proteína recombinante oriunda de bacteriófago (VIDAS UP®) para detectar a presença de Salmonella spp. em produtos de origem animal. Foram analisadas 215 amostras (15 amostras artificilamente contaminadas e 200 amostras de rotina da agroindústria), de diferentes produtos de origem animal. As amostras foram submetidas a cinco métodos de diagnóstico: ELFA ELISA, metodologia convencional de acordo com ISO 6579, reação em cadeia da polimerase - PCR, meio semi-sólido Rappaport-Vassiliadis Modificado - MSRV e meio MSRV + suplemento. Onze amostras das 215 (5,12%) foram positivas em pelo menos um dos testes, sendo quatro amostras de rotina da agroindústria e sete amostras artificialmente contaminadas. A sensibilidade e especificidade do teste ELFA ELISA com a metodologia convencional foi de 90,0% e 99,51%, respectivamente. O teste ELFA ELISA apresentou equivalência com as demais metodologias, mostrando ser eficaz e rápido na detecção de Salmonella spp. em diferentes produtos de origem animal

O uso de diferentes tipos de medicação intracanal para o controle do processo infeccioso, principalmente nos casos em que há presença de microrganismos resistentes às manobras de desinfecção, tem sido alvo de muitas pesquisas. A proposta deste estudo foi avaliar, in vitro, o efeito antimicrobiano de bacteriófagos específicos diante de cinco cepas de Enterococcus faecalis e a ação de um lisado híbrido polivalente na eliminação da infecção causada por essas cinco cepas da mesma espécie. Foram utilizados 37 dentes unirradiculares humanos, recentemente extraídos e de proporções aproximadas. As coroas foram removidas e os canais instrumentados até a lima tipo K de número 45. Os espécimes foram, então, esterilizados e utilizados em dois experimentos distintos. O primeiro experimento utilizou 25 raízes divididas em cinco grupos de cinco espécimes. Três espécimes de cada grupo foram inoculados com uma das culturas bacterianas e seus fagos correspondentes na proporção 1:1, por um período de três horas a 37 °C, enquanto os outros dois, receberam a cultura de microrganismos ou somente meio de cultura (controle positivo e negativo, respectivamente). No segundo experimento, 11 espécimes receberam um inóculo formado pelas cinco cepas por um período de 10 dias de incubação a 37 °C, com o propósito de manter condições apropriadas para a penetração das bactérias no interior dos túbulos dentinários, e um outro espécime recebeu apenas meio de cultura (controle negativo). Essa penetração foi confirmada empregando-se microscopia ótica e eletrônica realizada em dois espécimes. Após o período de incubação, o lisado polivalente, preparado com os cinco fagos, foi aplicado por 24 horas a 37 °C em 8 espécimes, e os demais preenchidos com meio de cultura (controle positivo e negativo). Alíquotas do interior de todos os canais foram colhidas antes e depois do contato com os fagos e no segundo experimento, também 24 e 48 horas depois, para semeadura e contagem de unidades formadoras de colônia. Os resultados do primeiro experimento mostraram 100% de redução do crescimento bacteriano nos espécimes que receberam a suspensão de fagos específicos, em comparação a seus respectivos controles positivos, em todos os grupos. No segundo experimento, foi comparado o crescimento obtido após os 10 dias de infecção com aquele posterior a aplicação dos fagos, redução que variou entre 50% e 100%. Diante desses resultados, conclui-se que os bacteriófagos foram eficazes na diminuição dos microrganismos presentes no interior de canais radiculares e nos túbulos dentinários de dentes humanos. / Many studies have investigated different intracanal medications to control infection processes, especially in cases of microbial resistance to disinfection procedures. The purpose of this study was to evaluate the in vitro antimicrobial effect of specific bacteriophages on five isolates of Enterococcus faecalis, as well as the activity of a lysate cocktail in eliminating the infection caused by these bacteria. Thirty-seven recently extracted human teeth of approximately equal size and with single roots were used. The crowns were removed and each canal was prepared using K files,up to # 45, and sterile physiological saline. Specimens were then sterilized and used in two separate studies. The first study utilized 25 individual roots divided into five groups of five specimens each. Three specimens of each group were inoculated with one of the bacterial cultures and the corresponding bacteriophage in a proportion of 1:1, and incubated for three hours at 37°C; the other two specimens were inoculated with only the bacterial culture or only the culture medium (positive and negative controls, respectively). In the second study, 11 specimens were inoculated with all five strains and incubated for ten days at 37°C in order to allow bacteria to penetrate the interior of the dental tubules, and another one, received just the culture medium (negative control). Penetration into the tubules was confirmed by optical and electron microscopy of two specimens. Following incubation, the lysate cocktail prepared using all five bacteriophages was applied to the other 8 specimens for 24 hours at 37°C, and 2 specimens were filled with the culture medium (positive and negative controls). In the first study, samples were taken from the lumen of all canals before and after contact with bacteriophages; in the second, aliquots were also taken 24 and 48 hours after the bacteria were exposed to the phages. All samples were diluted and plated and the number of colony forming units was counted. In the first study, there was a 100% reduction in bacterial growth in specimens that received the specific bacteriophage suspension compared to the positive controls within each group. In the second study, after ten days the number of bacteria was reduced by 50% to 100% following the bacteriophage application. These results suggest that bacteriophages are effective in reducing the number of bacteria inside the root canal and in the dental tubules of human teeth.