Desde a década de 80, o nucleopoliedrovírus Anticarsia gemmatalis (AgMNPV) tem sido utilizado no Brasil como agente de controle biológico no combate à lagarta-da-soja, resultando para o país significativos benefícios econômicos e ecológicos. Este vírus envelopado, pertencente à família Baculoviridae, possui DNA circular de fita dupla (132.239 pb) contido em um capsídeo protéico, que pode estar ocluído em uma matriz para-cristalina. Neste trabalho, analisamos a expressão temporal de seus genes em duas linhagens celulares (UFL-AG-286 e IPLB-SF-9), por PCR em tempo real. Outro objetivo foi o estudo do efeito da multiplicação viral na malha gênica celular (GRN), visando analisar a expressão gênica celular diferenciada durante a infecção, através da técnica de hibridização subtrativa. Verificamos que todas as ORFs (exceto ORFs 64 e 83, que provavelmente não codificam a genes) foram expressas, com diferenças significativas entre as linhagens, principalmente em relação ao nível de expressão. Apesar disso, o grupo de genes ligados a replicação apresentou perfil de expressão similar nas duas linhagens, possivelmente por este ser um processo essencial à replicação viral. De uma forma geral, todos os genes apresentaram um perfil de expressão mais precoce do que o relatado na literatura, o que poderia ser tanto devido à replicação precoce do DNA do AgMNPV quanto até mesmo consequência da sensitividade do método utilizado. O agrupamento dos genes por k-means seguiu, em sua maioria, a hora pós-infecção (p.i.) onde a expressão de cada gene foi detectada, o que é coerente com a expressão gênica em cascata de baculovírus. Entretanto, por esta classificação não foi possível predizer função gênica para os genes pouco caracterizados. Em relação ao efeito da infecção do AgMNPV na GRN da UFL-AG-286, observamos que em 20h p.i., uma grande diversidade de genes e funções celulares foram hipo-expressas. / Since the 80s, the Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedroviruses (AgMNPV) has been used in Brazil as a biological control agent against the Anticarsia gemmatalis caterpillar in soybean fields, resulting in considerable economic and ecological benefits. This enveloped virus belongs to the Baculoviridae family. It has circular double-stranded DNA (132239 bp) enclosed in a capsid, which can be occluded in a crystalline matrix. In this work we elucidated the temporal gene expression profile of the AgMNPV-2D in two cell lines (UFL-AG-286 and IPLB-SF-9), using a real time PCR. Another objective was to study the effect of viral replication on the cellular gene regulatory network (GRN), in order to analyze the differential cellular gene expression during infection, using subtractive hybridization method. We found that most ORFs (except 64 and 83 ORFs that probably do not encode genes) were expressed, with significant differences between cell lines, mainly in expression intensity. However, the group of genes associated with viral DNA replication had similar expression profile in both lineages, possibly because replication is an essential process for viral multiplication. In general, most genes had earlier expression than reported in the literature, probably due to the early DNA replication in AgMNPV. Moreover, this could be a consequence of the method sensitivity used herein. We clustered genes with the k-means algorithm according to the time pos infection (p.i.) in which each gene expression was first detected and found it to be consistent with the typical cascade of gene expression known for baculovirus. Nonetheless, following this classification, it was not possible to predict gene function for poorly characterized genes. When looking at the impact of viral replication on the host GRN using subtractive hybridization, we found considerable inhibition of cellular transcription at 20h p.i. Furthermore at this time, a large and diverse set of cellular genes and functions were found to be hypo-regulated, indicative of an extensive effect of AgMNPV infection on the UFL-AG-286 GRN.

A broca da cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae) é naturalmente infectada por diversos patógenos, sendo os mais importantes Metarhizium anisopliae (Metsch.) (Ascomycota: Clavicipitaceae), Beauveria bassiana (Bals.) (Ascomycota: Cordycipitaceae) e vírus da granulose. Esses microrganismos podem co-infectar um mesmo indivíduo em condições de campo, mas os resultados das interações desses patógenos não são conhecidos. O presente trabalho objetivou determinar a virulência desses patógenos aplicados de forma isolada e em infecções mistas na fase larval de D. saccharalis em condições de laboratório sobre dieta artificial e em plantas de milho. A maioria das combinações resultou em efeito aditivo na mortalidade dos insetos (M. anisopliae + B. bassiana, M. anisopliae + DsGV e M. anisopliae + B. bassiana + DsGV), entretanto ficou evidenciado antagonismo entre B. bassiana e o granulovírus. Todos os cadáveres oriundos das aplicações associadas apresentaram sintomas de apenas um dos patógenos envolvidos na infecção. A produção de conídios de uma espécie de fungo nos cadáveres submetidos à co-infecção foi semelhante à produção de conídios da mesma espécie na infecção isolada. Na infecção mista, os dois fungos se desenvolveram na hemolinfa do hospedeiro, entretanto em um estágio tardio do processo infectivo ocorreu a exclusão de um dos patógenos. A infecção por B. bassiana diminuiu drasticamente a densidade de hemócitos circulantes na hemolinfa das lagartas, efeito não observado para M. anisopliae. Duas populações de laboratório de D. saccharalis, uma oriunda de Piracicaba-SP e outra de Araras-SP, foram testadas quanto à suscetibilidade aos fungos M. anisopliae e B. bassiana. A população de insetos de Piracicaba foi menos suscetível em 2009 do que a mesma população em 2008 e também em relação à população de Araras. Dessa forma, foi realizado um bioensaio comparando a suscetibilidade de insetos das duas populações e da progênie (F1) dos cruzamentos diretos entre elas, criadas nas mesmas condições bióticas e abióticas, para determinar se a suscetibilidade diferencial estaria relacionada a fatores genéticos. Não foram observadas diferenças significativas na suscetibilidade das duas populações e dos cruzamentos aos fungos. A suscetibilidade diferencial observada nos dois primeiros bioensaios provavelmente esteja relacionada às variações no sistema de criação, em componentes nutricionais e antimicrobianos da dieta e não a variações entre as populações dos hospedeiros. / The sugarcane borer, Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae) is naturally infected by various pathogens, the most important are Metarhizium anisopliae (Metsch) (Ascomycota: Clavicipitaceae), Beauveria bassiana (Bals.) (Ascomycota: Cordycipitaceae) and granulovirus. These microorganisms may coinfect the same host under field conditions, but the result of these pathogens interactions is not known. This study investigated the virulence of these pathogens applied separately and together on larvae of D. saccharalis in the laboratory on artificial diet and on corn plants. Most combinations resulted in additive effect on insect mortalities (M. anisopliae + B. bassiana, M. anisopliae + DsGV and M. anisopliae + B. bassiana + DsGV), however it became apparent antagonism between B. bassiana and the granulovírus. In all cadavers resulted from mixed applications, only one pathogen sporulated or externalized their symptoms in the host. Production of conidia of one fungal species on the cadavers subjected to co-infection was similar to the production of conidia of the same species in a single infection. In mixed infection, the two fungi have developed in the hemolymph of the host, and the exclusion of one pathogen occurred at a later stage of the infective process. Infection with B. bassiana has drastically reduced the density of circulating hemocytes in the hemolymph of the larvae, which was not observed for M. anisopliae. Two laboratory populations of D. saccharalis, one coming from Piracicaba-SP and other from Araras-SP, were tested for susceptibility to M. anisopliae and B. bassiana. The insect population from Piracicaba was less susceptible to application of fungi in 2009 compared to the same population in 2008 and compared to the Araras population. Therefore, a bioassay was performed comparing the susceptibility of the two populations and the progeny (F1) of direct crossings between them, using insects reared in the same conditions. This assay was performed to determine if the differential susceptibility would be related to genetic factors. No significant differences were observed in the susceptibility of insect populations and crossings to both fungi. The differential susceptibility observed in the first two assays was probably related to variations in the rearing system and nutritional and antimicrobial components in the diet and not due to variations among host populations.

Desde a década de 80, o nucleopoliedrovírus Anticarsia gemmatalis (AgMNPV) tem sido utilizado no Brasil como agente de controle biológico no combate à lagarta-da-soja, resultando para o país significativos benefícios econômicos e ecológicos. Este vírus envelopado, pertencente à família Baculoviridae, possui DNA circular de fita dupla (132.239 pb) contido em um capsídeo protéico, que pode estar ocluído em uma matriz para-cristalina. Neste trabalho, analisamos a expressão temporal de seus genes em duas linhagens celulares (UFL-AG-286 e IPLB-SF-9), por PCR em tempo real. Outro objetivo foi o estudo do efeito da multiplicação viral na malha gênica celular (GRN), visando analisar a expressão gênica celular diferenciada durante a infecção, através da técnica de hibridização subtrativa. Verificamos que todas as ORFs (exceto ORFs 64 e 83, que provavelmente não codificam a genes) foram expressas, com diferenças significativas entre as linhagens, principalmente em relação ao nível de expressão. Apesar disso, o grupo de genes ligados a replicação apresentou perfil de expressão similar nas duas linhagens, possivelmente por este ser um processo essencial à replicação viral. De uma forma geral, todos os genes apresentaram um perfil de expressão mais precoce do que o relatado na literatura, o que poderia ser tanto devido à replicação precoce do DNA do AgMNPV quanto até mesmo consequência da sensitividade do método utilizado. O agrupamento dos genes por k-means seguiu, em sua maioria, a hora pós-infecção (p.i.) onde a expressão de cada gene foi detectada, o que é coerente com a expressão gênica em cascata de baculovírus. Entretanto, por esta classificação não foi possível predizer função gênica para os genes pouco caracterizados. Em relação ao efeito da infecção do AgMNPV na GRN da UFL-AG-286, observamos que em 20h p.i., uma grande diversidade de genes e funções celulares foram hipo-expressas. / Since the 80s, the Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedroviruses (AgMNPV) has been used in Brazil as a biological control agent against the Anticarsia gemmatalis caterpillar in soybean fields, resulting in considerable economic and ecological benefits. This enveloped virus belongs to the Baculoviridae family. It has circular double-stranded DNA (132239 bp) enclosed in a capsid, which can be occluded in a crystalline matrix. In this work we elucidated the temporal gene expression profile of the AgMNPV-2D in two cell lines (UFL-AG-286 and IPLB-SF-9), using a real time PCR. Another objective was to study the effect of viral replication on the cellular gene regulatory network (GRN), in order to analyze the differential cellular gene expression during infection, using subtractive hybridization method. We found that most ORFs (except 64 and 83 ORFs that probably do not encode genes) were expressed, with significant differences between cell lines, mainly in expression intensity. However, the group of genes associated with viral DNA replication had similar expression profile in both lineages, possibly because replication is an essential process for viral multiplication. In general, most genes had earlier expression than reported in the literature, probably due to the early DNA replication in AgMNPV. Moreover, this could be a consequence of the method sensitivity used herein. We clustered genes with the k-means algorithm according to the time pos infection (p.i.) in which each gene expression was first detected and found it to be consistent with the typical cascade of gene expression known for baculovirus. Nonetheless, following this classification, it was not possible to predict gene function for poorly characterized genes. When looking at the impact of viral replication on the host GRN using subtractive hybridization, we found considerable inhibition of cellular transcription at 20h p.i. Furthermore at this time, a large and diverse set of cellular genes and functions were found to be hypo-regulated, indicative of an extensive effect of AgMNPV infection on the UFL-AG-286 GRN.

Comparadas com células de mamífero, as células de inseto são mais fáceis de cultivar, não acumulam quantidade significativa de sub-produtos tóxicos e apresentam maiores rendimentos na expressão de proteínas heterólogas, porém apresentam uma menor capacidade de realizar modificações pós-traducionais. Células de inseto podem ser empregadas na produção in vitro de baculovírus, usados como pesticidas biológicos. As células Sf-9 estão entre as células de inseto com uso mais difundido. Entender o metabolismo destas células permitirá melhorias nos processos que as empregam, entretanto, ainda há relativamente pouca informação sobre o assunto. Considerando mais especificamente o uso dessas células para produção de baculovírus, também é necessário mais entendimento sobre o processo infectivo e parâmetros que o afetam. Este trabalho teve como objetivo estudar a influência da suplementação do meio de cultivo com diferentes aminoácidos no desenvolvimento das células Sf-9 e determinar a concentração de oxigênio dissolvido ideal para o cultivo destas células, visando elaborar uma metodologia de cultivo em biorreator otimizada e, paralelamente, estudar o processo de infecção de cultivos dessas células com o baculovírus Spodoptera frugiperda (SfMNPV) em diferentes escalas. Para estudar a influência que a adição de aminoácidos ao meio tem sobre o crescimento celular, células Sf-9 foram cultivadas em frascos schotts de 100 e 500 mL, com 20 mL do meio SF900III SFM (serum free medium) suplementados com cisteína, prolina, serina ou asparagina. Os resultados foram comparados com cultivos feitos sem suplementação (controles). A condição que apresentou o melhor resultado em frasco schott foi replicada em biorreator de 1 L de volume útil. Para estudar a influência do oxigênio dissolvido (O.D.) foram testados diferentes setpoints de O.D. em cultivos em biorreator. Em tais ensaios foram testadas as concentrações de O.D de 10%, 30% e 50% da saturação com o ar. Para o estudo do processo de infecção, foram realizadas infecções em frascos schotts de 500 mL, com 20 mL de cultivo, e em biorreator de 1 L. Também foram realizadas infecções em garrafas T-25 como forma de controle de virulência do inóculo viral e do vírus produzido. As principais variáveis analisadas foram µmáx, Xvmáx YX/Glc. Nos ensaios de influencia de O.D., analisou-se também qO2 e qCO2 e, nos ensaios de infecção, a porcentagem de células contendo poliedros. A suplementação com prolina foi prejudicial ao cultivo. A adição de asparagina não teve qualquer influência no desenvolvimento celular. Os resultados das adições de cisteína e serina não foram muito conclusivos, em alguns ensaios houve aumento de Xvmáx, já em outros não foi notado efeito significativo. Nos ensaios em biorreator, todos os valores de O.D. testados apresentaram resultados semelhantes, já a adição de cisteína ao meio em biorreator foi bastante maléfica ao crescimento celular. Os ensaios de infecção mostraram que células Sf-9 são bastante susceptíveis à infecção pelo baculovírus Spodoptera frugiperda e boas produtoras de poliedros virais, e que a vazão gasosa tem efeito negativo na concentração viral na fase líquida dos cultivos em biorreator (título viral). / Compared to mammalian cells, insect cells are easier to culture, do not accumulate significant amounts of toxic byproducts and are capable of higher heterologous protein yields, but have a lower ability to perform post-translational modifications. Insect cells may be employed in the in vitro production of baculoviruses, used as biological pesticides. Sf-9 cells are among the most used insect cell lines. Understanding the metabolism of these cells would allow improvements in the processes that employ them, however, Howeverreports on the metabolism and physiology of Sf-9 cells and insect cells in general are scarce. When considering the use of these cells for baculovirus production, it is also necessary more understanding about the infective process and parameters that can affect it. This work aimed to study the influence that the supplementation of the culture medium with different amino acids have on the development of Sf-9 cells and to determine the ideal dissolved oxygen concentration for the culture of these cells, aiming to elaborate an optimized bioreactor culture methodology and, in parallel, to study the infection process of these cells with the Spodoptera frugiperda baculovirus (SfMNPV) at different scales. To study the influence that the addition of amino acids to the medium has on cell growth, Sf-9 cells were cultured in 100 and 500mL schott flasks with 20mL SF900III SFM (serum free medium) supplemented with cysteine, proline, serine or asparagine. The results were compared with cultures without supplementation (controls). The condition that presented the best result in schott flasks was replicated in a 1L bioreactor. To study the influence of dissolved oxygen (O.D.), experiments with different values of O.D. were conducted at a 1L bioreactor. The O.D. tested were 10%, 30% and 50% of air saturation. To study the infection process, infections were carried out in 500 mL schotted flasks, with 20 mL of culture, and in a 1L bioreactor. Infections were also carried out in 25 cm² T-flasks as a form of virulence control of the viral inoculum and virus produced. The main variables analyzed were µmax, Xvmax YX/Glc. In the O.D. tests, qO2 and qCO2 were also analyzed and, in the infection assays, the percentage of cells containing polyhedra. Proline supplementation was detrimental to the culture. The addition of asparagine had no influence on cellular growth. The results of cysteine and serine additions were not very conclusive, in some studies there was an increase of Xvmax, while in others no significant effect was observed. In the bioreactor trials, all O.D. tested showed similar results and the addition of cysteine to the medium was quite harmful to cell growth. Infection assays showed that Sf-9 cells are quite susceptible to infection by the Spodoptera frugiperda baculovirus and good producers of viral polyhedra, and that the gas flow has a negative effect on the viral concentration in the liquid phase of the bioreactor cultures (viral titer).

Miu Fei Fei. / On t.p. "42" are subscripts following the word "MSP-1" in the title. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2003. / Includes bibliographical references (leaves 117-125). / Abstracts in English and Chinese. / ACKNOWLEGEMENTS --- p.i / ABSTRACT --- p.ii / TABLE OF CONTENTS --- p.v / LIST OF FIGURE --- p.vii / LIST OF ABBREVIATIONS --- p.ix / CHAPTERS: / Chapter 1. --- BACKGROUND OF MALARIA / Chapter 1.1 --- Epidemilogy --- p.2 / Chapter 1.2 --- Mode of Infection --- p.4 / Chapter 1.3 --- Conventional Control & Vaccination --- p.9 / Chapter 1.4 --- Vaccine Candidate PfMSV-142 --- p.16 / Chapter 1.5 --- Cloning and Expression of pfMSP-142 --- p.26 / Chapter 1.6 --- Aims of Study --- p.32 / Chapter 2. --- Materials and Methods / Chapter 2.1 --- Materials --- p.32 / Chapter 2.2 --- Methods --- p.38 / Chapter 3. --- Construction of recombinants N-PfMSP-142 and C- PfMSP-142 / Chapter 3.1 --- Construction of C-PfMSP-l42 --- p.51 / Chapter 3.2 --- Construction ofN-PfMSP-l42 --- p.56 / Chapter 4. --- Purification with IMAC / Chapter 4.1 --- Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) --- p.58 / Chapter 4.2 --- Purification ofN-PfMSP-l42 --- p.61 / Chapter 4.3 --- Purification profile of N-PfMSP-142 --- p.68 / Chapter 4.4 --- Purification of C-PfMSP-l42 --- p.70 / Chapter 4.5 --- Purification profile of C-PfMSP-142 --- p.73 / Chapter 4.6 --- Expression pattern of recombinants PfMSP-142 --- p.76 / Chapter 5. --- Purification combined with other chromatography method / Chapter 5.1 --- Affinity chromatography --- p.78 / Chapter 5.2 --- Gel filtration chromatography --- p.80 / Chapter 5.3 --- Ion exchange chromatography --- p.83 / Chapter 5.4 --- Conclusion --- p.93 / Chapter 6. --- Characteristic of IMAC products --- p.94 / Chapter 7. --- Characteristic of N-hisPfMSP-l42 & C-hisPfMSP-l --- p.42 / Chapter 7.1 --- Immunogenitcity of N-PfMSP-l42 and C-PfMSP-142 --- p.100 / Chapter 7.2 --- Competitive ELISA --- p.105 / Chapter 8. --- Discussion --- p.107 / REFERENCE --- p.117

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2004. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains xv, 181 p. : ill. (some col.). Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references.

Orientadora: Profa. Dra. Márcia Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014. / A febre do Oropouche, causada pelo vírus Oropouche (OROV), é uma arbovirose de grande interesse para a saúde pública devido à alta incidência nas áreas tropicais da América do Sul e Central. Devido à inespecificidade dos sintomas, a febre do Oropouche é facilmente confundida com a dengue e uma série de arboviroses. Tais semelhanças sintomáticas dificultam o diagnóstico preciso para OROV, requerendo o desenvolvimento de estudos diferenciais. O diagnóstico laboratorial por isolamento viral é laborioso e depende de infraestrutura e pessoal especializado, disponível em poucos laboratórios brasileiros. O diagnóstico imunoenzimático possui limitações quanto à utilização de partículas virais infecciosas e também por produzirem reações cruzadas com outros vírus da mesma família. Portanto, com o intuito de realizar o diagnóstico sorológico específico para a febre causada por OROV, esse projeto teve por objetivo a construção de antígenos recombinantes a partir dos genes que codificam as proteínas estruturais Ns, G1 e G2 utilizando sistema de expressão eucariótico em células de insetos. Como resultados foram obtidos os baculovírus recombinantes para as proteínas Ns, G1 e G2 de OROV. O baculovírus correspondente à proteína G1 de OROV demonstrou instabilidade, provavelmente devido ao grande tamanho da construção recombinante. Testes de expressão das proteínas Ns e G2, em células de Spodoptera frugiperda 9 (Sf-9) e High Five, com crescimento em suspensão, revelaram que em Sf-9 a proteína Ns foi exportada para o meio extracelular, enquanto que a proteína G2 foi encontrada na fração sólida da cultura. Não foi detectada expressão das proteínas Ns e G2 de OROV em células High FiveTM. A proteína recombinante Ns foi expressa pela primeira vez em sistema eucariótico, porém a quantidade obtida foi insuficiente para iniciar os ensaios sorológicos. A investigação da interação da proteína Ns com ácidos nucleicos sugere que no sistema de expressão em células de insetos, a mesma está associada ao DNA. Estudos estruturais serão necessários para confirmar os resultados obtidos. / Oropouche fever (OF), caused by Oropouche virus (OROV),is an arboviruse of great interest to public health due to the high incidence in tropical areas of Central and South America. Due to its unspecific clinical signs, OF is usually mistaken with dengue fever and others arboviruses. Such symptomatic similarities hinder accurate diagnosis for OROV, requiring the development of differential studies. Laboratory diagnosis by viral isolation is hard and depends on infrastructure and trained personnel available in few Brazilians laboratorie's. The immuno diagnostic tests present limitations due the use of infectious viral particles and also produce cross reactions with other viruses of the same family. Therefore, in order to perform specific serological diagnosis of OF, the aim of this project was the construction of recombinant antigens based on the structural proteins Ns, G1 and G2 using an eukaryotic insect cells expression system. The results correspond to the achievement of recombinant baculovirus for the proteins Ns, G1 and G2 OROV. The G1 recombinant baculovirus showed instability, probably due to large size of the construct. NS and G2 proteins expression experiments in Spodoptera frugiperda 9 (Sf-9) and High Five, grown in suspension revealed that in Sf-9 NS protein was exported into the extracellular environment, while the G2 protein was found in the culture solid fraction. We did not detect expression of Ns and G2 OROV proteins in High Five cells. The Ns recombinant protein was expressed for the first time in an eukaryotic system, but the amount of protein obtained was insufficient to perform serological assays. The investigation of the interaction of the Ns protein with nucleic acids suggests that in the Baculovirus expression system, it is associated with DNA. Structural studies are needed to confirm the results.

Comparadas com células de mamífero, as células de inseto são mais fáceis de cultivar, não acumulam quantidade significativa de sub-produtos tóxicos e apresentam maiores rendimentos na expressão de proteínas heterólogas, porém apresentam uma menor capacidade de realizar modificações pós-traducionais. Células de inseto podem ser empregadas na produção in vitro de baculovírus, usados como pesticidas biológicos. As células Sf-9 estão entre as células de inseto com uso mais difundido. Entender o metabolismo destas células permitirá melhorias nos processos que as empregam, entretanto, ainda há relativamente pouca informação sobre o assunto. Considerando mais especificamente o uso dessas células para produção de baculovírus, também é necessário mais entendimento sobre o processo infectivo e parâmetros que o afetam. Este trabalho teve como objetivo estudar a influência da suplementação do meio de cultivo com diferentes aminoácidos no desenvolvimento das células Sf-9 e determinar a concentração de oxigênio dissolvido ideal para o cultivo destas células, visando elaborar uma metodologia de cultivo em biorreator otimizada e, paralelamente, estudar o processo de infecção de cultivos dessas células com o baculovírus Spodoptera frugiperda (SfMNPV) em diferentes escalas. Para estudar a influência que a adição de aminoácidos ao meio tem sobre o crescimento celular, células Sf-9 foram cultivadas em frascos schotts de 100 e 500 mL, com 20 mL do meio SF900III SFM (serum free medium) suplementados com cisteína, prolina, serina ou asparagina. Os resultados foram comparados com cultivos feitos sem suplementação (controles). A condição que apresentou o melhor resultado em frasco schott foi replicada em biorreator de 1 L de volume útil. Para estudar a influência do oxigênio dissolvido (O.D.) foram testados diferentes setpoints de O.D. em cultivos em biorreator. Em tais ensaios foram testadas as concentrações de O.D de 10%, 30% e 50% da saturação com o ar. Para o estudo do processo de infecção, foram realizadas infecções em frascos schotts de 500 mL, com 20 mL de cultivo, e em biorreator de 1 L. Também foram realizadas infecções em garrafas T-25 como forma de controle de virulência do inóculo viral e do vírus produzido. As principais variáveis analisadas foram µmáx, Xvmáx YX/Glc. Nos ensaios de influencia de O.D., analisou-se também qO2 e qCO2 e, nos ensaios de infecção, a porcentagem de células contendo poliedros. A suplementação com prolina foi prejudicial ao cultivo. A adição de asparagina não teve qualquer influência no desenvolvimento celular. Os resultados das adições de cisteína e serina não foram muito conclusivos, em alguns ensaios houve aumento de Xvmáx, já em outros não foi notado efeito significativo. Nos ensaios em biorreator, todos os valores de O.D. testados apresentaram resultados semelhantes, já a adição de cisteína ao meio em biorreator foi bastante maléfica ao crescimento celular. Os ensaios de infecção mostraram que células Sf-9 são bastante susceptíveis à infecção pelo baculovírus Spodoptera frugiperda e boas produtoras de poliedros virais, e que a vazão gasosa tem efeito negativo na concentração viral na fase líquida dos cultivos em biorreator (título viral). / Compared to mammalian cells, insect cells are easier to culture, do not accumulate significant amounts of toxic byproducts and are capable of higher heterologous protein yields, but have a lower ability to perform post-translational modifications. Insect cells may be employed in the in vitro production of baculoviruses, used as biological pesticides. Sf-9 cells are among the most used insect cell lines. Understanding the metabolism of these cells would allow improvements in the processes that employ them, however, Howeverreports on the metabolism and physiology of Sf-9 cells and insect cells in general are scarce. When considering the use of these cells for baculovirus production, it is also necessary more understanding about the infective process and parameters that can affect it. This work aimed to study the influence that the supplementation of the culture medium with different amino acids have on the development of Sf-9 cells and to determine the ideal dissolved oxygen concentration for the culture of these cells, aiming to elaborate an optimized bioreactor culture methodology and, in parallel, to study the infection process of these cells with the Spodoptera frugiperda baculovirus (SfMNPV) at different scales. To study the influence that the addition of amino acids to the medium has on cell growth, Sf-9 cells were cultured in 100 and 500mL schott flasks with 20mL SF900III SFM (serum free medium) supplemented with cysteine, proline, serine or asparagine. The results were compared with cultures without supplementation (controls). The condition that presented the best result in schott flasks was replicated in a 1L bioreactor. To study the influence of dissolved oxygen (O.D.), experiments with different values of O.D. were conducted at a 1L bioreactor. The O.D. tested were 10%, 30% and 50% of air saturation. To study the infection process, infections were carried out in 500 mL schotted flasks, with 20 mL of culture, and in a 1L bioreactor. Infections were also carried out in 25 cm² T-flasks as a form of virulence control of the viral inoculum and virus produced. The main variables analyzed were µmax, Xvmax YX/Glc. In the O.D. tests, qO2 and qCO2 were also analyzed and, in the infection assays, the percentage of cells containing polyhedra. Proline supplementation was detrimental to the culture. The addition of asparagine had no influence on cellular growth. The results of cysteine and serine additions were not very conclusive, in some studies there was an increase of Xvmax, while in others no significant effect was observed. In the bioreactor trials, all O.D. tested showed similar results and the addition of cysteine to the medium was quite harmful to cell growth. Infection assays showed that Sf-9 cells are quite susceptible to infection by the Spodoptera frugiperda baculovirus and good producers of viral polyhedra, and that the gas flow has a negative effect on the viral concentration in the liquid phase of the bioreactor cultures (viral titer).

O interesse em estudar o cultivo das células de inseto está relacionado entre outros usos a sua utilização na produção de biopesticidas. Há muitos anos os pesticidas químicos vêm contribuindo no controle de pragas na agricultura. Entretanto, o uso desses compostos prolongadamente tem resultado na seleção de insetos resistentes e em poluição ambiental. Diante disso, torna-se necessário o desenvolvimento e aprimoramento dos bioinseticidas. No Brasil, o baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) foi o principal agente de controle biológico da praga da soja Anticarsia gemmatalis. Assim, estudos que viabilizem a produção desses vírus in vitro possibilitariam uma produção mais controlada e de melhor qualidade desses biopesticidas. Neste trabalho, investigou-se a suscetibilidade à infecção por AgMNPV de diferentes linhagens celulares de Sf21 e o crescimento dessas células em diferentes sistemas: cultivos em schotts, em spinner e em biorreator, variando-se a idade do inóculo (IA) e a concentração celular inicial (X0). Constatou-se variação no perfil de infecção das linhagens, sendo as linhagens mais adequadas para a produção de bioinseticida as linhagens de Sf21 denominadas EMBRAPA, UFRN e GibcoG, uma vez que estas apresentaram mais do que 40 % das células com poliedros em cultivos em suspensão, enquanto a linhagem denominada GibcoSF teve menos de 2 % das células infectadas com poliedros. Ao se estudar o efeito do número de subcultivos na morfologia e crescimento celular, foi averiguado um aumento no diâmetro de 10 % e no volume de 26 % das células UFRN em relação às células GibcoSF. Além disso, o crescimento das células UFRN foi 49% menor do que das células GibcoSF. Quando realizado o Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para se analisar o efeito da IA e a X0 na taxa de crescimento específica máxima (?max) e na concentração celular máxima (Xvmax) em cultivos em schott com células UFRN, obteve-se um modelo empírico. Quando analisadas as variáveis IA e X0 separadamente, não foram encontradas diferenças significativas para as respostas Xvmax e ?max em relação a X0. Para a IA, entretanto, obteve-se os resultados mais satisfatórios para os inóculos com IA de 72 e 96 horas: Xvmax de 5,97.106 cel/mL e 5,99.106 cel/mL, e ?max de 0,70 dia-1 e 0,63 dia-1, respectivamente. Nos cultivos em spinner com células UFRN, foi observada a formação de grumos, o que levou a Xvmax de 2,00.106 cel/mL. No cultivo em biorreator com células UFRN, foi obtido um Xvmax de 6,21.106 cel/mL, ?max de 0,70 dia-1, Qo2 na fase exponencial de 67,3 ± 3,6 .10-18 molO2/cel/s, rendimento de glicose em célula igual a 1,0.109 cel/g de glicose e um rendimento de glutamina em células de 3,0.109 cel/mL. Comprovou-se, portanto, a existência de alterações na infecção entre diferentes linhagens de Sf21; a importância do estado fisiológico da célula nos subcultivos, a ocorrência de mudanças no crescimento celular de acordo com os sistemas de cultivo e o efeito do número de subcultivos na morfologia e crescimento de células Sf21. / Investigate the cultivation of insect cells is related to its use in the production of biopesticides among others. For many years, chemical pesticides have contributed in pest control in agriculture. However, the use of these compounds for prolonged periods has resulted in the selection of resistant insects and environmental pollution. Therefore, it is necessary the development and improvement of biopesticides. In Brazil, the baculovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is the main biological control agent of the plague of soy Anticarsia gemmatalis. Thus, studies that enhance the production of these viruses in vitro would allow a more controlled production and better quality of biopesticides. In the present research, it was investigated the susceptibility of different Sf21 cell lines to infection by AgMNPV and the growth of these cells in different systems: cultivations in schotts, in spinner flasks and in bioreactor, varying the inoculum age (IA) and initial cell concentration (X0). Variation was observed in the lineage\'s infection profile. The most appropriate lineage for the production of biopesticida where the ones denominated EMBRAPA, UFRN and GibcoG, since these showed more than 40% of the infected cells with polyhedra, while the one denominated GibcoSF had less than 2% of the infected cells with polyhedra. When studying the effect of the number of subcultures in morphology and in cell growth, an increase of 10% of the diameter and 26% in the volume of the UFRN cells was observed compared to the GibcoSF cells. Moreover, the cell growth of UFRN was 49% lower than the GibcoSF\'s. When performed the Rotational Central Composite Design (RCCD) to analyze the effect of IA and X0, the maximum specific growth rate (?max) and the maximum cell concentration (Xvmax) in cultures in schott with UFRN cells, it was obtained an empirical model. When the IA and X0 were separately analysed, it was not found significant differences for Xvmax and ?max in relation to X0. For IA, however, it was achieved the most satisfactory results for inocula with IA of 72 and 96 hours: Xvmax equals to 5.97x106 cells/mL and to 5.99x106 cells/ml, and ?max of 0.70 day-1 and 0.63 day-1, respectively. Cultures in spinner with UFRN cells clumped what led to Xvmax of 2.00x106 cells/mL. In cultivation in bioreactor with UFRN cells, was reached Xvmax of 6.21x106 cells/mL, ?max of 0.70 day-1, Qo2 in the exponential phase of 67.3 ± 3.6x10-18 molO2/cell/s, glucose to the cell yield equal to 1.0x109 cell/g of glucose and glutamine to cell yield of 3.0x109 cell/g of glutamine. It was shown, therefore, the existence of the infection alterations among different lineages of Sf21, the importance of the physiological state of the cell for the subcultivation, the occurrence of changes in cell growth according to the cultivation systems and the effect of the number of subcultivation in morphology and in growth of Sf21 cells.

O interesse em estudar o cultivo das células de inseto está relacionado entre outros usos a sua utilização na produção de biopesticidas. Há muitos anos os pesticidas químicos vêm contribuindo no controle de pragas na agricultura. Entretanto, o uso desses compostos prolongadamente tem resultado na seleção de insetos resistentes e em poluição ambiental. Diante disso, torna-se necessário o desenvolvimento e aprimoramento dos bioinseticidas. No Brasil, o baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) foi o principal agente de controle biológico da praga da soja Anticarsia gemmatalis. Assim, estudos que viabilizem a produção desses vírus in vitro possibilitariam uma produção mais controlada e de melhor qualidade desses biopesticidas. Neste trabalho, investigou-se a suscetibilidade à infecção por AgMNPV de diferentes linhagens celulares de Sf21 e o crescimento dessas células em diferentes sistemas: cultivos em schotts, em spinner e em biorreator, variando-se a idade do inóculo (IA) e a concentração celular inicial (X0). Constatou-se variação no perfil de infecção das linhagens, sendo as linhagens mais adequadas para a produção de bioinseticida as linhagens de Sf21 denominadas EMBRAPA, UFRN e GibcoG, uma vez que estas apresentaram mais do que 40 % das células com poliedros em cultivos em suspensão, enquanto a linhagem denominada GibcoSF teve menos de 2 % das células infectadas com poliedros. Ao se estudar o efeito do número de subcultivos na morfologia e crescimento celular, foi averiguado um aumento no diâmetro de 10 % e no volume de 26 % das células UFRN em relação às células GibcoSF. Além disso, o crescimento das células UFRN foi 49% menor do que das células GibcoSF. Quando realizado o Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para se analisar o efeito da IA e a X0 na taxa de crescimento específica máxima (?max) e na concentração celular máxima (Xvmax) em cultivos em schott com células UFRN, obteve-se um modelo empírico. Quando analisadas as variáveis IA e X0 separadamente, não foram encontradas diferenças significativas para as respostas Xvmax e ?max em relação a X0. Para a IA, entretanto, obteve-se os resultados mais satisfatórios para os inóculos com IA de 72 e 96 horas: Xvmax de 5,97.106 cel/mL e 5,99.106 cel/mL, e ?max de 0,70 dia-1 e 0,63 dia-1, respectivamente. Nos cultivos em spinner com células UFRN, foi observada a formação de grumos, o que levou a Xvmax de 2,00.106 cel/mL. No cultivo em biorreator com células UFRN, foi obtido um Xvmax de 6,21.106 cel/mL, ?max de 0,70 dia-1, Qo2 na fase exponencial de 67,3 ± 3,6 .10-18 molO2/cel/s, rendimento de glicose em célula igual a 1,0.109 cel/g de glicose e um rendimento de glutamina em células de 3,0.109 cel/mL. Comprovou-se, portanto, a existência de alterações na infecção entre diferentes linhagens de Sf21; a importância do estado fisiológico da célula nos subcultivos, a ocorrência de mudanças no crescimento celular de acordo com os sistemas de cultivo e o efeito do número de subcultivos na morfologia e crescimento de células Sf21. / Investigate the cultivation of insect cells is related to its use in the production of biopesticides among others. For many years, chemical pesticides have contributed in pest control in agriculture. However, the use of these compounds for prolonged periods has resulted in the selection of resistant insects and environmental pollution. Therefore, it is necessary the development and improvement of biopesticides. In Brazil, the baculovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is the main biological control agent of the plague of soy Anticarsia gemmatalis. Thus, studies that enhance the production of these viruses in vitro would allow a more controlled production and better quality of biopesticides. In the present research, it was investigated the susceptibility of different Sf21 cell lines to infection by AgMNPV and the growth of these cells in different systems: cultivations in schotts, in spinner flasks and in bioreactor, varying the inoculum age (IA) and initial cell concentration (X0). Variation was observed in the lineage\'s infection profile. The most appropriate lineage for the production of biopesticida where the ones denominated EMBRAPA, UFRN and GibcoG, since these showed more than 40% of the infected cells with polyhedra, while the one denominated GibcoSF had less than 2% of the infected cells with polyhedra. When studying the effect of the number of subcultures in morphology and in cell growth, an increase of 10% of the diameter and 26% in the volume of the UFRN cells was observed compared to the GibcoSF cells. Moreover, the cell growth of UFRN was 49% lower than the GibcoSF\'s. When performed the Rotational Central Composite Design (RCCD) to analyze the effect of IA and X0, the maximum specific growth rate (?max) and the maximum cell concentration (Xvmax) in cultures in schott with UFRN cells, it was obtained an empirical model. When the IA and X0 were separately analysed, it was not found significant differences for Xvmax and ?max in relation to X0. For IA, however, it was achieved the most satisfactory results for inocula with IA of 72 and 96 hours: Xvmax equals to 5.97x106 cells/mL and to 5.99x106 cells/ml, and ?max of 0.70 day-1 and 0.63 day-1, respectively. Cultures in spinner with UFRN cells clumped what led to Xvmax of 2.00x106 cells/mL. In cultivation in bioreactor with UFRN cells, was reached Xvmax of 6.21x106 cells/mL, ?max of 0.70 day-1, Qo2 in the exponential phase of 67.3 ± 3.6x10-18 molO2/cell/s, glucose to the cell yield equal to 1.0x109 cell/g of glucose and glutamine to cell yield of 3.0x109 cell/g of glutamine. It was shown, therefore, the existence of the infection alterations among different lineages of Sf21, the importance of the physiological state of the cell for the subcultivation, the occurrence of changes in cell growth according to the cultivation systems and the effect of the number of subcultivation in morphology and in growth of Sf21 cells.