Baculovírus são vírus específicos de inseto que infectam principalmente membros da ordem Lepidoptera. Diatraea saccharalis granulovírus (DsGV) foi isolado de larvas de Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae), a broca-da-cana-de-açúcar, um dos insetos-praga de maior importância na cultura de cana-de-açúcar no Brasil. O genoma completo de DsGV foi obtido através do sequenciamento 454 (Roche). O genoma de DsGV apresentou 98.463 pb e potencialmente codifica 116 genes. Foram identificados os 37 genes conservados em todos os baculovírus, 19 genes específicos de betabaculovírus e 17 genes únicos. DsGV é o primeiro betabaculovírus que possui o gene gp64, que codifica uma proteína de fusão, originalmente encontrado apenas em alfabaculovírus do grupo I. A análise filogenética utilizando a concatenação das sequências deduzidas de aminoácidos de 30 genes conservados em 61 baculovírus totalmente sequenciados sugere que DsGV está inserido no clado b do grupo dos betabaculovírus e parece estar mais estritamente relacionado a 5 GVs (ChocGV, PiraGV, ClanGV, CpGV e CrleGV). / Baculoviruses are insect specific viruses that infect mainly members of the Order Lepidoptera. Diatraea saccharalis granulovirus (DsGV) was isolated from Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae), one of the most important insect pest of the sugar cane culture in Brazil. The genome of DsGV was obtained by the 454 sequencing system (Roche). Our results showed that the nucleotide sequence of the DsGV genome is 98.463 bp in length and potentially encodes 116 putative genes. It contains the 37 baculovirus core genes, a set of 19 betabaculovirus-specific genes and 17 putative DsGV genes were not found in any genome of the baculoviruses sequenced up to the present. DsGV is the first betabaculovirus sequenced so far that has the gp64 envelope fusion protein gene, originally found only in alphabaculovirus group I. Phylogenetic analysis performed with concatamers of 30 conserved proteins from 61 fully sequenced baculovirus genomes suggests that DsGV is a member of clade b of the betabaculovirus and seems to be closer to 5 GVs (ChocGV, PiraGV, ClanGV, CpGV e CrleGV).

Thesis (M.S.)--West Virginia University, 2002. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains viii, 60 p. : ill. (some col.). Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 51-55).

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:06:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 haroldo_junior_ioc_dout_2015.pdf: 2633312 bytes, checksum: 02a75ad07873abdb519b939eb64b351c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus da Hepatite A (HAV) é o principal agente etiológico das hepatites virais agudas e estima-se que ocasione 1,5 milhão de novas infecções no mundo anualmente. Apesar da eficácia apresentada pelas vacinas comerciais, a replicação do HAV em cultura de células é lenta e apresenta baixo rendimento, o que torna a sua produção difícil e dispendiosa. Nesse contexto, o uso de proteínas recombinantes do HAV pode representar uma alternativa ao modelo de vacina existente. O presente trabalho teve como objetivo expressar e avaliar a imunogenicidade das partículas virais destituídas de ácido nucleico (VLPs) e da proteína VP1 do HAV. As VLPs foram geradas a partir do sistema baculovírus/células de inseto através da infecção de células de inseto com baculovírus recombinantes contendo as regiões P1-2A e P3 do genoma do HAV. A poliproteína P1-2A foi expressa, clivada e se organizou em estruturas que continham epitopos conformacionais de neutralização. Partículas com características similares ao HAV foram identificadas por microscopia eletrônica, sugerindo que as proteínas expressas se montaram em VLPs. Em paralelo, a VP1 foi expressa nos sistemas baculovírus/células de inseto e Escherichia coli Níveis mais elevados de expressão foram obtidos em E. coli, o que consequentemente aumentou a taxa de recuperação da proteína purificada. A VP1 derivada de E. coli foi utilizada nos ensaios de antigenicidade e mostrou reatividade frente aos soros de pacientes infectados pelo HAV, o que demonstra seu potencial como um marcador para diagnóstico. Para os estudos de imunogenicidade, a VP1 derivada de E. coli foi combinada a dois adjuvantes, o hidróxido de alumínio (A1(OH)3) e o adjuvante a base de saponina. A formulação VP1+A1(OH)3 induziu polarização da resposta Th2, enquanto que a formulação VP1r+saponina gerou um balanço maior entre as respostas Th1 e Th2. O adjuvante saponina permitiu a administração de uma dose menor da VP1 sem afetar a intensidade da resposta. Resultados preliminares sugerem que os anticorpos anti-VP1 induzidos pela formulação com saponina apresentaram reatividade cruzada com o HAV. Além disso, testes iniciais indicam que os camundongos imunizados com a VP1 em associação com ambos os adjuvantes apresentaram resposta anamnéstica contra o HAV. Os resultados aqui apresentados sugerem que a VP1 e as VLPs podem ser úteis para o desenvolvimento de uma nova vacina contra a Hepatite A / The hepatitis A virus (HAV) is the primary etiological agent of acute viral hepatitis and it is estimated to cause 1.5 million of new infections each year worldwide. Despite the effectiveness of commercial vaccines, the replication of HAV in cell culture is slow and has low yield, which makes it difficult and expensive to manufacture. In this context, the use of recombinant HAV proteins could represent an alternative model to the existing vaccines. This study aimed to express and evaluate the immunogenicity of virus-like-particles (VLPs) and VP1 protein of HAV. The VLPs were generated using the baculovirus/insect cell expression system by the infection of insect cells with recombinant baculovirus containing HAV P1-2A and P3 regions. The P1-2A polyprotein was successfully expressed, cleaved and organized into structures that contained neutralizing conformational epitopes. HAV-like particles were identified by electron microscopy, suggesting that the expressed proteins were assembled into VLPs. In parallel, VP1 was expressed in both baculovirus/insect cell and Escherichia coli expression systems. Higher protein levels were obtained in E. coli, which consequently increased the recovery rate after protein purification. The E. coli-derived VP1 was then used in antigenicity assays and showed reactivity against sera from patients infected with HAV, demonstrating its potential as a diagnostic marker. For immunogenicity studies, the E. coliderived VP1 was combined with two adjuvants, aluminum hydroxide (Al(OH)3) and the saponin-based adjuvant. The VP1+Al(OH)3 induced Th2 polarization, while VP1+saponin generated a Th1 and Th2 balanced immune response. Saponin-based adjuvant formulations allowed the administration of lower dose of VP1 without affecting the intensity of the response. Preliminary results suggest that the anti-VP1 antibodies induced by saponin-based adjuvant showed cross-reactivity with HAV. Furthermore, initial tests indicate that immunization of mice with VP1 in association with both adjuvants generated anamnestic response against HAV. The results presented here suggest that VP1 and VLPs might be useful to develop a new vaccine against hepatitis A. / 2016-07-10

O Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus é usado como agente de controle biológico da lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis), e representa o bioinseticida viral mais amplamente utilizado no mundo. Sabendo-se que as populações selvagens de baculovírus são geneticamente heterogêneas, este trabalho avaliou a diversidade genômica de 17 isolados selvagens de AgMNPV, coletados no Brasil, Argentina e Uruguai, entre 1980 e 1990. Os genótipos reconstruídos evidenciam a conservação da colinearidade genômica durante a evolução de AgMNPV, porém, deleções e inserções de uma ou mais bases foram comuns. Um novo gene com possível origem em lepidóptero foi identificado em dois genótipos; e o gene bro-a está ausente em muitos isolados. Análises de diversidade genética apontaram que a maioria dos genes de AgMNPV é pouco variável, e os genes mais diversos estão em loci variáveis específicos. Os resultados obtidos reforçam a percepção de que grandes vírus de DNA evoluem principalmente sob baixas taxas de substituição, e por meio de duplicações, ganhos e perdas gênicas. / The Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus is employed as a biological control agent against velvetbean caterpillar (Anticarsia gemmatalis), and represents the most widely used viral bioinseticide in the world. Since baculovirus wild populations are genetically heterogeneous, this work evaluated the genomic diversity of 17 AgMNPV geographic isolates obtained from 1980 to 1990, in the Brazil, Argentina and Uruguay. The genotypes reconstructed evidenced the highly genomic colinearity conservation during AgMNPV evolutionary history, however, deletions and insertions of one or more bases were common. A new gene with possible lepidopteran origin was identified in two genotypes; and the gene bro-a is absence in many isolates. Genetic diversity analyses pointed that most AgMNPV genes shows little variation, and the highly diverse genes are in specific variable loci. The obtained results reinforce the perception that large DNA virus evolve mainly under low rates of substitution, and through gene duplications, gain and loss.

Animais hematófagos possuem em sua saliva substâncias que permitem a fluidez do sangue, para o sucesso de sua alimentação. Com isso, têm sido descritos diversos componentes com atividades nos diferentes processos hemostáticos (coagulação, fibrinólise e agregação plaquetária). O complexo salivar da sanguessuga Haementeria depressa vem sendo estudado através de bioquímica clássica e análises transcriptômica e proteômica deste tecido determinaram o perfil dos transcritos e das proteínas produzidas. Dentre os transcritos mais abundantes foram encontrados três clones (H06A09, H06A02 e L02F02) que apresentaram 45%, 87% e 94% de similaridade ao LAPP, um inibidor de agregação plaquetária da sanguessuga Haementeria officinallis, a produção destes componentes pelo tecido foi confirmada pela análise proteômica. O LAPP é um inibidor que age pela via do colágeno e possui cerca de 14 kDa e pI de 4,0 e inibe a ligação da plaqueta ao colágeno tanto pelo epítopo do FvW quanto pelo domínio <font face=\"Symbol\">a2<font face=\"Symbol\">b1. Assim, o objetivo do presente trabalho foi clonar, expressar e caracterizar a proteína recombinante ativa, a partir do clone H06A09 para estudos de atividade desta molécula. Para obter a proteína recombinante de interesse inicialmente a clonagem do transcrito foi realizada com sucesso em vetor pAE, porém, a expressão em sistema procarioto apresentou alguns obstáculos já que a molécula não tinha atividade. Uma nova estratégia foi proposta, sendo realizada clonagem em vetor pPIC9K e expressão em sistema eucariótico (leveduras Pichia pastoris - GS115). Após a utilização de diferentes metodologias para estabelecimento das melhores condições para expressão neste sistema, foi eleito o protocolo onde a proteína recombinante era expressa a 28 °C, sob agitação de 260 rpm, e indução por 0,5% de Metanol a cada 24h, durante 72h de expressão. A molécula recombinante expressa e secretada foi submetida a diferentes metodologias para purificação, assim, determinou-se que a estratégia utilizada que melhor isolou a proteína foi a submissão do sobrenadante da expressão à diálise e concentração em sistema de ultrafiltração (Amicon 5 kDa Millipore) seguida de uma cromatografia de gel filtração em Superdex 75 (GE), sistema FPLC, com coleta fracionada. Ensaios de agregação plaquetária confirmaram a atividade inibitória da proteína recombinante tanto em sangue total como em PRP (plasma rico em plaqueta) e plaqueta lavada, especificamente quando o agonista era o colágeno, apresentando IC50 para PRP e plaqueta lavada de 20 e 712 ng, respectivamente. Ensaios por citometria de fluxo indicaram que a proteína recombinante, diferente do LAPP, age na inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno, pela ligação à subunidade Ib<font face=\"Symbol\">a do complexo GPIb-IX-V, complexo este que usa o FvW como ponte entre a plaqueta e o colágeno, firmando assim a interação da plaqueta ao subendotélio e posterior agregação. Desta forma, o presente trabalho caracteriza o primeiro inibidor recombinante de agregação plaquetária pela via do colágeno proveniente de sanguessugas Haementeria depressa, e comprova que apesar de apresentar 45% de similaridade estrutural ao LAPP é um inibidor com características funcionais diferentes, e com grande potencial a ser estudado. / Hematophagous animals have in their saliva substances that maintain the blood fluidity to the success of their feeding. Therefore, components have been described by their activities in the hemostatic processes (coagulation, fibrinolysis and platelet aggregation).The salivary complex of Haementaria depressa leech has been studied by classical biochemical and transcriptomic and proteomic analysis of this tissue determined the profile of transcripts and proteins produced by it. Among the most abundant transcripts were found three clones (H06A09, H06A02 e L02F02) that showed 45%, 87% e 94% of similarity to LAPP, an inhibitor of platelet aggregation from Haementeria officinallis, the components production was confirmed by proteomic analysis. LAPP is a inhibitor that acts by collagen pathway and has around 14 kDa and pI of 4.0, and inhibits the binding of platelet to collagen by both the epitope domain of vWF as the <font face=\"Symbol\">a2<font face=\"Symbol\">b1. Thereby, the aim of this study was to clone, express and characterize the active recombinant protein from the clone H06A09 for studies of activity of this molecule. To obtain the recombinant protein initially cloning of transcript was successfully performed in pAE vector, however, the protein expressed in prokaryotic system presented some obstacles not presenting activity. A new strategy was proposed, being held in pPIC9K vector and expression in eukaryotic system - yeast Pichia pastoris (GS115). After using different methodologies to establish the best conditions for expression in this system, was elected the protocol where the recombinant protein was expressed in 28 °C, under agitation of 260 rpm, and 0.5% methanol induction every 24 hours during 72 hours of expression. The recombinant molecule was expressed in soluble portion and was subjected to differents methods for purification, so it was determined that the best strategy to isolation of the protein was the concentration and dialysis of the expression supernatant by ultrafiltration system (Amicon 5 kDa Millipore) followed by gel filtration chromatography on Superdex 75 (GE), FPLC system. Tests confirmed the platelet aggregation inhibitory activity of the recombinant protein in whole blood, PRP (platelet rich plasma) and in washed platelets, specifically when the agonist was collagen, with IC50 to PRP and washed platelet of 20 and 712 ng, respectively. Assays by flow cytometry indicated that the recombinant protein, different from LAPP, acts to inhibit platelet aggregation induced by collagen, by the binding to the Ib<font face=\"Symbol\">a subunit of the GPIb-IX-V complex, this complex uses the vWF as a bridge between the platelet and collagen, thus firming the interaction of the subendothelium and subsequent platelet aggregation. Thus, this study characterized the first recombinant inhibitor of platelet aggregation through collagen pathway from Haementeria depressa leeches, and proves that despite having 45% structural similarity to the LAPP is an inhibitor with different functional characteristics, and with great potential to be studied.

A traça-da-batata, Phthorimaea operculella (Zeller, 1873) (Lepidoptera: Gelechiidae), é praga-chave da batata (Solanum tuberosum L., Solanaceae), causando sérios prejuízos em países produtores do mundo inteiro, com danos que podem atingir 100% em tubérculos armazenados. O uso de inseticidas químicos para controle de P. operculella geralmente aumenta os custos de produção, gera resíduos tóxicos e causa intoxicações nos produtores. O controle biológico é uma alternativa desejável para ser incorporado no Manejo Integrado de Pragas (MIP). O granulovírus, PhopGV (Baculoviridae), é um importante inimigo natural de P. operculella, causando epizootias frequentes nas populações dessa praga. O presente trabalho investigou o potencial de um isolado nativo de PhopGV sobre a fase larval de P. operculella a diferentes temperaturas de incubação em tubérculo (18, 24 e 30 °C) e na parte aérea de batata. Estudos relacionados à persistência do vírus aplicado em tubérculos e aos efeitos subletais da infecção viral sobre o peso pupal e o sistema imune de lagartas desse inseto foram executados. A suscetibilidade de um hospedeiro alternativo ao vírus, a traça-do-tomateiro Tuta absoluta (Meyrick, 1917) (Lepid.: Gelechiidae), foi avaliada em folhas de tomateiro (Solanum lycopersium L., Solanaceae). Em outros bioensaios, avaliou-se o efeito combinado de dois produtos à base de nim (DalNeem® e NeemAZAl®) com PhopGV sobre a mortalidade larval e rendimento de lagartas infectadas de P. operculella. Uma formulação em pó seco do vírus com talco foi desenvolvida para conferir proteção aos tubérculos. As temperaturas de incubação não afetaram a suscetibilidade de lagartas de P. operculella ao vírus, nem o rendimento de lagartas infectadas e a proporção de lagartas não recuperadas nos bioensaios em tubérculos. Porém, esses parâmetros foram altamente dependentes da concentração viral e 100% de mortalidade larval foi obtida a partir de 1 x 106 OB.mL-1. Apesar de não ter ocorrido diferenças no rendimento de lagartas infectadas entre as temperaturas, o período de incubação até a coleta destas lagartas foi menor a 30 °C. Na parte aérea, lagartas de P. operculella foram menos suscetíveis ao patógeno do que em tubérculos, sugerindo aplicação de diferentes dosagens do vírus para lavoura de batata e tubérculo armazenado. O vírus demonstrou alta persistência durante o armazenamento, mantendo-se viável por até 60 dias com mortalidade > 80%. A transmissão do vírus da lagarta para pupa em baixas concentrações (< 1 x 106 OB.mL- 1) foi confirmada. As pupas infectadas não apresentaram pesos diferentes daquelas sadias. A infecção viral provocou drástica redução no número total de hemócitos circulantes na hemolinfa de lagartas doentes. A melhor combinação de vírus com nim foi obtida pela mistura de 4 ppm DalNeem + 1 x 104 OB.mL-1 PhopGV, que resultou em maior mortalidade larval do que os agentes aplicados sozinhos. NeemAzal teve efeito antagônico na mistura com PhopGV em razão da baixa mortalidade larval registrada. O vírus formulado com talco proporcionou altos níveis de mortalidade (> 70%) nas concentrações < 5 x 106 OB.mL-1 do que o vírus não formulado. PhopGV pode ser produzido in vivo em tubérculos de batata a 24-30 °C, e a sua combinação com talco ou DalNeem, ambos em baixas concentrações, foi muito eficiente contra P. operculella, devendo ser considerada em programas de manejo integrado. / The Potato Tuber Moth (PTM), Phthorimaea operculella (Zeller, 1873) (Lepidoptera: Gelechiidae), is a major pest of potato causing up to 100% damage worldwide, especially under storage conditions. The use of chemical pesticides to control PTM usually increases production costs, generates toxic residues and farmer intoxications. Biological control is a desired alternative to be incorporated in Integrated Pest Management (IPM) programs. The granulovirus, PhopGV (Baculoviridae) is one of the most important natural enemies of PTM, frequently causing epizootics in host populations. The current research focused on basic studies to evaluate the potential of PhopGV to control PTM at different incubation temperatures (18, 24 e 30 °C) on potato tuber and on foliage. Investigations about virus persistence were done for treated tubers, and side-effects due to viral infection were assessed on pupal weight and immune system of PTM larvae. The susceptibility of a related host, the tomato pinworm, Tuta absoluta (Meyrick, 1917) (Lepid.: Gelechiidae), to the virus was also investigated on tomato leaves (Solanum lycopersium L., Solanaceae). In order to improve larval mortality by the pathogen, the virus was tested at different concentrations in combination with two neem products (DalNeem® and NeemAZAl®), and PhopGV was also tested in talc dust formulation. All tested temperatures did not affect the susceptibility of PTM larvae to PhopGV, neither the yield of infected larvae nor the rate of larvae not recovered on tuber bioassays. These parameters were highly dependent on the virus concentration and concentrations > 1 x 106 OB.mL-1 resulted in 100% larval mortality. Although the yield of infected larvae did not vary among the temperatures, the incubation period until the harvest of these larvae was shorter at 30 °C. On potato foliage, PTM larvae were less susceptible to the virus than on tubers, indicating that different virus dosages must be used for applications in field and storage conditions. The pathogen showed high persistence resulting in more than 80% larval mortality 60 days post-treatment. The transmission of the virus from larva to pupa at lower virus inoculum (< 1 x 106 OB.mL-1) was confirmed. However, the infected pupae had similar weights to those healthy ones. Infected larvae presented much lower densities of haemocytes compared to uninfected larvae. The best combination of PhopGV and neem products was achieved by the mixture of 4 ppm DalNeem with 1 x 104 OB.mL-1 PhopGV, which resulted in higher PTM mortalities than both agents applied alone. NeemAzal had antagonistic effect when mixed with PhopGV resulting on reduced larval mortality. The talc dust formulation of virus promoted higher mortalities (> 70%) at concentrations < 5 x 106 OB.mL-1 than to nonformulated virus. PhopGV can be produced in vivo on potato tubers at 24-30 °C, and the use of this virus in combination with talc or DalNeem, both at lower concentrations, was very efficient against PTM and must be considered in integrated management programs.

A traça-da-batata, Phthorimaea operculella (Zeller, 1873) (Lepidoptera: Gelechiidae), é praga-chave da batata (Solanum tuberosum L., Solanaceae), causando sérios prejuízos em países produtores do mundo inteiro, com danos que podem atingir 100% em tubérculos armazenados. O uso de inseticidas químicos para controle de P. operculella geralmente aumenta os custos de produção, gera resíduos tóxicos e causa intoxicações nos produtores. O controle biológico é uma alternativa desejável para ser incorporado no Manejo Integrado de Pragas (MIP). O granulovírus, PhopGV (Baculoviridae), é um importante inimigo natural de P. operculella, causando epizootias frequentes nas populações dessa praga. O presente trabalho investigou o potencial de um isolado nativo de PhopGV sobre a fase larval de P. operculella a diferentes temperaturas de incubação em tubérculo (18, 24 e 30 °C) e na parte aérea de batata. Estudos relacionados à persistência do vírus aplicado em tubérculos e aos efeitos subletais da infecção viral sobre o peso pupal e o sistema imune de lagartas desse inseto foram executados. A suscetibilidade de um hospedeiro alternativo ao vírus, a traça-do-tomateiro Tuta absoluta (Meyrick, 1917) (Lepid.: Gelechiidae), foi avaliada em folhas de tomateiro (Solanum lycopersium L., Solanaceae). Em outros bioensaios, avaliou-se o efeito combinado de dois produtos à base de nim (DalNeem® e NeemAZAl®) com PhopGV sobre a mortalidade larval e rendimento de lagartas infectadas de P. operculella. Uma formulação em pó seco do vírus com talco foi desenvolvida para conferir proteção aos tubérculos. As temperaturas de incubação não afetaram a suscetibilidade de lagartas de P. operculella ao vírus, nem o rendimento de lagartas infectadas e a proporção de lagartas não recuperadas nos bioensaios em tubérculos. Porém, esses parâmetros foram altamente dependentes da concentração viral e 100% de mortalidade larval foi obtida a partir de 1 x 106 OB.mL-1. Apesar de não ter ocorrido diferenças no rendimento de lagartas infectadas entre as temperaturas, o período de incubação até a coleta destas lagartas foi menor a 30 °C. Na parte aérea, lagartas de P. operculella foram menos suscetíveis ao patógeno do que em tubérculos, sugerindo aplicação de diferentes dosagens do vírus para lavoura de batata e tubérculo armazenado. O vírus demonstrou alta persistência durante o armazenamento, mantendo-se viável por até 60 dias com mortalidade > 80%. A transmissão do vírus da lagarta para pupa em baixas concentrações (< 1 x 106 OB.mL- 1) foi confirmada. As pupas infectadas não apresentaram pesos diferentes daquelas sadias. A infecção viral provocou drástica redução no número total de hemócitos circulantes na hemolinfa de lagartas doentes. A melhor combinação de vírus com nim foi obtida pela mistura de 4 ppm DalNeem + 1 x 104 OB.mL-1 PhopGV, que resultou em maior mortalidade larval do que os agentes aplicados sozinhos. NeemAzal teve efeito antagônico na mistura com PhopGV em razão da baixa mortalidade larval registrada. O vírus formulado com talco proporcionou altos níveis de mortalidade (> 70%) nas concentrações < 5 x 106 OB.mL-1 do que o vírus não formulado. PhopGV pode ser produzido in vivo em tubérculos de batata a 24-30 °C, e a sua combinação com talco ou DalNeem, ambos em baixas concentrações, foi muito eficiente contra P. operculella, devendo ser considerada em programas de manejo integrado. / The Potato Tuber Moth (PTM), Phthorimaea operculella (Zeller, 1873) (Lepidoptera: Gelechiidae), is a major pest of potato causing up to 100% damage worldwide, especially under storage conditions. The use of chemical pesticides to control PTM usually increases production costs, generates toxic residues and farmer intoxications. Biological control is a desired alternative to be incorporated in Integrated Pest Management (IPM) programs. The granulovirus, PhopGV (Baculoviridae) is one of the most important natural enemies of PTM, frequently causing epizootics in host populations. The current research focused on basic studies to evaluate the potential of PhopGV to control PTM at different incubation temperatures (18, 24 e 30 °C) on potato tuber and on foliage. Investigations about virus persistence were done for treated tubers, and side-effects due to viral infection were assessed on pupal weight and immune system of PTM larvae. The susceptibility of a related host, the tomato pinworm, Tuta absoluta (Meyrick, 1917) (Lepid.: Gelechiidae), to the virus was also investigated on tomato leaves (Solanum lycopersium L., Solanaceae). In order to improve larval mortality by the pathogen, the virus was tested at different concentrations in combination with two neem products (DalNeem® and NeemAZAl®), and PhopGV was also tested in talc dust formulation. All tested temperatures did not affect the susceptibility of PTM larvae to PhopGV, neither the yield of infected larvae nor the rate of larvae not recovered on tuber bioassays. These parameters were highly dependent on the virus concentration and concentrations > 1 x 106 OB.mL-1 resulted in 100% larval mortality. Although the yield of infected larvae did not vary among the temperatures, the incubation period until the harvest of these larvae was shorter at 30 °C. On potato foliage, PTM larvae were less susceptible to the virus than on tubers, indicating that different virus dosages must be used for applications in field and storage conditions. The pathogen showed high persistence resulting in more than 80% larval mortality 60 days post-treatment. The transmission of the virus from larva to pupa at lower virus inoculum (< 1 x 106 OB.mL-1) was confirmed. However, the infected pupae had similar weights to those healthy ones. Infected larvae presented much lower densities of haemocytes compared to uninfected larvae. The best combination of PhopGV and neem products was achieved by the mixture of 4 ppm DalNeem with 1 x 104 OB.mL-1 PhopGV, which resulted in higher PTM mortalities than both agents applied alone. NeemAzal had antagonistic effect when mixed with PhopGV resulting on reduced larval mortality. The talc dust formulation of virus promoted higher mortalities (> 70%) at concentrations < 5 x 106 OB.mL-1 than to nonformulated virus. PhopGV can be produced in vivo on potato tubers at 24-30 °C, and the use of this virus in combination with talc or DalNeem, both at lower concentrations, was very efficient against PTM and must be considered in integrated management programs.

O Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus é usado como agente de controle biológico da lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis), e representa o bioinseticida viral mais amplamente utilizado no mundo. Sabendo-se que as populações selvagens de baculovírus são geneticamente heterogêneas, este trabalho avaliou a diversidade genômica de 17 isolados selvagens de AgMNPV, coletados no Brasil, Argentina e Uruguai, entre 1980 e 1990. Os genótipos reconstruídos evidenciam a conservação da colinearidade genômica durante a evolução de AgMNPV, porém, deleções e inserções de uma ou mais bases foram comuns. Um novo gene com possível origem em lepidóptero foi identificado em dois genótipos; e o gene bro-a está ausente em muitos isolados. Análises de diversidade genética apontaram que a maioria dos genes de AgMNPV é pouco variável, e os genes mais diversos estão em loci variáveis específicos. Os resultados obtidos reforçam a percepção de que grandes vírus de DNA evoluem principalmente sob baixas taxas de substituição, e por meio de duplicações, ganhos e perdas gênicas. / The Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus is employed as a biological control agent against velvetbean caterpillar (Anticarsia gemmatalis), and represents the most widely used viral bioinseticide in the world. Since baculovirus wild populations are genetically heterogeneous, this work evaluated the genomic diversity of 17 AgMNPV geographic isolates obtained from 1980 to 1990, in the Brazil, Argentina and Uruguay. The genotypes reconstructed evidenced the highly genomic colinearity conservation during AgMNPV evolutionary history, however, deletions and insertions of one or more bases were common. A new gene with possible lepidopteran origin was identified in two genotypes; and the gene bro-a is absence in many isolates. Genetic diversity analyses pointed that most AgMNPV genes shows little variation, and the highly diverse genes are in specific variable loci. The obtained results reinforce the perception that large DNA virus evolve mainly under low rates of substitution, and through gene duplications, gain and loss.

Animais hematófagos possuem em sua saliva substâncias que permitem a fluidez do sangue, para o sucesso de sua alimentação. Com isso, têm sido descritos diversos componentes com atividades nos diferentes processos hemostáticos (coagulação, fibrinólise e agregação plaquetária). O complexo salivar da sanguessuga Haementeria depressa vem sendo estudado através de bioquímica clássica e análises transcriptômica e proteômica deste tecido determinaram o perfil dos transcritos e das proteínas produzidas. Dentre os transcritos mais abundantes foram encontrados três clones (H06A09, H06A02 e L02F02) que apresentaram 45%, 87% e 94% de similaridade ao LAPP, um inibidor de agregação plaquetária da sanguessuga Haementeria officinallis, a produção destes componentes pelo tecido foi confirmada pela análise proteômica. O LAPP é um inibidor que age pela via do colágeno e possui cerca de 14 kDa e pI de 4,0 e inibe a ligação da plaqueta ao colágeno tanto pelo epítopo do FvW quanto pelo domínio <font face=\"Symbol\">a2<font face=\"Symbol\">b1. Assim, o objetivo do presente trabalho foi clonar, expressar e caracterizar a proteína recombinante ativa, a partir do clone H06A09 para estudos de atividade desta molécula. Para obter a proteína recombinante de interesse inicialmente a clonagem do transcrito foi realizada com sucesso em vetor pAE, porém, a expressão em sistema procarioto apresentou alguns obstáculos já que a molécula não tinha atividade. Uma nova estratégia foi proposta, sendo realizada clonagem em vetor pPIC9K e expressão em sistema eucariótico (leveduras Pichia pastoris - GS115). Após a utilização de diferentes metodologias para estabelecimento das melhores condições para expressão neste sistema, foi eleito o protocolo onde a proteína recombinante era expressa a 28 °C, sob agitação de 260 rpm, e indução por 0,5% de Metanol a cada 24h, durante 72h de expressão. A molécula recombinante expressa e secretada foi submetida a diferentes metodologias para purificação, assim, determinou-se que a estratégia utilizada que melhor isolou a proteína foi a submissão do sobrenadante da expressão à diálise e concentração em sistema de ultrafiltração (Amicon 5 kDa Millipore) seguida de uma cromatografia de gel filtração em Superdex 75 (GE), sistema FPLC, com coleta fracionada. Ensaios de agregação plaquetária confirmaram a atividade inibitória da proteína recombinante tanto em sangue total como em PRP (plasma rico em plaqueta) e plaqueta lavada, especificamente quando o agonista era o colágeno, apresentando IC50 para PRP e plaqueta lavada de 20 e 712 ng, respectivamente. Ensaios por citometria de fluxo indicaram que a proteína recombinante, diferente do LAPP, age na inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno, pela ligação à subunidade Ib<font face=\"Symbol\">a do complexo GPIb-IX-V, complexo este que usa o FvW como ponte entre a plaqueta e o colágeno, firmando assim a interação da plaqueta ao subendotélio e posterior agregação. Desta forma, o presente trabalho caracteriza o primeiro inibidor recombinante de agregação plaquetária pela via do colágeno proveniente de sanguessugas Haementeria depressa, e comprova que apesar de apresentar 45% de similaridade estrutural ao LAPP é um inibidor com características funcionais diferentes, e com grande potencial a ser estudado. / Hematophagous animals have in their saliva substances that maintain the blood fluidity to the success of their feeding. Therefore, components have been described by their activities in the hemostatic processes (coagulation, fibrinolysis and platelet aggregation).The salivary complex of Haementaria depressa leech has been studied by classical biochemical and transcriptomic and proteomic analysis of this tissue determined the profile of transcripts and proteins produced by it. Among the most abundant transcripts were found three clones (H06A09, H06A02 e L02F02) that showed 45%, 87% e 94% of similarity to LAPP, an inhibitor of platelet aggregation from Haementeria officinallis, the components production was confirmed by proteomic analysis. LAPP is a inhibitor that acts by collagen pathway and has around 14 kDa and pI of 4.0, and inhibits the binding of platelet to collagen by both the epitope domain of vWF as the <font face=\"Symbol\">a2<font face=\"Symbol\">b1. Thereby, the aim of this study was to clone, express and characterize the active recombinant protein from the clone H06A09 for studies of activity of this molecule. To obtain the recombinant protein initially cloning of transcript was successfully performed in pAE vector, however, the protein expressed in prokaryotic system presented some obstacles not presenting activity. A new strategy was proposed, being held in pPIC9K vector and expression in eukaryotic system - yeast Pichia pastoris (GS115). After using different methodologies to establish the best conditions for expression in this system, was elected the protocol where the recombinant protein was expressed in 28 °C, under agitation of 260 rpm, and 0.5% methanol induction every 24 hours during 72 hours of expression. The recombinant molecule was expressed in soluble portion and was subjected to differents methods for purification, so it was determined that the best strategy to isolation of the protein was the concentration and dialysis of the expression supernatant by ultrafiltration system (Amicon 5 kDa Millipore) followed by gel filtration chromatography on Superdex 75 (GE), FPLC system. Tests confirmed the platelet aggregation inhibitory activity of the recombinant protein in whole blood, PRP (platelet rich plasma) and in washed platelets, specifically when the agonist was collagen, with IC50 to PRP and washed platelet of 20 and 712 ng, respectively. Assays by flow cytometry indicated that the recombinant protein, different from LAPP, acts to inhibit platelet aggregation induced by collagen, by the binding to the Ib<font face=\"Symbol\">a subunit of the GPIb-IX-V complex, this complex uses the vWF as a bridge between the platelet and collagen, thus firming the interaction of the subendothelium and subsequent platelet aggregation. Thus, this study characterized the first recombinant inhibitor of platelet aggregation through collagen pathway from Haementeria depressa leeches, and proves that despite having 45% structural similarity to the LAPP is an inhibitor with different functional characteristics, and with great potential to be studied.

A broca da cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae) é naturalmente infectada por diversos patógenos, sendo os mais importantes Metarhizium anisopliae (Metsch.) (Ascomycota: Clavicipitaceae), Beauveria bassiana (Bals.) (Ascomycota: Cordycipitaceae) e vírus da granulose. Esses microrganismos podem co-infectar um mesmo indivíduo em condições de campo, mas os resultados das interações desses patógenos não são conhecidos. O presente trabalho objetivou determinar a virulência desses patógenos aplicados de forma isolada e em infecções mistas na fase larval de D. saccharalis em condições de laboratório sobre dieta artificial e em plantas de milho. A maioria das combinações resultou em efeito aditivo na mortalidade dos insetos (M. anisopliae + B. bassiana, M. anisopliae + DsGV e M. anisopliae + B. bassiana + DsGV), entretanto ficou evidenciado antagonismo entre B. bassiana e o granulovírus. Todos os cadáveres oriundos das aplicações associadas apresentaram sintomas de apenas um dos patógenos envolvidos na infecção. A produção de conídios de uma espécie de fungo nos cadáveres submetidos à co-infecção foi semelhante à produção de conídios da mesma espécie na infecção isolada. Na infecção mista, os dois fungos se desenvolveram na hemolinfa do hospedeiro, entretanto em um estágio tardio do processo infectivo ocorreu a exclusão de um dos patógenos. A infecção por B. bassiana diminuiu drasticamente a densidade de hemócitos circulantes na hemolinfa das lagartas, efeito não observado para M. anisopliae. Duas populações de laboratório de D. saccharalis, uma oriunda de Piracicaba-SP e outra de Araras-SP, foram testadas quanto à suscetibilidade aos fungos M. anisopliae e B. bassiana. A população de insetos de Piracicaba foi menos suscetível em 2009 do que a mesma população em 2008 e também em relação à população de Araras. Dessa forma, foi realizado um bioensaio comparando a suscetibilidade de insetos das duas populações e da progênie (F1) dos cruzamentos diretos entre elas, criadas nas mesmas condições bióticas e abióticas, para determinar se a suscetibilidade diferencial estaria relacionada a fatores genéticos. Não foram observadas diferenças significativas na suscetibilidade das duas populações e dos cruzamentos aos fungos. A suscetibilidade diferencial observada nos dois primeiros bioensaios provavelmente esteja relacionada às variações no sistema de criação, em componentes nutricionais e antimicrobianos da dieta e não a variações entre as populações dos hospedeiros. / The sugarcane borer, Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae) is naturally infected by various pathogens, the most important are Metarhizium anisopliae (Metsch) (Ascomycota: Clavicipitaceae), Beauveria bassiana (Bals.) (Ascomycota: Cordycipitaceae) and granulovirus. These microorganisms may coinfect the same host under field conditions, but the result of these pathogens interactions is not known. This study investigated the virulence of these pathogens applied separately and together on larvae of D. saccharalis in the laboratory on artificial diet and on corn plants. Most combinations resulted in additive effect on insect mortalities (M. anisopliae + B. bassiana, M. anisopliae + DsGV and M. anisopliae + B. bassiana + DsGV), however it became apparent antagonism between B. bassiana and the granulovírus. In all cadavers resulted from mixed applications, only one pathogen sporulated or externalized their symptoms in the host. Production of conidia of one fungal species on the cadavers subjected to co-infection was similar to the production of conidia of the same species in a single infection. In mixed infection, the two fungi have developed in the hemolymph of the host, and the exclusion of one pathogen occurred at a later stage of the infective process. Infection with B. bassiana has drastically reduced the density of circulating hemocytes in the hemolymph of the larvae, which was not observed for M. anisopliae. Two laboratory populations of D. saccharalis, one coming from Piracicaba-SP and other from Araras-SP, were tested for susceptibility to M. anisopliae and B. bassiana. The insect population from Piracicaba was less susceptible to application of fungi in 2009 compared to the same population in 2008 and compared to the Araras population. Therefore, a bioassay was performed comparing the susceptibility of the two populations and the progeny (F1) of direct crossings between them, using insects reared in the same conditions. This assay was performed to determine if the differential susceptibility would be related to genetic factors. No significant differences were observed in the susceptibility of insect populations and crossings to both fungi. The differential susceptibility observed in the first two assays was probably related to variations in the rearing system and nutritional and antimicrobial components in the diet and not due to variations among host populations.