El uso de enzimas adaptadas/activas a bajas temperaturas tiene un alto potencial biotecnológico, debido principalmente a que permiten la reducción de costos energéticos en los procesos biotecnológicos. Las proteasas son enzimas proteolíticas de gran utilidad en la industria biotecnológica. Sus aplicaciones industriales involucran principalmente a la industria alimenticia, de detergentes y de cuero. En este trabajo se aisló bacterias de origen marino antártico que producen enzimas proteolíticas extracelulares con alta actividad a bajas temperaturas. El DNA genómico de las mejores cepas se utilizó para realizar búsquedas de genes que codificaran para proteasas tipo subtilisinas, utilizando partidores híbridos consenso-degenerados de oligonucleótidos (CODEHOP). Esto permitió clonar y secuenciar fragmentos de DNA que codificaban para regiones internas de tres proteasas tipo subtilisinas diferentes. A partir de estos fragmentos se determinó la secuencia de los extremos 3’ y 5’ de los genes, mediante una técnica de “genome walking” desarrollada para este trabajo. Se encontraron tres marcos de lectura abiertos (ORF) de 2.253 pb (P4), 2.124 pb (P6) y 1608 pb (P7), que codificaban para proteasas tipo subtilisina. Estos genes se expresaron con el sistema pET22b(+)/E. coli BL21(D3E), mediante inducción con IPTG. Las proteasas se produjeron fusionadas a una cola de histidina en el extremo C-terminal, permitiendo su purificación por cromatografía de afinidad a níquel. La proteasa P6 presentó mayor actividad catalítica que la subtilisina comercial Carlsberg a bajas temperaturas (5-25°C). Por otro lado, el sobrenandante del cultivo de la cepa antártica p13/1-4, correspondiente a la mejor productora de proteasa, se utilizó para purificar la enzima proteolítica mediante cromatografía. La proteasa se llamó T8, y se clonó un fragmento del gen de esta proteasa, mediante una estrategia que incluía un análisis de espectrometría de masa y diseño de partidores degenerados. La secuencia completa del gen se obtuvo mediante la técnica mejorada de “genome walking”, desarrollada en este trabajo. Actualmente, esta proteína tipo-subtilisina se encuentra en etapa de expresión recombinante. Adicionalmente a este trabajo, se aisló el gen de una xilanasa adaptada a bajas temperaturas utilizando partidores CODEHOP y la técnica de genome walking. Este gen se expresó en el sistema pET22b(+)/E. coli BL21(DE3), produciendo la xilanasa L activa en el sobrenandante. Esta xilanasa recombinante se utilizó para desarrollar métodos de evolución dirigida tales como PCR propenso a error (error-prone PCR) y recombinación al azar (DNA shuffling). Esto permitió la obtención de una nueva variante de xilanasa con una constante catalítica (kcat) tres veces mayor que la xilanasa L original. Durante este trabajo de tesis se desarrolló diferentes estrategias que permitieron la clonación, producción recombinante y evolución dirigida de diferentes enzimas hidrolíticas adaptadas a bajas temperaturas.

El trigo candeal (Triticum turgidum spp. durum) es un cereal importante en la alimentación humana y constituye la materia prima para la elaboración de pastas y otras comidas tradicionales. En Argentina el cultivo ocupa el sur de la provincia de Buenos Aires de clima sub-húmedo/semiárido, inviernos marcados y temperaturas mínimas variables en fecha e intensidad. Las heladas de julio a noviembre afectan el cultivo en estadío vegetativo y reproductivo. El germoplasma cultivado de candeal en nuestro país esta reducido a unas pocas variedades de hábito primaveral, con escaza descripción de los determinantes de la fecha de floración y del comportamiento frente a bajas temperaturas. La complejidad del carácter ha limitado la efectividad del mejoramiento tradicional. El análisis de secuencias de ADN y de expresión génica abre nuevas perspectivas. Se identificaron genes en trigo pan que intervienen en la determinación de la longitud del ciclo y en los procesos de aclimatación y adquisición de tolerancia a heladas. El objetivo de este estudio fue determinar la variabilidad en la tolerancia a bajas temperaturas en una colección de trigo candeal en etapa vegetativa y reproductiva y caracterizar genes candidatos. Se evaluaron 72 accesiones a campo en tres ambientes (Cabildo 2008, Cabildo 2009, Barrow 2009) donde se registró días a espigazón y se cuantificó el porcentaje de daño en hoja y en espigas (blanca, deformada y afectada por zonas). Se observó correlación entre ambientes para la variable días a espigazón. El daño en espiga varió entre máximos de 45% en Barrow y 12% en Cabildo hasta un mínimo de <1% en ambos, siendo la espiga afectada por zonas la forma de daño más frecuente. Un set de 32 genotipos se seleccionó para evaluar floración, tolerancia a helada en condiciones controladas y para análisis molecular. Se observaron diferencias en la respuesta a vernalización y fotoperíodo y variación en los genes involucrados. De los 32 genotipos, 28 mostraron el alelo primaveral VRN-A1 y los restantes el alelo invernal vrn-A1. Sólo una accesión presentó requerimiento estricto de vernalización. Se reconocieron hábitos de crecimiento primaveral, invernal y facultativo. El estudio de expresión de VRN-A1 mostró inducción por vernalización en todos los materiales y estadíos. En condiciones no vernalizantes, los materiales facultativos mostraron una expresión más tardía de VRN-A1, mientras que en el genotipo invernal no se detectó expresión. En cuanto al fotoperíodo, ocho genotipos presentaron el alelo de insensibilidad en el locus Ppd-A1 y 24 el alelo de sensibilidad. En todos los genotipos excepto en dos, la evaluación fenotípica coincidió con la caracterización molecular del promotor de Ppd-A1. Las evaluaciones de tolerancia a heladas en cámara basadas en el porcentaje de daño en hoja, discriminaron genotipos tolerantes y susceptibles destacándose dos líneas que corresponden al un material invernal y a uno primaveral. En cuanto a los genes de respuesta a frío, se obtuvieron secuencias de TdDREB-A1 y TdCBF14. En el primer caso se identificaron polimorfismos cuya combinación originó seis haplotipos, uno de los cuales resultó específico del material invernal tolerante. En TdCBF14 se encontró un polimorfismo asociado a tolerancia a frío en cebada. El análisis de expresión de genes COR en ocho genotipos mostró diferencias entre materiales y tratamientos, aunque la relación entre los polimorfismos moleculares y la tolerancia requieren de experimentos adicionales. La integración de la información obtenida representa un aporte a la caracterización de los recursos genéticos de trigo candeal, de utilidad al momento de elegir los materiales con ciclos más apropiados para cada sitio de cultivo. / Durum wheat (Triticum turgidum spp. durum) is an important cereal for human consumption and constitutes the raw material for pasta manufacturing and others traditional foods. Cultivation in Argentina comprises the South of Buenos Aires province where the climate is sub-humid/semi-arid, hard winters and variable minimum temperatures in date and intensity. Frost days from July to December can affect the crop both during vegetative and reproductive stage. Cultivated germplasm in our country is reduced to a few varieties with spring habit, with scarce description about determinants of flowering date and performance under low temperatures. The complex inheritance of this trait has limited the effectiveness of traditional breeding programs. The analysis of DNA sequences and gene expression opens new perspectives. Genes involved in cycle length, cold acclimation and the acquisition of frost tolerance has been identified in bread wheat. The objective of this study was to determine the variability in the tolerance to low temperatures in a durum wheat collection at vegetative and reproductive stage and to characterize candidate genes. Seventy-two accessions were field evaluated in three environments (Cabildo2008, Cabildo2009, Barrow2009) where ear emergence date was registered and percentage of damage in leaves and spikes were quantified (white spikes, deformed spikes and affected by zones). Days to ear emergence showed to be correlated across environments. Ear damage varied between maximum values of 45% in Barrow and 12% in Cabildo up to a minimum of <1% in both environments, being the spike affected by zones the most frequent class of damage. A set of 32 genotypes was selected to evaluate flowering date and frost tolerance under controlled conditions and for molecular analysis. Differences at vernalization and photoperiod response together with allelic variability at the involved genes were observed. Within the 32 accessions, 28 showed the VRN-A1 spring allele and the others the winter vrn-A1allele. Only one accession presented a strict vernalization requirement. Spring, winter and facultative growth habits were observed. The study of VRN-A1 gene expression showed vernalization induction in all the materials and stages. Under not-vernalized conditions, the facultative materials showed delayed expression of VRN-A1 whereas in the winter genotype expression was not detected at all. Regarding photoperiod response, eight genotypes presented the allele of insensitivity at the locus Ppd-A1 and 24 genotypes possessed the allele of sensitivity. In all the genotypes except in two, the phenotypic evaluation coincided with molecular characterization of the Ppd-A1 promoter. The evaluation of frost tolerance at growth chamber based on the percentage of leaf damage, discriminated between tolerant and susceptible genotypes where two lines, one winter and one spring were prominent. Concerning the genes involved in cold response, sequences of TdDREB-A1 and TdCBF14 were obtained. In the first case, polymorphisms were identified and their combination generated six haplotypes, one of them showed to be unique for winter tolerant material. A polymorphism detected in TdCBF14 has been previously associated with cold tolerance in barley. The analysis of expression of gene COR in eight genotypes showed differences across genotypes and treatments, although the relation between molecular polymorphisms and cold tolerance requires additional experiments. The integration of the obtained information represents a contribution to the durum wheat genetic resource characterization that hopefully facilitates the choosing of the best performance genotypes at each site.

Las bajas temperaturas (10-15ºC) son usadas durante la fermentación de vinos blancos y rosados para favorecer la producción y retención de aromas volátiles. Sin embargo, las bajas temperaturas pueden afectar a las levaduras tanto en su crecimiento como a su velocidad de fermentación, provocando problemas de fermentaciones lentas o paradas. En este trabajo se seleccionaron diez genes (CSF1, HSP12, HSP26, HSP104, LTE1, LOT2, NSR1, TCP1, TIP1 y TIR2) para su análisis transcriptómico, fisiológico y dosis génica. Todos ellos han sido descritos como esenciales a bajas temperaturas, pero únicamente dos de ellos (HSP104 y CSF1) presentaron una regulación específica por frío. La sobre-expresión de estos mismos genes, junto con TIP1 y TIR2, provocaba un adelanto en el inicio de la fermentación debido a fases de latencias más cortas, especialmente marcadas durante las fermentaciones a 13 ºC. La modificación génica de estos genes en levaduras industriales puede mejorar en un futuro su capacidad de crecimiento y de fermentación a baja temperatura. / Low temperatures (10-15ºC) are used in wine fermentations to enhance both production and better maintenance of volatile flavours. Thus, white and rosé wines with greater aromatic complexity should be produced at low temperatures. However, temperature affects both the yeast growth and the fermentation rate, therefore low temperatures produce longer and sluggish fermentations. In the present study, we have selected ten genes (CSF1, HSP12, HSP26, HSP104, LTE1, LOT2, NSR1, TCP1, TIP1 y TIR2) for a further transcriptomic, physiological and gene dosage analysis. All of them have been described as essential genes at low temperature, but we find that only two of them (HSP104 y CSF1) are regulated specifically by cold. Furthermore, the overexpression of these two genes and TIP1 and TIR2 decreased the early stage of fermentation, overall at 13ºC. We have determined the importance of those genes at low temperature fermentation.

This thesis presents a collection of four papers published in peer-reviewed scientific journals plus a manuscript yet to be submitted, all of them in the field of low temperature physics and quantum fluids. Each of these works reports a step forward in the ever-developing theoretical description of helium systems by means of density functional theory. The first two papers deal with questions related to the groundstate description of helium complexes around atomic impurities. We have computed such structure and determined its effect on the dipole absorption spectrum of Na in (3)He—(4)He clusters and of Mg in the homogeneous, isotopically mixed liquid. We have also explored the limits of density functional calculations for a small number of helium atoms interacting with a linear carbonyl sulfide (OCS) molecule. To this end we have implemented a Kohn-Sham scheme for 3He and computed the structure of OCS@3HeN clusters for N up to 40. The next three papers deal with the real-time description of dynamical processes in helium systems of experimental interest. We present an efficient and quantitatively accurate procedure to compute dynamical processes, namely the dynamics of an excited electron bubble and of an excited silver impurity, following a time-dependent density functional theory (TDDFT) for helium coupled to the appropiate dynamics of impurities. In the case of the electron bubble, we have related the experimental disappearance of 1P bubbles at high pressures with the existence of a nonradiative de-excitation path involving the bubble splitting about 20 picoseconds after the excitation. In the case of the desorption of a silver atom from a He drop, our dynamical calculations predict a range of velocities for the ejected impurity consistent with the experimental velocity distribution, which can be taken as indirect evidence of the superfluidity of helium nanodroplets. / En esta tesis se presenta una colección de cuatro artículos publicados y un manuscrito aún no publicado, todos ellos en el campo de la física de bajas temperaturas y fluidos cuánticos. Cada uno de ellos reporta un paso adelante en la descripción teórica de los sistemas de helio por medio de la teoría del funcional de la densidad. Los primeros dos artículos están clasificados como “estructura" ya que tratan cuestiones relacionadas con la descripción del estado fundamental de complejos de helio dopados con impurezas atómicas. En ellos hemos calculado la estructura y determinado su efecto sobre el espectro de absorción dipolar del Na en agregados de (3)He-(4)He y del Mg en el líquido homogéneo e isotópicamente mezclado. Para el caso de Na en gotas se ha encontrado que, a pesar de necesitar una gran cantidad de (3)He para que la capa exterior de la gota sature, el espectro de la impureza es muy insensible a la composición isotópica y rápidamente satura al valor que toma en las gotas de (3)He puras. Para Mg en el líquido mezclado, la presencia de (3)He induce cambios en el espectro mucho más pequeños que su anchura característica, por lo que se ha encontrado que el efecto general de la composición isotópica de la mezcla en la espectroscopia es mínima. Hemos explorado también los límites del funcional de la densidad para un número pequeño de átomos de helio interactuando con una molécula lineal de sulfuro de carbonilo (OCS). Para ello hemos implementado un esquema de Kohn-Sham para el (3)He y hemos obtenido la estructura de agregados OCS@(3)He(N) para un número de átomos “N” hasta 40. Hemos comparado los resultados de los agregados de (4)He con el mismo número de átomos y hemos encontrado que la alta anisotrop_á de la molécula de OCS magni_ca los efectos de las diferentes estadísticas de cada isótopo. Nuestra estimación de los momentos de inercia de estos agregados es consistente con la interpretación de los datos experimentales que sugieren una estructura de 11 átomos de helio rotando solidariamente con la molécula de OCS. Los siguientes tres trabajos, clasificados como “dinámica", describen la evolución temporal de ciertos procesos de interés experimental en los sistemas de helio. Mientras que las publicaciones sobre la estructura completan una línea de trabajo bien establecida, las de esta sección abren un nuevo frente de exploración teórica sobre los procesos dinámicos con resolución de picosegundos. En ellos se presenta un procedimiento eficiente para describirlos cuantitativamente mediante una teoría del funcional de la densidad dependiente del tiempo (TDDFT, por sus siglas en inglés) para el helio, acoplado a la dinámica adecuada para la impureza. Cuál es la dinámica “adecuada" depende de las propiedades de la impureza: para la burbuja electrónica 1P se puede utilizar una descripción puramente mecanocuántica del electrón en una aproximación adiabática, mientras que para la burbuja 2P la aproximación adiabática no es aplicable y se deben acoplar las evoluciones en tiempo real del helio y del electrón. Para una impureza masiva como la Ag una descripción clásica de su movimiento es suficiente, pero el efecto de spin-órbita es lo suficientemente importante como para que el estado electrónico del átomo deba tenerse en cuenta en la dinámica como un grado de libertad cuantizado . En el caso de las burbujas electrónicas, hemos relacionado la desaparición de las burbujas 1P a altas presiones con la existencia de un camino de relajación no-radiativo que causa la rotura de la burbuja en dos mitades casi esféricas tras haber transcurrido unos 20 picosegundos desde su excitación. Hemos sido capaces de establecer esta relación gracias a que nuestro cálculo predice la “fisión" de la burbuja solo para presiones superiores a 1 bar, que es el mismo umbral observado experimentalmente para la desaparición de las burbujas 1P. Teniendo en cuenta que aumentar la presión en 1 bar aumenta la densidad de saturación del líquido en poco más de un 1 %, la exactitud de este resultado indica que TDDFT contiene la física relevante para describir este tipo de procesos y tiene capacidad de predicción cuantitativa. También hemos encontrado un marcado cambio en el comportamiento del espectro de absorción con resolución temporal de la burbuja 1P dependiendo de si ésta fisiona o no, es decir, dependiendo de la presión del líquido. La observación experimental de este cambio y su determinación podrá completar la información obtenida en los experimentos de cavitación y fotoconductividad. En el caso de la desorción de un átomo de plata tras su fotoexcitación en el interior de una gota de He, nuestros cálculos dinámicos predicen un rango de velocidades para la impureza consistente con la distribución de velocidades experimental. Esta velocidad es el resultado de cuánta energía transfiere la impureza a la gota, lo cual depende de los modos de excitación disponibles para dicha transferencia. Nuestra descripción del líquido solo permite excitaciones colectivas tales como ondas de densidad u oscilaciones de superficie, por lo que la compatibilidad de nuestros resultados con los datos experimentales se puede tomar como una evidencia indirecta de la superfluidez de las nanogotas de helio. Adicionalmente hemos descartado la nucleación vórtices como un posible canal de transferencia de energía en gotas nanoscópicas al no haberlos generado en nuestros cálculos.