Health benefits of high molecular weight (MW) β-glucans are well documented. Therefore, understanding and controlling depolymerization of β-glucan in baked products, would increase the effectiveness of β-glucan to confer health benefits. In this study we demonstrated that endogenous β-glucanase in wheat kernels are responsible for the depolymerization of β-glucans. A protocol was developed based on the Megzayme procedure to detect low levels of β-glucanase activity in wheat flour. This was confirmed by using HPLC-Calcofluor detection to monitor molecular weight changes. The distribution of β-glucanase in wheat kernels was also investigated. The effect of genotype, location, planting season and environmental factors on the level of endogenous β-glucanase in selected wheat cultivars was investigated using different wheat varieties planted under different condition and different seasons. Furthermore, kinetics of β-glucan depolymerization by endogenous glucanase in two dough systems with different moisture content was investigated. The results demonstrated that enzymes with β-glucanase activity are concentrated primarily in the outer layer of wheat kernels. Also genotype, environmental conditions and agronomic practice all had significant effects on the β-glucanase activity in wheat flours and poor harvesting conditions can significantly increase β-glucanase activity level in wheat. The kinetics results demonstrated that moisture content, incubation time and levels of endogenous β-glucanase activity of the system had significant impact on the final MW of β-glucan in the dough. Among all factors investigated, moisture content had the greatest impact. This study presents opportunities for industry to fortify baked products with high molecular weight β-glucan. / Ontario Ministry of Agricultural Food and Rural Affairs

Essa pesquisa avaliou o efeito da suplementação de dois complexos enzimáticos sobre o desempenho, incremento de energia e digestibilidade da matéria seca (MS), proteína (PB), aminoácidos (AAs) e extrato etéreo (EE) por 3 metodologias (coleta total de fezes, coleta com indicador e coleta ileal) em rações de frangos. No ensaio de desempenho foram utilizados 2.592 pintos machos distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado com sete tratamentos (1: controle positivo; 2: controle negativo 1 (CN 1) decrescido de 2% de energia metabolizável aparente (EMA), AA e PB na fase de 1 a 21 dias e de 2,5% na fase de 22-42 dias; 3: controle negativo 2 (CN 2) decrescido de 4% de EMA, AA e PB na fase de 1 a 21 dias e de 5% na fase de 22-42 dias; 4: CN 1 mais 400 g do complexo A (α-amilase e β-glucanase); 5: CN 1 mais 500 g do complexo B (α-amilase, β-glucanase e xilanase); 6: CN 2 mais 400 g do complexo A; 7: CN 2 mais 500 g do complexo B), sendo o tratamento 1 com 6 repetições e os outros com 7, totalizando 48 parcelas experimentais com 54 aves cada. Foi adotado um programa alimentar com 2 fases: de 1 a 21 dias e de 22 a 42 dias. As características de desempenho avaliadas foram: consumo de ração, ganho de peso, conversão alimentar, conversão alimentar ajustada, viabilidade e índice de eficiência produtiva. No ensaio de metabolismo foram utilizados 351 pintos machos de um dia alojados em baterias seguindo delineamento inteiramente casualizado com os mesmos tratamentos do experimento 1, sendo os três primeiros com 5 repetições e os demais com 6, totalizando 39 parcelas experimentais com 9 aves por gaiola. O complexo enzimático B na dieta com menor redução proporcionou desempenho similar ao encontrado no controle positivo nas diferentes fases estudadas. Na primeira coleta do ensaio de metabolismo, realizada com aves de 21 dias, os complexos enzimáticos não foram eficazes em incrementar a energia da ração e a digestibilidade da matéria seca, do extrato etéreo, da proteína bruta e dos aminoácidos. Na coleta realizada com aves de 42 dias, o tratamento 5 proporcionou maiores valores de energia digestível e metabolizável, não diferindo dos tratamentos 1, 3 e 4 na metodologia de coleta total e dos tratamentos 3 e 4 nas metodologias de coleta com indicador e coleta ileal. O tratamento 5 ainda apresentou maior digestibilidade da MS pela metodologia de coleta com indicador. Os complexos enzimáticos melhoraram a digestibilidade do EE quando comparados aos seus respectivos tratamentos controle. Os tratamentos 4 e 5 apresentaram maior digestibilidade da PB pela metodologia de coleta ileal. Os maiores coeficientes de digestibilidade dos AAs concentraram-se no tratamento 5, seguido pelo tratamento 4. No geral, a metodologia de coleta total de excretas promoveu resultados mais consistentes. Conclui-se que a utilização de enzimas exógenas e viável técnica e economicamente. / This study evaluated the effect of supplementation of two enzymatic complexes on performance, energy increment and digestibility of dry matter (DM), crude protein (CP), amino acids (AA) and ether extract (EE) by three methodologies (total excreta collection, collection with marker and ileal collection) in broilers diets. In the performance assay a total of 2,592 male broiler chicks were randomly distributed in seven treatments (1: positive control; 2: negative control 1 (NC 1) with 2% reduction on apparent metabolizable energy (AME), AA and CP from 1 to 21 days and 2,5% from 22 to 42 days; 3: negatice control 2 (CN 2) with 4% reduction on AME, AA and CP from 1 to 21 days and 5% from 22 to 42 days; 4: NC 1 with 400 ppm of enzymatic complex A (α-amylase and β-glucanase); 5: NC 1 with 500 ppm of enzymatic complex B (α-amylase, β-glucanase and xylanase); 6: NC 2 with 400 ppm of enzymatic complex A; 7: NC 2 with 500 ppm of enzymatic complex B. Treatment one had six replicates and all the others treatments had seven replicates, in a total of 48 experimental units of 54 birds each. A feeding program with two phases was used from 1 to 21 days and from 22 to 42 days. Body weight gain, feed intake, feed conversion rate, adjusted feed conversion rate, viability and index of production efficiency were measured. In the metabolism assay a total of 351 male broiler chicks were housed in metallic batteries and randomly distributed in the same treatments of the performance assay. Treatments 1, 2 and 3 had 5 replicates and all the others treatments had 6 replicates, in a total of 39 experimental units of 9 birds by cage. The enzymatic complex B in the diet with lower reduction reached the same level of performance as the positive control diet. In the first collection of the metabolism assay (21 days), the enzymatic complexes were not efficient to increment the energy of the feed and digestibility of DM, EE, CP and AA. In the collection with 42 days, the treatment 5 provided the best result for digestible and metabolizable energies, but was not different of the treatments 1, 3 and 4 in total excreta collection methodology and of the treatments 3 and 4 in collection with marker and ileal collection methodologies. Treatment 5 even provided higher digestibility of DM by collection with marker methodology. The enzymatic complexes improved the ether extract digestibility when compared to their respective control treatments. The treatments 4 and 5 presented higher crude protein digestibility by ileal collection. The highest coefficients of digestibility of AA were observed in treatment 5, followed by treatment 4. In general, the total excreta collection methodology promoted higher consistency of the results. It was concluded that the exogenous enzymes utilization is technical and economically feasible.

β-1,3-glucanases são enzimas encontradas em muitos organismos, como fungos, bactéria e plantas. Suas funções incluem remodelamento de parede celular, defesa e digestão. É um alvo interessante para o controle populacional de insetos-praga, porque é ausente em vertebrados. Em insetos, é encontrada no intestino de muitas ordens diferentes, e hidrolizam β-1,3 ou β-1,3(4)-glucanas ingeridas, mas pouco se sabe sobre as propriedades e a função dessas enzimas. Nós estudamos três espécies de insetos, de três ordens diferentes. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera), Tenebrio molitor (Coleoptera) e Abracris flavolineata (Orthoptera) são insetos herbívoros e pestes de plantações, mas suas beta-1,3-glucanases diferem significativamente. A β- 1,3-glucanase de S. frugiperda (SLAM) foi purificada do intestino médio da larva. Ela apresenta uma massa molecular de 37,5 kDa, um pH ótimo alcalino de 9,0, é ativa contra β-1,3-glucana (laminarina), mas é incapaz de hidrolizar β-1,3-1,6-glucana de levedura ou outros polisacarídeos. SLAM é não-processiva (0,4), e não é inibida por altas concentrações de substrato. Diferente de outras β-1,3-glucanases digestivas de insetos, SLAM é incapaz de lisar células de Saccharomyces cerevisae. O cDNA correspondente à SLAM foi clonado e sequenciado, demonstrando que a proteína pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases. A modelagem tridimensional de SLAM, feito com base em homologia de sequência, sugere que o resíduo E228 possa afetar a ionização dos resíduos catalíticos, causando o deslocamento do pH ótimo da enzima. Anti-corpos específicos para SLAM foram produzidos, e estes reagem com uma única proteína oriunda do intestino médio da larva, responsável pela atividade β-1,3- glucanásica majoritária. A imunocitolocalização de SLAM demonstra que a enzima é encontrada em vesículas secretórias e no glicocálix das células colunares, e portanto não é originária de simbiontes. Nós clonamos e sequenciamos o cDNA correspondente à β-1,3-glucanase majoritária presente no intestino médio da larva de T. molitor (TLAM). Ela pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases e está relacionada com proteínas ligantes de β -glucanas, da mesma forma que a enzima de S. frugiperda. A modelagem tridimensional por homologia de sequência permitiu identificar alguns resíduos de amino-ácidos (E174, E179, H204, Y304, R127 e R2181) no sítio ativo da enzima, que podem ser importantes para a atividade de TLAM. A β-1,3-glucanase digestiva do gafanhoto Abracris flavolineata (Orthoptera) é diferente das enzimas já estudadas em insetos. Ela apresenta uma estratégia catalítica processiva, liberando glicose como maior parte dos produtos, e é inibida por altas concentrações de substrato. Para estudar as bases estruturais desse mecanismo, nós procuramos obter a sequência de cDNA correspondente à enzima já caracterizada. O alinhamento múltiplo das β-1,3- glucanases de insetos e proteínas ligantes de beta-glucanas indicou que uma duplicação gênica da enzima do ancestral comum de moluscos e artrópodes. Uma cópia originou as beta-1,3-glucanase de insetos, perdendo uma região N-Terminal com cerca de 100 pares de bases, enquanto a outra cópia originou as proteínas ligantes de beta-glucana, perdendo os resíduos catalíticos. / β-1,3-glucanases are widespread enzymes, found in all major groups of invertebrates, fungi, bacteria and plants. Since this enzyme is absent in vertebrates, it constitutes an interesting target for control of insect pests population. Its functions range from cell wall remodeling, defense and digestion. In insects, it is found in the gut of many different orders, hydrolyzing β-1,3 or β-1,3(4)-glucanas, but little is known about the properties and function of these enzymes. We studied three insect species each pertaining to a different order. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera), Tenebrio molitor (Coleoptera) and Abracris flavolineata are herbivores and crops pests, but their β-1,3- glucanases differ significantly. S. frugiperda β -1,3-glucanase (SLAM) was purified from the larval midgut. It has a molecular mass of 37.5 kDa, an alkaline optimum pH of 9.0, is active against β-1,3-glucan (laminarin), but cannot hydrolyze yeast β-1,3-1,6-glucan or other polysaccharides. The enzyme is an endoglucanase with low processivity (0.4), and is not inhibited by high concentrations of substrate. In contrast to other digestive β-1,3- glucanases from insects, SLAM is unable to lyse Saccharomyces cerevisae cells. The cDNA encoding SLAM was cloned and sequenced, showing that the protein belongs to glycosyl hydrolase family 16 as other insect glucanases and glucan-binding proteins. SLAM homology modeling suggests that E228 may affect the ionization of the catalytic residues, thus displacing the enzyme pH optimum. SLAM antiserum reacts with a single protein in the insect midgut. Immunocytolocalization reveals the presence of the enzyme in secretory vesicles and glycocalyx from columnar cells. We cloned and sequenced the cDNA of T. molitor β-1,3-glucanase. It belongs to glycoside hydrolase family 16, and is related to other insect glucanases and glucan-binding proteins. Sequence analysis and homology modeling allowed the identification of some residues (E174, E179, H204, Y304, R127 and R181) at the active site of the enzyme, which may be important for TLAM activity. The grasshopper A. flavolineata has a β-1,3-glucanase with a processive catalytic strategy. To study the structural basis of this property, we aimed to obtain its encoding sequence to better understand this catalytic mechanism. Multiple sequence alignment of insects β-1,3-glucanases and β-glucan-binding protein indicates that the β- 1,3-glucanase gene duplicated in the ancestor of mollusks and arthropods. One copy originated the insect β-1,3-glucanases after losing a 100 bp N-terminal portion and the arthropode β-glucan-binding proteins by the loss of the catalytic residues.

Essa pesquisa avaliou o efeito da suplementação de dois complexos enzimáticos sobre o desempenho, incremento de energia e digestibilidade da matéria seca (MS), proteína (PB), aminoácidos (AAs) e extrato etéreo (EE) por 3 metodologias (coleta total de fezes, coleta com indicador e coleta ileal) em rações de frangos. No ensaio de desempenho foram utilizados 2.592 pintos machos distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado com sete tratamentos (1: controle positivo; 2: controle negativo 1 (CN 1) decrescido de 2% de energia metabolizável aparente (EMA), AA e PB na fase de 1 a 21 dias e de 2,5% na fase de 22-42 dias; 3: controle negativo 2 (CN 2) decrescido de 4% de EMA, AA e PB na fase de 1 a 21 dias e de 5% na fase de 22-42 dias; 4: CN 1 mais 400 g do complexo A (α-amilase e β-glucanase); 5: CN 1 mais 500 g do complexo B (α-amilase, β-glucanase e xilanase); 6: CN 2 mais 400 g do complexo A; 7: CN 2 mais 500 g do complexo B), sendo o tratamento 1 com 6 repetições e os outros com 7, totalizando 48 parcelas experimentais com 54 aves cada. Foi adotado um programa alimentar com 2 fases: de 1 a 21 dias e de 22 a 42 dias. As características de desempenho avaliadas foram: consumo de ração, ganho de peso, conversão alimentar, conversão alimentar ajustada, viabilidade e índice de eficiência produtiva. No ensaio de metabolismo foram utilizados 351 pintos machos de um dia alojados em baterias seguindo delineamento inteiramente casualizado com os mesmos tratamentos do experimento 1, sendo os três primeiros com 5 repetições e os demais com 6, totalizando 39 parcelas experimentais com 9 aves por gaiola. O complexo enzimático B na dieta com menor redução proporcionou desempenho similar ao encontrado no controle positivo nas diferentes fases estudadas. Na primeira coleta do ensaio de metabolismo, realizada com aves de 21 dias, os complexos enzimáticos não foram eficazes em incrementar a energia da ração e a digestibilidade da matéria seca, do extrato etéreo, da proteína bruta e dos aminoácidos. Na coleta realizada com aves de 42 dias, o tratamento 5 proporcionou maiores valores de energia digestível e metabolizável, não diferindo dos tratamentos 1, 3 e 4 na metodologia de coleta total e dos tratamentos 3 e 4 nas metodologias de coleta com indicador e coleta ileal. O tratamento 5 ainda apresentou maior digestibilidade da MS pela metodologia de coleta com indicador. Os complexos enzimáticos melhoraram a digestibilidade do EE quando comparados aos seus respectivos tratamentos controle. Os tratamentos 4 e 5 apresentaram maior digestibilidade da PB pela metodologia de coleta ileal. Os maiores coeficientes de digestibilidade dos AAs concentraram-se no tratamento 5, seguido pelo tratamento 4. No geral, a metodologia de coleta total de excretas promoveu resultados mais consistentes. Conclui-se que a utilização de enzimas exógenas e viável técnica e economicamente. / This study evaluated the effect of supplementation of two enzymatic complexes on performance, energy increment and digestibility of dry matter (DM), crude protein (CP), amino acids (AA) and ether extract (EE) by three methodologies (total excreta collection, collection with marker and ileal collection) in broilers diets. In the performance assay a total of 2,592 male broiler chicks were randomly distributed in seven treatments (1: positive control; 2: negative control 1 (NC 1) with 2% reduction on apparent metabolizable energy (AME), AA and CP from 1 to 21 days and 2,5% from 22 to 42 days; 3: negatice control 2 (CN 2) with 4% reduction on AME, AA and CP from 1 to 21 days and 5% from 22 to 42 days; 4: NC 1 with 400 ppm of enzymatic complex A (α-amylase and β-glucanase); 5: NC 1 with 500 ppm of enzymatic complex B (α-amylase, β-glucanase and xylanase); 6: NC 2 with 400 ppm of enzymatic complex A; 7: NC 2 with 500 ppm of enzymatic complex B. Treatment one had six replicates and all the others treatments had seven replicates, in a total of 48 experimental units of 54 birds each. A feeding program with two phases was used from 1 to 21 days and from 22 to 42 days. Body weight gain, feed intake, feed conversion rate, adjusted feed conversion rate, viability and index of production efficiency were measured. In the metabolism assay a total of 351 male broiler chicks were housed in metallic batteries and randomly distributed in the same treatments of the performance assay. Treatments 1, 2 and 3 had 5 replicates and all the others treatments had 6 replicates, in a total of 39 experimental units of 9 birds by cage. The enzymatic complex B in the diet with lower reduction reached the same level of performance as the positive control diet. In the first collection of the metabolism assay (21 days), the enzymatic complexes were not efficient to increment the energy of the feed and digestibility of DM, EE, CP and AA. In the collection with 42 days, the treatment 5 provided the best result for digestible and metabolizable energies, but was not different of the treatments 1, 3 and 4 in total excreta collection methodology and of the treatments 3 and 4 in collection with marker and ileal collection methodologies. Treatment 5 even provided higher digestibility of DM by collection with marker methodology. The enzymatic complexes improved the ether extract digestibility when compared to their respective control treatments. The treatments 4 and 5 presented higher crude protein digestibility by ileal collection. The highest coefficients of digestibility of AA were observed in treatment 5, followed by treatment 4. In general, the total excreta collection methodology promoted higher consistency of the results. It was concluded that the exogenous enzymes utilization is technical and economically feasible.

β-1,3-glucanases são enzimas encontradas em muitos organismos, como fungos, bactéria e plantas. Suas funções incluem remodelamento de parede celular, defesa e digestão. É um alvo interessante para o controle populacional de insetos-praga, porque é ausente em vertebrados. Em insetos, é encontrada no intestino de muitas ordens diferentes, e hidrolizam β-1,3 ou β-1,3(4)-glucanas ingeridas, mas pouco se sabe sobre as propriedades e a função dessas enzimas. Nós estudamos três espécies de insetos, de três ordens diferentes. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera), Tenebrio molitor (Coleoptera) e Abracris flavolineata (Orthoptera) são insetos herbívoros e pestes de plantações, mas suas beta-1,3-glucanases diferem significativamente. A β- 1,3-glucanase de S. frugiperda (SLAM) foi purificada do intestino médio da larva. Ela apresenta uma massa molecular de 37,5 kDa, um pH ótimo alcalino de 9,0, é ativa contra β-1,3-glucana (laminarina), mas é incapaz de hidrolizar β-1,3-1,6-glucana de levedura ou outros polisacarídeos. SLAM é não-processiva (0,4), e não é inibida por altas concentrações de substrato. Diferente de outras β-1,3-glucanases digestivas de insetos, SLAM é incapaz de lisar células de Saccharomyces cerevisae. O cDNA correspondente à SLAM foi clonado e sequenciado, demonstrando que a proteína pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases. A modelagem tridimensional de SLAM, feito com base em homologia de sequência, sugere que o resíduo E228 possa afetar a ionização dos resíduos catalíticos, causando o deslocamento do pH ótimo da enzima. Anti-corpos específicos para SLAM foram produzidos, e estes reagem com uma única proteína oriunda do intestino médio da larva, responsável pela atividade β-1,3- glucanásica majoritária. A imunocitolocalização de SLAM demonstra que a enzima é encontrada em vesículas secretórias e no glicocálix das células colunares, e portanto não é originária de simbiontes. Nós clonamos e sequenciamos o cDNA correspondente à β-1,3-glucanase majoritária presente no intestino médio da larva de T. molitor (TLAM). Ela pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases e está relacionada com proteínas ligantes de β -glucanas, da mesma forma que a enzima de S. frugiperda. A modelagem tridimensional por homologia de sequência permitiu identificar alguns resíduos de amino-ácidos (E174, E179, H204, Y304, R127 e R2181) no sítio ativo da enzima, que podem ser importantes para a atividade de TLAM. A β-1,3-glucanase digestiva do gafanhoto Abracris flavolineata (Orthoptera) é diferente das enzimas já estudadas em insetos. Ela apresenta uma estratégia catalítica processiva, liberando glicose como maior parte dos produtos, e é inibida por altas concentrações de substrato. Para estudar as bases estruturais desse mecanismo, nós procuramos obter a sequência de cDNA correspondente à enzima já caracterizada. O alinhamento múltiplo das β-1,3- glucanases de insetos e proteínas ligantes de beta-glucanas indicou que uma duplicação gênica da enzima do ancestral comum de moluscos e artrópodes. Uma cópia originou as beta-1,3-glucanase de insetos, perdendo uma região N-Terminal com cerca de 100 pares de bases, enquanto a outra cópia originou as proteínas ligantes de beta-glucana, perdendo os resíduos catalíticos. / β-1,3-glucanases are widespread enzymes, found in all major groups of invertebrates, fungi, bacteria and plants. Since this enzyme is absent in vertebrates, it constitutes an interesting target for control of insect pests population. Its functions range from cell wall remodeling, defense and digestion. In insects, it is found in the gut of many different orders, hydrolyzing β-1,3 or β-1,3(4)-glucanas, but little is known about the properties and function of these enzymes. We studied three insect species each pertaining to a different order. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera), Tenebrio molitor (Coleoptera) and Abracris flavolineata are herbivores and crops pests, but their β-1,3- glucanases differ significantly. S. frugiperda β -1,3-glucanase (SLAM) was purified from the larval midgut. It has a molecular mass of 37.5 kDa, an alkaline optimum pH of 9.0, is active against β-1,3-glucan (laminarin), but cannot hydrolyze yeast β-1,3-1,6-glucan or other polysaccharides. The enzyme is an endoglucanase with low processivity (0.4), and is not inhibited by high concentrations of substrate. In contrast to other digestive β-1,3- glucanases from insects, SLAM is unable to lyse Saccharomyces cerevisae cells. The cDNA encoding SLAM was cloned and sequenced, showing that the protein belongs to glycosyl hydrolase family 16 as other insect glucanases and glucan-binding proteins. SLAM homology modeling suggests that E228 may affect the ionization of the catalytic residues, thus displacing the enzyme pH optimum. SLAM antiserum reacts with a single protein in the insect midgut. Immunocytolocalization reveals the presence of the enzyme in secretory vesicles and glycocalyx from columnar cells. We cloned and sequenced the cDNA of T. molitor β-1,3-glucanase. It belongs to glycoside hydrolase family 16, and is related to other insect glucanases and glucan-binding proteins. Sequence analysis and homology modeling allowed the identification of some residues (E174, E179, H204, Y304, R127 and R181) at the active site of the enzyme, which may be important for TLAM activity. The grasshopper A. flavolineata has a β-1,3-glucanase with a processive catalytic strategy. To study the structural basis of this property, we aimed to obtain its encoding sequence to better understand this catalytic mechanism. Multiple sequence alignment of insects β-1,3-glucanases and β-glucan-binding protein indicates that the β- 1,3-glucanase gene duplicated in the ancestor of mollusks and arthropods. One copy originated the insect β-1,3-glucanases after losing a 100 bp N-terminal portion and the arthropode β-glucan-binding proteins by the loss of the catalytic residues.

Bacillus sp VLSH08 screened from sea wetland in Nam Dinh province produces an extracellular endo-1,4-beta-glucanase. According to the results of the classified Kit API 50/CHB as well as sequence of 1500 bp fragment coding for 16S rRNA gene of the Bacillus sp VLSH 08 strain showed that the taxonomical characteristics between the strain VLSH 08 and Bacillus amyloliquefaciene JN999857 are similar of 98%. Culture supernatant of this strain showed optimal cellulase activity at pH 5.8 and 60 Celsius degree and that was enhanced 2.03 times in the presence of 5 mM Co2+. Moreover, the gene encoding endo-1,4-beta-glucanase from this strain was cloned in Escherichia coli using pCR2.1 vector. The entire gene for the enzyme contained a 1500-bp single open reading frame encoding 500 amino acids, including a 29-amino acid signal peptide. The amino acid sequence of this enzyme is very close to that of an EG of Bacillus subtilis (EU022560.1) and an EG of Bacillus amyloliquefaciene (EU022559.1) which all belong to the cellulase family E2. A cocktail of enzyme containing this endo-1,4-beta-glucanase used for biomass hydrolysis indicated that the cellulose conversion attained to 72.76% cellulose after 48 hours. / Chủng vi khuẩn Bacillus sp VLSH08 được tuyển chọn từ tập hợp chủng vi khuẩn phân lập ở vùng ngập mặn tỉnh Nam Định có khả năng sinh tổng hợp enzyme endo-1,4-beta-glucanase ngoại bào. Kết quả phân loại chủng vi khuẩn Bacillus sp VLSH08 bằng Kit hóa sinh API 50/CHB cũng như trình tự gen mã hóa 16S rRNA cho thấy độ tương đồng của chủng Bacillus sp VLSH08 và chủng Bacillus amyloliquefaciene JN999857 đạt 98%. Dịch lên men của chủng được sử dụng làm nguồn enzyme thô để nghiên cứu hoạt độ tối ưu của enzyme ở pH 5,8 và nhiệt đô 60oC. Hoạt tính enzyme tăng 2,03 lần khi có mặt 5 mM ion Co2+. Đồng thời, gen mã hóa cho enzyme endo-1,4-betaglucanase cũng được tách dòng trong tế bào Escherichia coli sử dụng vector pCR 2.1. Gen mã hóa cho enzyme này có chiều dài 1500 bp, mã hóa cho 500 axit amin, bao gồm 29 axit amin của chuỗi peptid tín hiệu. So sánh cho thấy trình tự gen endo-1,4-beta-glucanase của chủng Bacillus sp VLSH08 có độ tương đồng cao với enzyme này của chủng Bacillus subtilis (EU022560.1) và của chủng Bacillus amyloliquefaciene (EU022559.1). Tất cả các enzyme nhóm này đều thuộc họ cellulase E2. Enzyme của chủng này cũng đã được phối trộn với các enzyme khác tạo thành cocktail để thủy phân sinh khối cho kết quả cellulose bị thủy phân 72,76% sau 48 giờ.

Bacillus sp VLSH08 screened from sea wetland in Nam Dinh province produces an extracellular endo-1,4-beta-glucanase. According to the results of the classified Kit API 50/CHB as well as sequence of 1500 bp fragment coding for 16S rRNA gene of the Bacillus sp VLSH 08 strain showed that the taxonomical characteristics between the strain VLSH 08 and Bacillus amyloliquefaciene JN999857 are similar of 98%. Culture supernatant of this strain showed optimal cellulase activity at pH 5.8 and 60 Celsius degree and that was enhanced 2.03 times in the presence of 5 mM Co2+. Moreover, the gene encoding endo-1,4-beta-glucanase from this strain was cloned in Escherichia coli using pCR2.1 vector. The entire gene for the enzyme contained a 1500-bp single open reading frame encoding 500 amino acids, including a 29-amino acid signal peptide. The amino acid sequence of this enzyme is very close to that of an EG of Bacillus subtilis (EU022560.1) and an EG of Bacillus amyloliquefaciene (EU022559.1) which all belong to the cellulase family E2. A cocktail of enzyme containing this endo-1,4-beta-glucanase used for biomass hydrolysis indicated that the cellulose conversion attained to 72.76% cellulose after 48 hours. / Chủng vi khuẩn Bacillus sp VLSH08 được tuyển chọn từ tập hợp chủng vi khuẩn phân lập ở vùng ngập mặn tỉnh Nam Định có khả năng sinh tổng hợp enzyme endo-1,4-beta-glucanase ngoại bào. Kết quả phân loại chủng vi khuẩn Bacillus sp VLSH08 bằng Kit hóa sinh API 50/CHB cũng như trình tự gen mã hóa 16S rRNA cho thấy độ tương đồng của chủng Bacillus sp VLSH08 và chủng Bacillus amyloliquefaciene JN999857 đạt 98%. Dịch lên men của chủng được sử dụng làm nguồn enzyme thô để nghiên cứu hoạt độ tối ưu của enzyme ở pH 5,8 và nhiệt đô 60oC. Hoạt tính enzyme tăng 2,03 lần khi có mặt 5 mM ion Co2+. Đồng thời, gen mã hóa cho enzyme endo-1,4-betaglucanase cũng được tách dòng trong tế bào Escherichia coli sử dụng vector pCR 2.1. Gen mã hóa cho enzyme này có chiều dài 1500 bp, mã hóa cho 500 axit amin, bao gồm 29 axit amin của chuỗi peptid tín hiệu. So sánh cho thấy trình tự gen endo-1,4-beta-glucanase của chủng Bacillus sp VLSH08 có độ tương đồng cao với enzyme này của chủng Bacillus subtilis (EU022560.1) và của chủng Bacillus amyloliquefaciene (EU022559.1). Tất cả các enzyme nhóm này đều thuộc họ cellulase E2. Enzyme của chủng này cũng đã được phối trộn với các enzyme khác tạo thành cocktail để thủy phân sinh khối cho kết quả cellulose bị thủy phân 72,76% sau 48 giờ.

To understand and modify the secondary cell walls of plants the project group Enzyme Discovery in Hybrid Aspen for Fiber Engineering (EDEN) was founded composed of nine laboratories with funding from the European Commission. The main target of EDEN´s research is to genetically engineer fiber structure in order to produce transgenic trees with modified properties for the pulp and paper industries. In this target framework, the Populus tremula x tremuloides xyloglucan endotransglycosylase (PttXET16A) was selected for in-depth study of its transglycosylase activity catalyzing cleavage and reconnection of xyloglucan molecules, which is proposed to be involved in secondary cell wall morphogenesis. The creation of a family 16 carbohydrate active enzyme -glucanase/XET hybrids were attempted in order to design a chimeric enzyme with one or more of the following altered properties: specificity, activity, and or stability. The two enzymes, Bacillus licheniformis 1,3-1,4--glucanase and Populus tremula x tremuloides xyloglucan endotransglycosylase, are members of the same enzymatic family and have highly homologous 3-dimensional structures. However, the enzymes exhibit different activities, one a hydrolase the other a transferase; different specificities, one accepts only linear glcosydic substrates while the other branched substrates; and different stabilities. Hybrid enzyme construction represented an investigational challenge in order to understand what physical characteristics of both enzymes attribute to the specific pattern of activity and specificity observed.Removal of the 1,3-1,4--glucanase major loop resulted in a folded protein which still maintained some β-glucan hydrolase activity. However, no xyloglucan endotransglycosylase-like activity or specificity was observed. Next, point mutations of the β-sheets forming the enzymatic binding site cleft were mutated to resemble PttXET16A residues. The final chimeric protein neither exhibited XET nor β-glucanase activities. Structural analysis by X-ray crystallography revealed a major unexpected structural rearrangement providing a clear insight for further enzyme engineering. / Amb la finalitat d'entendre i modificar la paret cel·lular secundària de les plantes, es va fundar el grup Enzyme Discovery in Hibrid Aspen for Fibern Engineering (EDEN) composat per nou laboratoris amb la finançament de la Comissió Europea. El principal objectiu de la recerca del grup EDEN és enginyar genèticament l'estructura de fibres per tal de produir arbres transgènics amb propietats modificades per les indústries de la polpa i el paper.En el marc d'aquest projecte, es va seleccionar el Populus tremula x tremuloides xiloglucà endotransglicosilasa (PttXET16A) per estudiar en profunditat la seva activitat transglicosilasa catalitzant el trencament i la reconnexió de molècules de xiloglucà, el qual sembla estar involucrat en la morfogènesi de la paret cel·lular secundària. D'aquesta manera, s'intentà crear una família 16 d'híbrids de l'enzim actiu amb carbohidrats -glucanasa/XET per tal de dissenyar un enzim quimèric amb una o més de les propietats següents alterades: especificitat, activitat i/o estabilitat.Els dos enzims, Bacillus licheniformis 1,3-1,4--glucanasa i Populus tremula x tremuloides xiloglucà endotransglicosilasa, són membres de la mateixa família enzimàtica i tenen una gran homologia en les seves estructures en 3-dimensions. Tot i així, aquests enzims presenten diferents activitats, un presenta activitat hidrolasa i l'altre, transferasa; diferents especificitats, un accepta només substrats glicosílics lineals mentre l'altre, substrats ramificats; i diferents estabilitats. La construcció d'un enzim híbrid representa un repte en la investigació amb la finalitat d'entendre quines característiques físiques dels dos enzims s'atribueixen al model específic de l'activitat i especificitat observada.L'extracció del llaç més gran de l'1,3-1,4--glucanasa va resultar en l'obtenció d'una proteïna plegada que encara manté certa activitat hidrolasa del -glucà. Tot i això, no s'observà activitat o especificitat similar a la xiloglucà endotransglicosilasa. A partir d'aquí, es realitzaren mutacions puntuals a diferents punts de les fulles  que formen l'escletxa del lloc d'unió de l'enzim per assemblar-se als residus del PttXET16A. La proteïna quimèrica final tampoc presentava activitat XET ni -glucanasa. L'anàlisi de l'estructura per cristal·lografia de raigs X revelà una major reorganització estructural de l'esperada proveint el nou enzim d'un clar espai intern que obra moltes més portes a l'enginyeria de l'enzim. / Con la finalidad de entender y modificar la pared celular secundaria de las plantas, se fundó el grupo Enzyme Discovery in Hibrid Aspen for Fibern Engineering (EDEN) compuesto por nueve laboratorios con la financiación de la Comisión Europea. El principal objetivo de la búsqueda del grupo EDEN es ingeniar genéticamente la estructura de fibras para producir árboles transgénicos con propiedades modificadas para las industrias de la pulpa y el papel. En el marco de este proyecto, se seleccionó el Populus tremula x tremuloides xiloglucán endotransglicosilasa (PttXET16A) para estudiar en profundidad su actividad transglicosilasa catalizando la rotura y la reconnexión de moléculas de xiloglucán, el cual parece estar involucrado en la morfogénesis de la pared celular secundaria. De esta forma, se intentó crear una familia 16 de híbridos de la enzima activa con carbohidratos -glucanasa/XET con la finalidad de diseñar una enzima quimérica con una o más de las propiedades siguientes alteradas: especificidad, actividad y/o estabilidad. Las dos enzimas, Bacillus licheniformis 1,3-1,4--glucanasa y Populus tremula x tremuloides xiloglucà endotransglicosilasa, son miembros de la misma familia enzimática y tienen una gran homología en sus estructuras en 3-dimensiones. Aún así, estas enzimas presentan diferentes actividades, una tiene actividad hidrolasa y la otra, transferasa; diferentes especificidades, una acepta sólo sustratos glicosílicos lineales mientras la otra, sustratos ramificados; y diferentes estabilidades. La construcción de una enzima híbrida representa un reto dentro de la investigación con la finalidad de entender qué características físicas de las dos enzimas se atribuyen al modelo específico de la actividad y especificidad observada. La extracción del lazo más grande de la 1,3-1,4--glucanasa resultó en la obtención de una proteína plegada que todavía mantiene cierta actividad hidrolasa del -glucán. Aún así, no se observó actividad o especificidad similar a la xiloglucán endotransglicosilasa. A partir de este punto, se realizaron mutaciones puntuales a diferentes puntos de las hojas  que forman la brecha del lugar de unión de la enzima por asemejarse a los residuos del PttXET16A. La proteína quimérica final tampoco presentaba actividad XET ni -glucanasa. El análisis de la estructura por cristalografía de rayos X reveló una mayor reorganización estructural de la esperada proveyendo la nueva enzima de un claro espacio interno que obre muchas más puertas a la ingeniería de la enzima.