Vitamin E ist der Überbegriff für 4 Tocopherole (α, β, γ und δ) sowie 4 Tocotrienole (α, β, γ und δ), die als gemeinsames Merkmal ein Chromanolringsystem sowie eine gesättigte (Tocopherole) bzw. ungesättigte (Tocotrienole) Seitenkette aufweisen. Neben ihrer antioxidativen Wirkung (Schutz von Membranen vor Lipidperoxidaton) konnten für einige Vitamin E - Formen auch eine Reihe von hochspezifischen, nicht-antioxidativen Wirkungen in vitro nachgewiesen werden. Meist bleibt jedoch unklar, ob ein solcher Effekt auch in vivo, also im Tiermodel oder direkt im Menschen, gefunden werden kann. In erster Linie müsste hierbei geklärt werden, ob die jeweilige Vitamin E - Form auch bioverfügbar, also in für eine Wirkung ausreichender Konzentration im Organismus vorhanden ist, oder aber vorher eliminiert und ausgeschieden wird. In dieser Doktorarbeit wurden deshalb wichtige Grundlagen zum Abbau der Tocopherole und Tocotrienole erarbeitet. • In HepG2-Zellen konnte der Abbau der Tocotrienole mit Hilfe flüssig- sowie gaschromatographischer Analysemethoden vollständig aufgeklärt werden. Wie sich hierbei ergab, verläuft der Abbau weitgehend in Analogie zum Abbau der Tocopherole über eine durch Cytochrom P450 katalysierte initiale ω-Hydroxylierung mit 5 nachfolgenden β-Oxidationsschritten. • In vitro konnten in HepG2 – Zellen die Abbauraten der verschiedenen Vitamin E - Formen bestimmt werden. Dies nahmen in folgender Reihenfolge zu: α-Tocopherol < γ-Tocopherol < α-Tocotrienol < γ-Tocotrienol. • Wie sich mit Hilfe eines mit Cytochrom P450 hochangereicherten Homogenats aus Rattenlebern ergab, stellt die initiale ω-Hydroxylierung einen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Abbaus dar: α-Tocopherol wurde weit langsamer hydroxyliert als alle anderen Vitamin E – Formen. • Der unterschiedliche Abbau von α-Tocopherol und γ-Tocotrienol konnte auch im Mäuseversuch in vivo bestätigt werden. Nach Fütterung von Mäusen mit α-Tocopherol wurden nur geringe Mengen von α-Tocopherolmetaboliten im Urin der Mäuse gefunden, während nach Applikation von γ-Tocotrienol hohe Konzentrationen der γ-Tocotrienolmetabolite nachgewiesen wurden. In Plasma und Leber wiederum wurden (dem Futtergehalt entsprechende) hohe α-Tocopherolkonzentrationen entdeckt, während γ-Tocotrienol selbst nach hoher Gabe nicht oder nur in Spuren nachweisbar war. In HepG2 – Zellen konnte gezeigt werden, dass γ-Tocotrienol eine cytotoxische Wirkung auf die Hepatocarcinoma-Zelllinie HepG2 entfalten kann, indem durch die Aktivierung der proteolytischen Caspase 3 die Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) ausgelöst wird. Abschliessend lässt sich festhalten, dass der Körper lediglich das natürliche α-Tocopherol vor dem Abbau bewahrt, die anderen Vitamin E – Formen jedoch als Fremdstoffe behandelt und rapide ausscheidet. Als doppelter Schutz vor Verlust des “wertvollen” α-Tocopherol dienen hierbei das α-Tocopherol Transfer Protein sowie die in dieser Arbeit gefundenen Unterschiede im ersten Schritt des Abbaus, der Cytochrom P450 - katalysierten ω-Hydroxylierung. Beides erklärt die bevorzugte Retention von α-Tocopherol im Organsimus und seine hohe Bioaktivität. Will man deshalb in vitro Ergebnisse anderer Vitamin E – Formen auf die in vivo Situation übertragen, muss man die geringe Bioverfügbarkeit dieser Substanzen berücksichtigen. / The vitamin E family is comprised of 4 different tocopherols (Toc: α, β, γ, δ) and 4 different tocotrienols (T3: α, β, χ, δ). All share a hydroxychromanol ring and a saturated (Toc) or unsaturated (T3) side chain. Apart from their role as anti-oxidants (protection of membranes from lipid peroxidation), recent attention has focused on novel molecular, non-antioxidative functions. Numerous specific effects of tocopherols and tocotrienols were uncovered by a large variety of in vitro studies, in vivo - based evidence, however, is scarce. Moreover, little information exists on the bioavailabilty of the different vitamin E - forms. To better understand the biological role of the different tocopherols and tocotrienols, this thesis therefore aimed to address the basic but important aspect of tocopherol and tocotrienol metabolism. • In HepG2 cells, the metabolic pathway of α- and γ-T3 could be elucidated by the identification of all intermediary degradation products by using high performance liquid- as well as gas-chromatography. Thus, tocotrienols are degraded in analogy to tocopherols with an initial ω-hydroxylation and 5 subsequent β-oxidation steps. • In vitro (HepG2 cells), tocotrienols were degraded to a larger extent than tocopherols, and γ-Toc to a larger extent than α-Toc. Differences reached two orders of magnitude with α-Toc < γ-Toc < α-T3 < γ-T3. • By using rat liver microsomes that were highly enriched with cytochrome P450 enzymes, the initial ω-hydroxylation was shown to be a rate limiting step in the degradation of vitamin E: α-Toc is hydrolysed to a much smaller extent than all other vitamin E forms. • The differences in vitamin E metabolism were confirmed in vivo using male mice. After supplementation with α-Toc, only little amounts of α-Toc metabolites were found in urine, while oral administration of γ-T3 led to the rapid excretion of large amounts of γ-T3 metabolites. Correspondingly, in plasma and liver α-Toc levels were high but γ-T3 could hardly be detected. • γ-T3 but no other vitamin E – form was shown to be highly cytotoxic for HepG2 cells. Immunohistochemistry stainings revealed that γ-T3 induced apoptosis by activation of the proteolytic caspase 3. To summarize, α-Toc is metabolized to a much smaller extent than all other vitamin E - forms. Both the α-tocopherol transfer protein as well as the here described differences in the ω-hydroxylation rates provide a double protection for the “valuable” α-Toc from degradation. Both phenomena explain the high retention of α-Toc in the organism and its higher bioactivity, compared to other Vitamin E forms. The differences in the metabolism of vitamin E might therefore lead to an inequivalence of biological activities found in vitro vs. in vivo.

Le glioblastome représente le grade le plus élevé des tumeurs cérébrales. Sa croissance est favorisée par une forte néovascularisation de même que par l'activation de la voie du récepteur à l'EGFR-Ras. La première partie montre l'effet antiangiogénique et antitumoral de l'extrait de cartilage dans plusieurs modèles de glioblastome chez la souris. L'étude du transcriptôme des cellules endothéliales a permise de proposer des mécanismes d'actions. Il a été proposé que l'extrait de cartilage induise la sécrétion de cytokines, qui entraînent la génération de dérivés réactifs de l'oxygène. Ceux-ci entraîneraient l'activation du NFkB qui induirait l'expression d'un premier réseau de gènes impliqués dans l'inflammation de l'endothélium en croissance. La co-administration de corticoïdes pour réduire l'œdème tumoral a d'ailleurs entraîné une perte de l'efficacité in vivo et serait donc à proscrire en clinique. L'extrait de cartilage a également surexprimés un second réseau de gènes impliqués dans la protéolyse de la matrice, nécessaire à la stabilisation du tube vasculaire. Le rôle essentiel joué par l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) a été démontré par une étude fonctionnelle complète du système fibrinolytique in vivo. Enfin, la formation d'œdème tumoral, causé par ce système, a pu être contrôlée grâce à un co-traitement au N-actétylcystéine, ce qui a augmenté significativement la survie dans le modèle de glioblastome intracérébral chez la souris. Ce co-traitement serait recommandé pour des essais cliniques. La seconde partie montre que l'effet du TLN-4601 dépend d'une exposition chronique, ce qui a permis d'orienter le régime thérapeutique lors des essais cliniques. Il a été montré que ce dibenzodiazépines farnésylé, pouvait agir sur le récepteur périphérique des benzodiazépines (PBR) et les messagers farnésylés tel que Ras, Raf et Rho, dans la voie de l'EGFR. L'accumulation du composé dans les tumeurs, les effets sur la stéroïdogénèse et la dépolarisation de la mitochondrie, seraient attribuables au PBR. L'induction de tout un réseau de gènes responsables du catabolisme du glycérol et de la beta oxydation des acides gras, enlèverait les substrats nécessaires à la synthèse des phospholipides membranaires et la croissance des cellules tumorales. Ce changement métabolique, pourrait découler de l'inhibition d'Akt en aval de Ras. C'est pourquoi, les patients présentant les mutations de MDM2, p53 et PTEN, fréquemment rencontrées dans les GBM, ne seraient en théorie pas de bons candidats, car elles sont capables d'activer la voie de RAS en aval de l'effet du TLN. En revanche, la surexpression du PBR serait tout à fait souhaitable.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable partageant des mécanismes pathogéniques avec la démence frontotemporale (DFT). Elle est caractérisée par la dégénérescence sélective des neurones moteurs de la moelle épinière et du cerveau. Depuis les 25 dernières années, plus de 20 gènes ont été associés avec ces maladies, incluant FUS, C9ORF72 et TARDBP. Cependant, les liens entre la pathologie, le stade de la maladie et les mécanismes cellulaires demeurent incertains, mais semblent être multifactoriels. Bien que la SLA soit principalement considérée comme une maladie affectant le système nerveux, plusieurs d’observations suggèrent que des signaux périphériques, incluant ceux du tractus gastro-intestinal et de son microbiome, pourraient influencer la progression de la maladie. Récemment, de nouvelles études font état de perturbations du microbiome, appelé dysbiose, de la bioénergétique mitochondriale et de la composition lipidiques dans la SLA. Toutefois, il y a un manque considérable de compréhension de l’effet de ces perturbations sur la pathogenèse de la SLA. Une dysbiose a également été identifiée dans d’autres maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer (MA) et la maladie d’Huntington (MH). En utilisant l’organisme modèle Caenorhabditis elegans, nous avons identifié une souche probiotique, Lacticaseibacillus rhamnosus HA-114, ayant des propriétés neuroprotectives dans différents modèles de SLA et de MH. Dans la première partie de cette thèse, nous avons démontrés que la neuroprotection conférée par L. rhamnosus HA-114 est unique par rapport aux autres souches de L. rhamnosus et réside dans son contenu en acide gras. Ces effets bénéfiques requièrent acdh-1/ACADSB, kat-1/ACAT1 and elo-6/ELOVL3/6, gènes impliqués dans le métabolisme des lipides et la β-oxydation mitochondriale. De plus, HA-114 retarde l’apparition des symptômes et réduit la neurodégénérescence chez la souris SOD1G93A. Nos résultats suggèrent que des perturbations du métabolisme des lipides contribuent à la neurodégénérescence et que HA-114 restaure l’homéostasie lipidique et énergétique via la β-oxydation mitochondriale. Dans la seconde partie de cette thèse, nous avons utilisé le C. elegans et avons caractérisé l’orthologue de CHCHD10, har-1, dans plusieurs essais afin d’étudier son implication dans la SLA et la DFT. CHCHD10 code pour une protéine impliquée dans la maintenance de la morphologie mitochondriale et la phosphorylation oxydative. Des mutations dans ce gène ont récemment été liées à la SLA. Nous avons caractérisé deux allèles distincts : une délétion de 260 pb (gk3124) et une mutation ponctuelle (ad2155). Les mutants har-1(gk3124) et har-1(ad2155) développent une paralysie, une dégénérescence des neurones GABAergiques et une altération de la santé mitochondriale. Le pioglitazone et le 2,4-thiazolidinedione, deux composés régulant la santé mitochondriale, restaurent plusieurs phénotypes associés à la SLA chez les mutants har-1. De plus, L. rhamnosus HA-114 a également des effets similaires sur ces souches. Ces résultats semblent confirmer un lien entre le microbiome et la SLA et pourraient ouvrir la voie à de futures thérapies via la modulation de l’environnement intestinal. De plus, découvrir les mécanismes impliqués dans cette neuroprotection permettrait sans doute la découverte de nouveaux gènes et de biomolécules actives ayant la capacité de moduler la neurodégénérescence, ouvrant la voie à l’utilisation de nouveaux médicaments. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an incurable neurodegenerative disease sharing pathological pathways with frontotemporal dementia (FTD). It is characterized by the selective degeneration of lower and upper motor neurons in the spinal cord and cerebral cortex. Over the last 25 years, more than 20 genes have been associated with these diseases, including FUS, C9ORF72 and TARDBP. Despite over a century of medical investigation, the links between pathology, disease stage and cellular mechanisms are still unclear, but may be multifactorial involving unresolved gene-environment interactions. While ALS is primarily considered a central nervous system disease, emerging evidence suggests that peripheral signals, including those from the gastrointestinal tract and gut microbiota, may be involved in ALS progression. Over the last year, new evidence showed perturbations in microbiota (called dysbiosis), mitochondrial bioenergetics, and in lipid composition in ALS. However, there is a considerable lack of understanding of the effect of these perturbations in ALS pathogenesis. Interestingly, dysbiosis has also been linked to other neurological conditions like Alzheimer’s disease (AD) and Huntington’s disease (HD). Using the model organism Caenorhabditis elegans, we discovered a probiotic bacterial strain, Lacticaseibacillus rhamnosus HA-114, with neuroprotective properties in models of ALS and HD. In the first part of this thesis, we demonstrated that neuroprotection from L. rhamnosus HA-114 is unique from other L. rhamnosus strains, and resides in its fatty acid content. Neuroprotection by L. rhamnosus HA-114 requires acdh-1/ACADSB, kat-1/ACAT1 and elo-6/ELOVL3/6, which are key fatty acid metabolism and mitochondrial β-oxidation genes. Moreover, L. rhamnosus HA-114 delayed disease onset and suppressed motor neuron degeneration in an aggressive mouse model of ALS. Our data suggest that disrupted lipid metabolism contributes to neurodegeneration and that dietary intervention with L. rhamnosus HA-114 restores lipid homeostasis and energy balance through mitochondrial β-oxidation. In the second part of this thesis, we used C. elegans and characterized the CHCHD10 orthologue har-1, in a number of behavioral assays, to learn more about the biological role of this gene and its implication in ALS-FTD pathogenesis. CHCHD10 is a widely expressed gene coding for a mitochondrial protein with a potential role in cristae morphology maintenance and/or oxidative phosphorylation with mutations recently associated with ALS. We characterized two distinct alleles: a deletion of 260 bp (gk3124) and a point mutation (ad2155). Both har-1 (gk3124) and har-1 (ad2155) worms display age-dependent motility defects leading to paralysis, degeneration of GABAergic neurons and altered mitochondrial health. The small molecules, pioglitazone and 2,4-thiazolidinedione, with known neuroprotective activity, and also shown to regulate mitochondrial health, suppressed several har-1 phenotypes. Moreover, dietary supplementation of L. rhamnosus HA-114 improved several ALS-related phenotypes in these har-1 mutants. These findings may confirm a link between microbiota and ALS and can lead to future therapies, through the modulation of the intestinal environment. L. rhamnosus HA-114 is suitable for human consumption opening the possibility of modifying disease progression by dietary intervention. Furthermore, uncovering the complete neuroprotection pathway may give us insights into new genes and bioactive molecules able to modulate neurodegeneration, thus opening the door to new therapeutic approaches.

L’acétyl-coA occupe une place centrale dans le métabolisme intermédiaire. Il constitue le point de jonction de plusieurs voies métaboliques telles que la .-oxydation, la glycolyse, le catabolisme de certains acides aminés, la cétolyse, la cétogenèse et la synthèse d’acides gras. Il est également impliqué dans d’autres processus tels que l’acétylation des protéines. Au cours de mon travail de thèse, je me suis attachée à étudier différents aspects du métabolisme de l’acétyl-coA. La première partie de mon travail a porté sur la modulation pharmacologique de la .- oxydation dans le but de corriger des déficits de cette voie métabolique. L’intérêt de traitements par 400µM de bézafibrate ou 75µM de resvératrol dans les formes modérées de déficit en VLCAD et en CPT2 avait été montré précédemment. Par des méthodes de référence et grâce à la mise au point de nouvelles techniques, j’ai pu montrer sur des fibroblastes de patients déficitaires en LCHAD que des traitements par une combinaison de 35µM de bézafibrate et 30µM de resvératrol permettent d’augmenter les capacités d’oxydation du palmitate en stimulant la synthèse protéique. L’effet de cette combinaison était comparable à celui d’un traitement par 400µM de bézafibrate. Dans un second temps, je me suis intéressée à deux cofacteurs impliqués dans le métabolisme de l’acétyl-coA : l’acide lipoïque, cofacteur de quatre .-cétoacides déshydrogénases (PDHc, BCKDHc, .- KGDHc et GCS) et la riboflavine, cofacteur d’acyl-coA déshydrogénases de la .-oxydation et de déshydrogénases impliquées dans le catabolisme des acides aminés ramifiés. Ainsi, j’ai participé à la description d’anomalies du métabolisme de l’acide lipoïque, un nouveau groupe de maladies héréditaires du métabolisme caractérisé par un déficit combiné en .-cétoacides déshydrogénases. Par ailleurs, j’ai pu montrer qu’une hyperprolinémie constitue un biomarqueur intéressant pour le diagnostic d’acidurie glutarique de type II primaire ou secondaire, ces dernières pouvant se rencontrer en cas d’anomalie du métabolisme de la riboflavine. J’ai également évalué l’utilisation d’un mélange racémique de L,D-3-hydroxybutyrate afin de corriger les déficits énergétiques induits par un déficit en PDHc ou GLUT1. Via la cétolyse, le L,D-3- hydroxybutyrate génère de l’acétyl-coA. De façon surprenante, l’administration de ce composé s’est traduite par une amélioration de l’état clinique des patients atteints de déficits en PDHc, alors qu’une dégradation a été observée chez les patients atteints de déficits en GLUT1. Cette évolution différente pourrait souligner l’importance de l’anaplérose chez les patients déficitaires en GLUT1. Enfin, la dernière partie de mon travail de thèse porte sur la description d’un patient atteint d’une forme modérée de déficit en pyruvate carboxylase, cette enzyme étant régulée par l’acétyl-coA. Les difficultés diagnostiques rencontrées devant ces formes modérées sont rapportées, ainsi que des essais de traitement par des composés anaplérotiques et par le bézafibrate, malheureusement sans bénéfice net que ce soit in vitro ou in vivo. En conclusion, le métabolisme de l’acétyl-coA est altéré dans de nombreuses maladies héréditaires du métabolisme, dont certaines sont de description récente. Il peut être modulé par différentes approches pharmacologiques. Le développement de nouvelles techniques et notamment les analyses de flux métaboliques fournissent des outils utiles à son exploration et à l’étude de nouveaux traitements. / Acetyl-CoA is crucial for intermediary metabolism. It is at the crossroad of several metabolic pathways such as beta-oxidation, glycolysis, aminoacid catabolism, ketolysis, and fatty acid synthesis. It is also involved in other processes such as protein acetylation. In this document I studied different aspects of acetyl-CoA metabolism. First, I tried to correct fatty acid oxidation defects through pharmacological approach. Thanks to well- known methods and new ones, I showed that a combination of 30µM resveratrol and 35µM bezafibrate increased fatty acid oxidation capacities by increasing protein synthesis, as well as 400µM bezafibrate. Acetyl-CoA metabolism is also altered due to cofactors defects such as lipoic acid or riboflavine deficiency. I was involved in new diseases description and research for new biomarkers in this context. PDHc and GLUT1 deficiency are two different diseases with the same consequence : a defect in acetyl- CoA production from glucose. In order to improve patients’ quality of life, I evaluated the substitution of ketogenic diet with a racemic mix of L,D-3-hydroxybutyrate in PDHc and GLUT1 deficiency. The clinical evolution of patients was strikingly different, with an improvement in PDHc patients, whereas a degradation was noticed in GLUT1 patients. This difference might underline the role of anaplerosis in GLUT1 deficiency. Finally, I evaluated anaplerotic treatment and bezafibrate treatment in pyruvate carboxylase deficiency, an enzyme allosterically regulated by acetyl-CoA. To conclude, acetyl-CoA metabolism is altered in numerous inherited errors of metabolism, some of them being recently described. It can be modulated by pharmacological approaches. The development of new techniques such as metabolic flux analysis are useful for its study and for new treatments evaluation.