L'objectif de ce travail de thèse est de développer une base de données spectrale pour faciliter l'annotation et l'interprétation biologique des jeux de données d'analyse métabolomique obtenus en utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse. Deux approches ont été utilisées : (i) l'identification par comparaison aux spectres de masse de composés de références et (ii) l'identification directement à partir des données biologiques. Pour la première approche une chiomiothèque de métabolite a été constituée et analysée. L'identification à partir de données biologiques a été réalisée sur une cohorte de volontaires de 227 individus travaillant au CEA. 244 métabolites ont ainsi été identifiés dans les urines humaines, donc 78 qui n'avaient jamais été décrits comme faisant parti du métabolome urinaire.139 métabolites ont également était caractérisés sur la base de leur masse précise mais sans identification formelle. Ces 383 métabolites représentent environ 1000 ions dans chacun des modes d'ionisation. Les variations physiologiques au sein de la cohorte, en fonction de l'âge, du poids et du genre, de ces différents métabolites ont été étudiées afin de construire une base de données relationnelle. Enfin, le métabolome urinaire pouvant être affecté par les conditions de prélèvement des échantillons d'urines, nous avons réalisé des études de stabilité dans les conditions de prélèvement des métabolites précédemment caractérisés. Ces études nous ont permis de proposer des recommandations en termes de conditions de prélèvement et de stockage à court terme des urines et de mesurer l'impact de la contamination bactérienne sur les concentrations de différents métabolites urinaires.

Les RCPG sont exprimés dans tous types de tissus et sont impliqués dans la régulation de nombreux processus biologiques et ont pour rôle de capter un vaste panel de stimuli extracellulaires qu'ils transmettent à l'intérieur de la cellule. Récemment, le laboratoire a identifié une nouvelle famille de dix protéines, les GASP, qui interagissent avec les RCPG et moduleraient leur trafic intracellulaire. Alors que GASP-1 est le membre de cette famille le mieux caractérisé et que son interaction avec de nombreux RCPG soit documentée, peu d'informations sont disponibles sur les modalités d'interaction de cette protéineavec les RCPG au niveau moléculaire. La première partie de ce projet de thèse a consisté à étudier les modalités d'interaction entre les GASPs et les RCPG au niveau moléculaire. Nous avons ainsi pu montrer à l'aide de techniques biochimiques et biophysiques, l'importance d'un motif répété et conservé de 15 acides aminés pour l'interaction de GASP-1 avec divers RCPG. Par la suite, les résultats obtenus ont été exploités pour mettre en place un essai de criblage qui nous a permis d'identifier des petites molécules capables de perturber l'interaction entre GASP-1 et le récepteur beta-2 adrénergique. Enfin, l'absence de données structurales sur les protéines de la famille GASP nous a ensuite poussé à la réalisation d'études structurales de ces protéines à la fois par cristallographie et par RMN. Bien que les résultats obtenus ne nous aient pas encore permis d'obtenir la structure de ces protéines, des expériences préliminaires de RMN ont permis deconfirmer l'implication des acides aminés tryptophanes présents au sein des motifs GASP dans l'interaction avec les RCPG.

NcRNA represent most of primary transcripts RNA in higher eukaryotes and tune gene expression via diverse mechanisms. They adopt 3D structures composed at 70% by WC bp forming A-form helices linked by RNA motifs. We identified the pk-turn, a new RNA motif related to k-turns that allow for the formation of a bend of 60° between stems P16 and P17 from the bacterial RNaseP. Yet it features different sequence and structural requirements than k-turns. The 2nd ribozyme which got my attention is the LCrz inserted in GIR2, a group I intron. This twintron is observed in the pre-rRNA 18S of the small subunit of the eukaryoteD. iris. LCrz catalyzes a reaction equivalent to the first step of splicing by group II introns, but in a structural context related to group I introns. We solved the 2.5 Å crystal structure of the LCrz and confirmed the unexpected shape by means of SAXS experiments. This work emphasizes the relationship between structure and function in the evolution of ribozymes.

Le sélénium est à la fois un polluant toxique et un oligo-élément essentiel, qui entre dans la composition de la sélénocystéine : le 21ème acide aminé du code génétique. Dans les sélénoprotéines, cet acide aminé est souvent un résidu primordial situé au site actif de l'enzyme. L'incorporation de la sélénocystéine est effectuée lors de la traduction, par le ribosome, grâce à un "recodage" d'un codon Stop (UGA) de l'ARN messager de la sélénoprotéine. Le mécanisme requiert la présence d'une séquence signal dans cet ARNm appelée SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence). La sélénocystéine est donc une exception du code génétique : contrairement aux acides aminés canoniques, elle est synthétisée sur son ARNt, puis incorporée grâce à des facteurs spécifiques. Cette biosynthèse originale sur l'ARNtSec se retrouve, sous des formes légèrement différentes, dans les trois domaines du vivant. Chez les eubactéries, l'acteur de l'étape clé de cette biosynthèse est SelA, enzyme responsable de l'incorporation du sélénium conduisant à la sélénocystéine au niveau de l'ARNtSec. En prenant comme exemples les organismes E. coli et M. thermoacetica, cette thèse rapporte l'étude structurale et enzymatique du complexe formé par SelA et l'ARNtSec. Il est abordé dans un premier temps la cristallisation du complexe pour les deux organismes d'étude, puis l'étude biochimique de la formation du macro-complexe entre l'enzyme décamérique SelA et jusqu'à 5 ARNtSec. Nous avons pour cela tiré parti des techniques de micro-calorimétrie, d'interférences chimiques et de mesures d'activité. Une discussion sur l'apport de ces nouvelles données sur l'interprétation du fonctionnement du complexe complète cette étude.

Le système immunitaire inné constitue la première barrière de défense du corps humain contre les agents infectieux. Constitue d'une poignée de récepteurs seulement (approximativement 50), ce système est capable de détecter la plupart des agents pathogènes et d'activer le système immunitaire adaptatif. Dans le cas d'une infection virale, deux classes de récepteurs sont mobilisées : les RLRs (Retinoic acid Like Récepteurs) et les TLRs (Toll Like Receptors). La famille des RLRs comprend notamment trois protéines, RIG-I, MDA-5 et LGP2, qui reconnaissent la présence d'ARN viral dans le cytosol. Dans la première partie de cette thèse, nous discuterons de la voie d'activation de RIG-I : avec quels type d'ARN et de quelle manière RIG-I interagit-il ? L'etat d'oligomerisation de RIG-I change-t-il lors de l'interaction avec l'ARN ? De quelle manière RIG-I est-il influence par l'ubiquitine et sa ligase E3, TRIM25 ? Nous présenterons egalement la structure du domaine PRYSPRY de TRIM25, domaine minimum nécessaire à l'interaction avec RIG-I. Nous d'écrirons également les travaux préliminaires obtenus sur un complexe constitue de MDA5 et une molecule d'inhibition virale. L'ARN des virus de la grippe est un des activateurs du récepteur RIG-I. Les virus de la grippe appartiennent 'a la famille des Orthomyxoviridae qui touche les mammifères et les aves créant des épidémies saisonnières. Ces dernières peuvent causer jusqu'à plusieurs millions de morts lors de pandémies, soulignant le besoin de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques. Dans la seconde partie de ma thèse, nous nous intéresserons à l'activité endonucléase de l'ARN polymérase du virus A/California/04/2009-H1N1 de la grippe porcine comme une cible pour de nouvelles molécules antivirales. Les structures de quatre inhibiteurs en complexe avec ce domaine seront présentés. Nous présenterons également la structure de PA-Nter avec les substrats rUMP et dTMP co-cristallisés dans le site actif. Toutes ces structures atomiques forment une base pour l'optimisation et la synthèse d'inhibiteurs.

Les microARN, ARN courts non codants, jouent un rôle primordial dans la régulation post-transcriptionnelle des gènes. Une modification d'expression de ces ARN peut donc contribuer à la tumorogenèse et au développement tumoral par dérégulation de l'expression de gènes impliqués dans des processus clés du cancer. Nous avons souhaité mettre en évidence des signatures spécifiques (i) du phénotype d'invasion des méningiomes et (ii) du phénotype d'aggressivité des gliomes par étude des oligodendrogliomes (gliomes de bas grade) et glioblastomes (gliomes de haut grade). (i) Les profils d'expression des microARN dans des méningiomes invasifs montrent des différences par rapport à ceux des méningiomes non invasifs ; confirmant l'intérêt de ces explorations moléculaires pour une application diagnostique directe. (ii) Dans le cas des gliomes, plusieurs miARN ont été détectés et validés et constituent des signatures spécifiques des gliomes en comparaison aux échantillons contrôles. Certains permettent également une distinction aisée des oligodendrogliomes et glioblastomes. Des études génomiques et épigénétiques ont été menées pour rationaliser, du point de vue de la physiopathologie des cellules, les différences d'expression des miARN entre les différents tissus. Au niveau du protéome, des dérégulations d'expression de cibles des miARN identifiés ont été mises en évidence comme celles de MDH1, SIRT1, STAT3 ou PTBP1, protéines clés de la physiologie cellulaire et nous avons pu décrire des voies moléculaires pertinentes du développement tumoral des gliomes.

La caractérisation de l'interaction de différentes biomolécules avec les lipides constitue une étape cruciale pour la compréhension du comportement et du mode d'action de ces molécules avec les membranes cellulaires. Nous présentons ici des études biomimétiques d'une protéine musculaire. Des modèles membranaires et des méthodes biophysiques ont été utilisées. La dystrophine est une protéine filamenteuse essentielle pour le fonctionnement musculaire. Son absence ou sa modification suite à des mutations ont responsables de myopathies. Dans cette étude, nous avons analysé les propriétés de certaines répétitions homologues à la spectrine du domaine central de la dystrophine. Nous caractérisons les interactions spécifiques de deux sous domaines constitués des répétitions 1 à 3 et 20 à 24 avec les lipides. Nous montrons d'autre part, que l'interaction et l'organisation des répétitions 11 à 15 avec des membranes anioniques et zwitterioniques sont modulées par la courbure membranaire et le packing lipidique. L'analyse de propriétés rhéologiques de surface montre que les répétitions 11 à 15 forment un lien fonctionnel entre la membrane et les filaments d'actine du cytosquelette. Cette liaison mécanique contribuerait in vivo au rôle d'amortisseur de chocs attribué à la dystrophine lors des cycles de contractions-relaxations musculaires. Dans une dernière partie de ce travail, nous avons étudié la relation structure-activité d'un "de novo" peptide antimicrobien, K4. Nous identifions un mécanisme d'action de type detergent-like, conférant l'activité antimicrobienne.

Notre génome, véritable mode d'emploi de chaque cellule et organisme, est constamment menacé par de multiples agents endogènes ou exogènes qui endommagent la biomolécule d'ADN. Ces lésions résultantes, de nature diverse, sont notamment impliquées dans les processus de vieillissement cellulaire, de cancérogénèse et de mort cellulaire. Afin de contrer ces effets néfastes, les organismes ont développé différents systèmes de réparation de l'ADN capables de prendre en charge spécifiquement chaque type de dommages. Parmi ces voies métaboliques, la réparation par excision de base (BER) répare chaque jour des dizaines de milliers de dommages, incluant les bases alkylées, oxydées ou désaminées, les sites abasiques ou encore certaines cassures de brin. Dans le présent travail, nous exposons la mise au point d'un nouveau biocapteur pour la détection des activités enzymatiques du BER. L'outil se caractérise par un set de sondes nucléiques autocomplémentaires, fluorescentes ou pro-fluorescentes, immobilisées sur microbilles paramagnétiques. Chaque sonde est modifiée par l'introduction sélective d'une lésion, substrat d'une activité enzymatique ciblée (ADN N-glycosylase, AP-endonucléase). L'activité d'excision/incision de la lésion, conduit à la coupure de la sonde et à la déshybridation de la structure. L'analyse et la quantification du clivage spécifique est réalisée en fluorescence, soit à partir du surnageant par spectrofluorimétrie, soit des billes par cytométrie en flux. Ce dispositif permet la détection multiplexée des activités enzymatiques de protéines purifiées ou au sein d'extraits nucléaires. Egalement, des applications dans le criblage d'inhibiteurs de la réparation de l'ADN sont envisageables dans le cadre de recherches pré-cliniques. L'adaptation de ces tests in vitro à la détection de la réparation de l'ADN in cellulo a fait l'objet de développements préliminaires.

L'adaptation d'une bactérie aux changements de son environnement est contrôlée par un réseau de régulation large et complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs et modules différents. Dans ce travail, nous avons étudiés un module de régulation spécifique, contrôlant l'adaptation de la bactérie Escherichia coli à un changement de sources de carbone. Dans un milieu contenant du glucose et de l'acétate, la croissance est divisée en deux phases : les bactéries utilisent préférentiellement le glucose et commencent à métaboliser l'acétate qu'après l'épuisement du glucose. En effet, la présence du glucose réprime la transcription d'un gène nécessaire à la croissance sur acétate, le gène acs (codant pour l'acétyl-CoA synthétase). Le mécanisme régulateur fait intervenir le facteur de transcription Crp-AMPc et le système de transfert de phosphate (PTS), qui permet l'import du glucose. Plusieurs modèles décrivent en détail la cascade de réactions moléculaires à l'origine de cette " répression catabolique ". Cependant, certaines de nos observations expérimentales ne sont pas correctement prédites par les modèles actuels. Ces modèles doivent être révisés ou complétés. L'outil majeur que nous employons pour les expériences est la fusion transcriptionnelle : une région promotrice fusionnée en amont d'un gène rapporteur (GFP, luciferase). Avec ces constructions, nous mesurons la dynamique de l'expression génique dans différentes souches (mutants) et différentes conditions environnementales. Les observations à l'échelle de la population sont corroborées par des mesures similaires à l'échelle de la cellule unique. Nous utilisons cette même technologie pour construire de petits systèmes synthétiques qui sondent davantage le phénomène de répression catabolique. Nous avons ainsi créé un interrupteur génétique dont le fonctionnement est contrôlé par le flux glycolytique et nous avons construit un petit système de communication intercellulaire basé sur la molécule AMPc. Enfin, nous proposons une manière originale de mesurer l'état métabolique des cellules en utilisant la dépendance énergétique de la luciferase.

Dans le milieu marin, les émissions biogéniques de composés iodées jouent un rôle essentiel dans le cycle biogéochimique de l'iode. Cependant les processus enzymatiques responsables de l'absorption, du stockage ou de la synthèse de métabolites iodés restent mal connus chez les chez les organismes marins, et plus encore chez les bactéries. Plusieurs gènes, potentiellement impliqués dans le métabolisme de l'iode, ont été identifiés dans le génome de la bactérie marine, Zobellia galactanivorans, dont celui codant une iodoperoxydase à vanadium (VIPO), enzyme spécifique de l'oxydation des iodures. La partie principale du projet de thèse a consisté à comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la spécificité pour certains halogénures des haloperoxydases à vanadium, en étudiant la VIPO de Z. galactanivorans par des approches de mutagénèse dirigée et de biologie structurale. Les douze enzymes mutantes produites et caractérisées au niveau biochimique montrent soit une perte d'activité, soit des modifications de leurs propriétés catalytiques, soit encore une faible activité bromoperoxydase. Les enzymes sauvage et mutantes ont également été étudiées par diffraction et absorption des rayons X, afin de relier les modifications structurales à leurs propriétés catalytiques. Les résultats suggèrent que le principal facteur modulant la spécificité chez ces enzymes est le potentiel d'oxydoréduction de l'intermédiaire réactionnel, le peroxovanadate. Des analyses biochimiques ont aussi été entreprises pour deux autres protéines identifiées sur le génome de Z. galactanivorans. La première protéine s'est révélée être une seconde VIPO. Pour la deuxième protéine, similaire à une iodotyrosine déiodinase, l'activité biochimique reste encore à être caractérisée. Z. galactanivorans posséderait plusieurs enzymes pouvant oxyder l'iodure, ainsi qu'une permettant de cliver les liaisons C-I. En parallèle à ce travail, la localisation et la spéciation de l'iode ont été étudiées par imagerie chimique chez Z. galactanivorans et chez l'algue brune, Laminaria digitata, connue pour ses fortes teneurs en iode. Les résultats de ce travail apportent un nouvel éclairage sur les mécanismes contrôlant la spécificité des haloperoxydases à vanadium envers les halogénures, et également sur l'origine bactérienne de cette famille d'enzymes. Plus globalement, ces études permettent de mieux appréhender le rôle du métabolisme de l'iode chez certaines bactéries marines et leurs importances dans le cycle biogéochimique de l'iode.