Secretion is the passage of macromolecules across cellular membranes. In bacteria, secretion is essential for virulence and survival. Gram-negative bacteria use specialized envelope-spanning multiprotein complexes to secrete macromolecules called type IV secretion system (T4SS). T4SSs mediate the secretion of monomeric proteins, multisubunit protein toxins and nucleoprotein complexes. Also, they contribute to the horizontal spread of plasmid-encoded antibiotic resistance genes. Consequently, they are potential targets for antivirulence drugs. Gram- negative bacteria have two membranes that the secretion complex spans. As a result, the T4SS consists of proteins inserted in the membranes and of soluble proteins that face into or out of the bacterial cell. The details of channel assembly and structure are not known, although recent advances have revealed the structure of the core secretion channel. VirB8 is an inner membrane protein of the complex that interacts with many other T4SS subunits and works as nucleation factor for T4SS channel assembly. Biophysical studies and NMR experiments in particular were conducted to characterize the structural aspects of VirB8 interactions. Dynamic regions of VirB8 during monomer-to-dimer transition were identified by NMR spectroscopy. X-ray crystal and NMR analyses revealed structural differences at the helical regions (α-1 and α-4) of wild-type VirB8 and its monomeric variant VirB8M102R. Fragment screening identified small molecules binding to the wild-type and monomeric variant. In silico docking analyses suggested that the surface groove in the VirB8 structure is important for effective binding of the small molecules. NMR experiments and biochemical assays demonstrated that the β-sheet domain (β1 in particular) is the binding interface of VirB8 for the interaction with VirB10. The identified interface has functional importance for T4SS-mediated conjugation. In addition, I used NMR spectroscopy to identify changes in the structure of VirB8 upon interaction with VirB5. Altogether, structural and biochemical studies on periplasmic and full length VirB8 enabled us to characterize the sequence of interactions between VirB8 and other VirB proteins during T4SS complex assembly and function. The results of this research may lead to an innovative strategy for the development of novel antimicrobial drugs. / La sécrétion est le passage de macromolécules à travers les membranes cellulaires. Chez les bactéries, la sécrétion est essentielle pour la virulence et la survie. Les bactéries à Gramnégatif utilisent le système de sécrétion de type IV (SST4) pour la sécrétion de toxines et de nucléoprotéines. Les SST4 contribuent notamment à la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques. Pour cette raison, les composants du SST4 sont des cibles potentielles pour le développement de médicaments antivirulence. Le SST4 est un complexe protéique qui s’étend entre la double membrane de la bactérie à Gram-négatif. Les protéines qui le composent sont insérées dans les membranes cellulaires ou solubles. Bien que la structure du pore central du SST4 ait été résolue récemment, les détails de l'assemblage et la structure de ce complexe ne sont pas connus. VirB8 est une protéine de la membrane interne qui interagit avec de nombreuses autres sous-unités du SST4. Il s’agit d’un acteur central de l'assemblage du SST4. Des études biophysiques, et notamment des expériences de RMN ont ainsi été réalisées pour caractériser les aspects structuraux des interactions avec VirB8. Des regions dynamiques dans la structure de VirB8 ont été identifiées par spectroscopie RMN lors de la transition entre la forme monomérique et dimérique. Les analyses de cristallographie et de RMN ont révélé des différences structurales dans les régions hélicoïdales (α1 et α4) de VirB8 wild-type et du variant monomérique VirB8M102R. Le criblage de fragments a permis d’identifier de petites molécules capables de se lier à VirB8 ainsi qu’au variant monomérique. Les analyses d’arrimage moléculaire in silico suggèrent que la rainure de surface dans la structure VirB8 est importante pour laliaison de ces petites molécules. Les expériences de RMN et les essais biochimiques révèlent que le feuillet β (β1 en particulier) constitue l'interface d’interaction entre VirB8 et VirB10. Cette interface d’interaction est d’ailleurs importante pour la conjugaison du SST4. De plus, j'ai identifié des changements dans la structure de VirB8 lors de l'interaction avec VirB5. Les études sur la protéine VirB8 nous ont permis de caractériser la séquence d'événements entre VirB8 et d'autres protéines VirB, régulant l'assemblage et la fonction du SST4.

Les ribozymes sont des ARN catalytiques fréquemment exploités pour le développement d’outils biochimiques et d’agents thérapeutiques. Ils sont particulièrement intéressants pour effectuer l’inactivation de gènes, en permettant la dégradation d’ARNm ou d’ARN viraux associés à des maladies. Les ribozymes les plus utilisés en ce moment pour le développement d’agents thérapeutiques sont les ribozymes hammerhead et hairpin, qui permettent la reconnaissance spécifique d’ARN simple brin par la formation de structures secondaires stables. In vivo, la majorité des ARN adoptent des structures secondaires et tertiaires complexes et les régions simples brins sont parfois difficiles d’accès. Il serait intéressant de pouvoir cibler des ARN repliés et un motif d’ARN intéressant à cibler est la tige-boucle d’ARN qui peut être importante dans le repliement global des ARN et pour accomplir des fonctions biologiques. Le ribozyme VS de Neurospora fait la reconnaissance de son substrat replié en tigeboucle de façon spécifique par une interaction kissing-loop, mais il n’a jamais été exploité pour faire la reconnaissance d’un ARN cible très différent de son substrat naturel. Le but des travaux présentés dans cette thèse est de déterminer si le ribozyme VS possède l’adaptabilité nécessaire pour l’ingénierie de ribozymes qui clivent des ARN cibles différents du substrat naturel. Dans le cadre de cette thèse, le ribozyme VS a été modifié pour l’adapter à différents substrats et des études de cinétiques ont été réalisées pour évaluer l’impact de ces modifications sur l’activité de clivage du ribozyme. Dans un premier temps, le ribozyme a été modifié pour faire la reconnaissance et le clivage de substrats possédant différentes longueurs de tiges Ib. Le ribozyme a été adapté avec succès à ces substrats de différentes longueurs de tige Ib, avec une activité qui est similaire à celle du ribozyme avec un substrat sans modification. Dans un deuxième temps, c’est l’interaction kissing-loop I/V du ribozyme qui a été substituée de façon rationnelle, dans le but de savoir si un ribozyme VS mutant peut reconnaitre et cliver un substrat ayant une boucle différente de celle de son substrat naturel. L’interaction kissing-loop I/V a été substituée pour les interactions kissing-loop TAR/TAR* de l’ARN du VIH-1 et L22/L88 de l’ARN 23S de Deinococcus radiodurans. La réaction de iii clivage des ribozymes comportant ces nouvelles interactions kissing-loop est toujours observée, mais avec une activité diminuée. Finalement, la sélection in vitro (SELEX) de ribozymes a été effectuée pour permettre un clivage plus efficace d’un substrat mutant avec une nouvelle boucle. Le SELEX a permis la sélection d’un ribozyme qui clive un substrat avec une boucle terminale mutée pour celle de l’ARN TAR du VIH-1 et cela avec une activité de clivage très efficace. L’ensemble de ces études démontre que le ribozyme VS peut être modifié de diverses façons pour la reconnaissance spécifique de différents substrats, tout en conservant une bonne activité de clivage. Ces résultats montrent le grand potentiel d’ingénierie du ribozyme VS et sont prometteurs pour la poursuite d’études d’ingénierie du ribozyme VS, en vue du clivage d’ARN cibles repliés en tige-boucle complètement différents du substrat naturel du ribozyme VS. / Ribozymes are catalytic RNAs frequently exploited for the development of biochemistry tools and therapeutic agents. They are particularly interesting in gene inactivation strategies for the degradation of mRNA and viral RNA genome. Currently, the most common ribozymes used in the development of therapeutic agents are the hammerhead and hairpin ribozymes, which can specifically recognize and cleave target single-stranded RNAs through the formation of stable secondary structures. In vivo, single-stranded RNAs can be difficult to target because most RNA adopt complex secondary and tertiary structures. It could be worthwhile to target folded RNA motifs, and an interesting target is the stem-loop structure because stem-loops are important for the overall folding of RNA molecules and they can perform important biological functions. The Neurospora VS ribozyme recognizes its stem-loop folded substrate via a specific kissing-loop interaction, but it has never been exploited for the recognition of target RNA very different from its natural substrate. The goal of the work presented in this thesis is to determine whether the VS ribozyme possesses the necessary adaptability for engineering ribozymes that target RNAs different from its natural substrate. For this thesis, the VS ribozyme was adapted for the recognition of different substrates and kinetic studies were performed to evaluate the effect of these modifications on the cleavage activity. In a first study, the VS ribozyme was modified to recognize and cleave substrates with different stem Ib lengths. The VS ribozyme was successfully adapted to theses substrates of different lengths with a cleavage activity similar to the unmodified ribozyme and substrate. In a second study, the I/V kissing-loop interaction was substituted by rational design, in order to establish if the VS ribozyme variants could recognize and cleave a substrate with a different loop than its natural substrate. The I/V kissing-loop interaction was substituted for the HIV-1 TAR/TAR* and the Deinococcus radiodurans RNA large rRNA subunit L22/L88 kissing-loop interactions. The cleavage reaction was observed for the ribozymes with these new interactions, but with reduced activity. Finally, in vitro selection (SELEX) was used to enable more efficient cleavage of a mutant substrate with a new loop. SELEX experiments enabled v the selection of ribozyme variants that cleave a substrate with a terminal loop mutated to that of the HIV-1 TAR RNA with a very efficient cleavage activity. All of the studies presented in this thesis show that the VS ribozyme can be modified in various ways for the specific recognition of different substrates, while maintaining efficient cleavage activity. These results demonstrate the great potential of VS ribozyme engineering and are very promising for further engineering studies of VS-derived ribozymes for the cleavage of stem-loop folded target RNA completely different from its natural VS ribozyme substrate.

La numération plaquettaire est une analyse délicate et le résultat est souvent erroné notamment du fait d’une tendance à l’agrégation in vitro dans certaines espèces animales. Il a ainsi pu être démontré chez le Chat que ce phénomène peut être inhibé par l’association d’un anticoagulant avec des inhibiteurs plaquettaires : le CTAD (Citrate, Théophylline, Adénosine et Dipyridamole). Cette association permet ainsi l’obtention de numérations plaquettaires fiables sans affecter les autres populations sanguines, mais également d’effectuer des analyses d’hémostase et de biochimie. De nouveaux intervalles de référence ont dû être établis pour certaines variables hématologiques avec les analyseurs utilisés en laboratoire et dans les cliniques vétérinaires. Par ailleurs, si les effets antiagrégants du CTAD sont moins nets chez le Chien, il peut également servir d’anticoagulant « universel », permettant de réduire le nombre de prélèvements et d’améliorer ainsi le bien-être des animaux. / The platelet count is a delicate measurement, which may often be erroneous because of the tendency of platelets from some animal species to aggregate in vitro. This study demonstrated that this effect can be inhibited in cats using CTAD (Citrate, Theophylline, Adenosine and Dipyridamole) composed of an anticoagulant and platelet inhibitors. This association provides reliable platelet counts without affecting other blood populations and also allows hemostasis and biochemical analyses. New hematological reference intervals have been established for some variables with analyzers used in clinical pathology laboratories and veterinary clinics. Furthermore, if the antiplatelet clumping effects of CTAD are less marked in canine species, the CTAD can also serve as "universal" anticoagulant, reducing the number of blood samples and thus improving animal welfare.

Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) et le virus Nipah (NiV) appartiennent respectivement aux familles des Rhabdoviridae et des Paramyxoviridae. VSV est un modèle du virus de la rage tandis que NiV est un virus émergeant, appartenant à la sous-famille des Paramyxovirinae, pour lequel les données moléculaires et structurales sont limitées. Ces sont des virus enveloppés dont le génome code pour cinq à neuf protéines. Le complexe de réplication de ces virus est constitué de trois protéines : la phosphoprotéine (P), la nucléoprotéine (N) et la polymérase virale (L). La N encapside le génome viral et l'ensemble N-ARN sert de matrice pour la transcription et la réplication. La P joue deux rôles : elle sert de cofacteur pour la polymérase et forme le complexe N0-P qui maintient la N sous une forme soluble, compétente pour l'encapsidation des génomes néo-synthétisés. Un premier objectif de mon travail de thèse consistait à étudier la structure et la dynamique des protéines P de VSV et de NiV. Ce sont des protéines modulaires qui contiennent des domaines structurés, séparés par des régions flexibles. A mon arrivée au laboratoire un travail important avait été déjà réalisé sur la P de VSV et j'ai participé à l'achèvement de cette étude. Je me suis ensuite intéressé à la protéine P de NiV. J'ai cristallisé et résolu par diffraction des rayons X les structures du domaine C-terminal et du domaine central (codes PDB : 4F9X et 4GJW). La combinaison de ces modèles cristallographiques avec des données de SAXS sur la P entière et des données de résonance magnétique nucléaire (RMN, collaboration IBS) va permettre d'obtenir un modèle atomique de la P entière sous la forme d'un ensemble de conformères. Un deuxième objectif était d'étudier les complexes N0-P. J'ai activement participé au développement de la méthode de reconstitution et à la caractérisation structurale du complexe N0-P de VSV, entre un mutant de la N (NΔ21) et un peptide N-terminal de la P (code PDB : 3PMK). J'ai ensuite reconstitué, cristallisé et résolu la structure de complexe N0-P de NiV entre la N (tronquée de son domaine C-terminal) et la partie N-terminale de la P. Ces structures montrent par quel mécanismes moléculaires la P maintien la N sous forme monomérique, en empêchant sa polymérisation et son interaction avec l'ARN. Les résultats présentés ici ont permis de générer de nouvelles hypothèses pour expliquer les mécanismes d'encapsidation et d'initiation de la synthèse d'ARN chez ces virus. Le complexe N0-P étant essentiel pour la réplication du virus, l'information structurale obtenue au cours de ce travail devrait permettre d'envisager l'utilisation de ce complexe comme cible pour le développement de composés antiviraux. / Abstract Vesicular stomatitis virus (VSV) and Nipah virus (NiV) belong to the Rhabdoviridae and Paramyxoviridae families, respectively. VSV serves as model system for rabies virus while NiV is an emerging pathogen of the Paramyxovirinae subfamily, for which molecular and structural data are scarce. Both viruses are enveloped and their genomes encode five to nine proteins. Three proteins form their replication complex: the phosphoprotein (P), the nucleoprotein (N) and the viral polymerase (L). N encapsidates the viral genome and this N-RNA complex serves as template for transcription and replication. P has two functions: it serves as a polymerase cofactor and forms an N0-P complex, which keeps the N protein in a soluble and monomeric state, competent for the encapsidation of the newly synthesized genomes. The first goal during the PhD work was to study the structure and dynamics of the VSV and NiV P proteins. These proteins are modular, containing structured domains separated by flexible regions. Before my arrival, a large amount of work was already done on the VSV P protein in the lab and I was involved in the final stages of this work. Then this I studied the NiV P protein, crystallizing and solving the structures of its Central and C-terminal domains by X-ray crystallography (PDB codes: 4F9X and 4GJW). Combining these structures with small angle X-ray scattering (SAXS) and nuclear magnetic resonance (NMR, collaboration with IBS group) data obtained for the entire protein will allow the construction of an atomic model of the phosphoprotein in the form of a conformational ensemble. The second goal was to study the N0-P complex. I actively participated in the development of the method which permitted the reconstruction of the VSV N0-P complex, using a truncation mutant of the N protein (NΔ21) and an N-terminal peptide from P, and to its structural determination (PDB code: 3PMK). Then I reconstructed, crystallized and solved the structure of the NiV N0-P complex using a C-terminally truncated N protein and the N-terminal region of the P protein. Both structures yielded insights into the molecular mechanisms used by the phosphoproteins in order to maintain the corresponding nucleoproteins in their monomeric state, thus inhibiting their polymerization and interaction with RNA. The results presented here also offered new hypothesis about mechanisms of encapsidation and of RNA synthesis initiation. Given that the N0-P complex is an essential component of the replication complex, the structural information gained from this work allow us to consider this complex as a potential antiviral target.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative fatale caractérisée par une perte progressive et sélective des neurones moteurs. La SLA est incurable et il n’existe aucun traitement efficace pour les personnes atteintes de cette maladie. Environ 90% des cas sont sporadiques tandis que 10% sont familiaux, et les patients décèdent généralement deux à cinq ans après l'apparition des premiers symptômes. De nombreuses anomalies génétiques sont associées à la SLA, incluant des mutations dans les protéines FUS, C9orf72, SOD-1 et TDP-43. Le laboratoire a développé un modèle transgénique de Caenorhabditis elegans surexprimant la protéine humaine mutante TDP-43(Q331K) dans les neurones moteurs GABAergiques. Nous avons également obtenu par mutagénèse et CRISPR-Cas9 des modèles physiologiquement représentatifs du nématode basés sur des mutations dans tdp-1, l'orthologue de TARDBP chez le C. elegans. L'objectif est de caractériser ces modèles et de déterminer s'ils peuvent récapituler certains aspects phénotypiques clés de la SLA, tels que des déficits moteurs et une neurodégénérescence dépendante de l'âge générant une paralysie. L’hypothèse est que le modèle TDP-1 pourra refléter plus précisément l’expression physiologique du gène dans la maladie humaine grâce à la mutation dans un gène endogène, l’absence de surexpression et l’expression ubiquitaire de la protéine TDP-1. Les résultats montrent que les modèles TDP-43/TDP-1 ont des déficits moteurs, une transmission synaptique altérée et une neurodégénérescence liée à l’âge. Cependant, seule la mutation dans TDP-43 semble avoir un effet sur la durée de vie. Ces modèles procurent différentes expressions physiologiques des protéines mutantes et donc, des phénotypes de niveaux d'intensité variables. Ils constitueront des outils utiles pour élucider de nouveaux mécanismes pathogéniques de la SLA ainsi que de bons candidats pour le criblage de médicaments et le développement de stratégies thérapeutiques. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease characterized by a progressive and selective loss of motor neurons. ALS is incurable and there are no effective treatments available for people living with the disease. About 90% of the cases are sporadic whereas 10% are familial, and patients usually die two to five years after symptom onset. Many gene defects are associated with ALS, including mutations in genes encoding FUS, C9orf72, SOD-1 and TDP-43 proteins. We have developed a transgenic Caenorhabditis elegans model expressing human mutant TDP-43(Q331K) in GABAergic motor neurons. We have also obtained by mutagenesis and CRISPR-Cas9 physiologically accurate models based on mutations in tdp-1, the C. elegans ortholog of TARDBP. Our objective is to characterize these models and determine if they can recapitulate key aspects of the disease such as motor deficits and age-dependent neurodegeneration causing paralysis. We believe that the TDP-1 model will reflect more precisely the physiological expression of the gene in the human disease because of its mutation in an endogenous gene, the absence of overexpression and ubiquitous protein expression. Our results show that both TDP-43 and TDP-1 models have motor deficits, synaptic transmission impairments and age-dependent neurodegeneration. However, only the TDP-43 mutation seems to have an effect on lifespan. These models provide different physiological expression of mutant proteins and thus phenotypes of varying intensity levels. They will be useful tools to elucidate new pathogenic mechanisms of ALS as well as being good candidates for drug screening and developing therapeutic strategies.

Depuis les années quatre-vingt, la construction d’édifices supramoléculaires à base de complexes de coordination suscite un intérêt considérable dans la recherche de nouveaux nanomatériaux fonctionnels. L’utilisation de complexes métalliques permet non seulement l’obtention d’une multitude de supramolécules de géométrie et de dimensionnalité très variées, mais également l’introduction de processus remarquables au sein des entités nanométriques, comme par exemple le transfert d’énergie lumineuse, le transport d’électrons et la séparation photo-induite de charges. La recherche menée au cours de cette thèse s’est plus particulièrement focalisée sur l’étude de deux types d’édifices supramoléculaires polymétalliques de dimensions différentes, l’un tridimensionnel, construit au départ d’ions ruthénium (II), l’autre unidimensionnel, obtenu à partir d’ions cuivre (II) ou cuivre (I).<p><p>Plus précisément, la première partie de ce travail a été consacrée à la synthèse d’un complexe hexanucléaire symétrique de Ru(II), à base de ligands pontants PHEHAT et TPAC, afin de développer de nouvelles antennes collectrices d’énergie lumineuse. Dans ce cadre, nos travaux se sont principalement concentrés sur la synthèse ainsi que sur l’étude électrochimique et photophysique de deux nouveaux composés précurseurs trinucléaires, le cis-{[(phen)2Ru(PHEHAT)]2Ru(CH3CN)2}6+ et le {[(phen)2Ru(PHEHAT)]2Ru(TPAC)}6+, pouvant également servir de bloc de construction pour l’élaboration d’entités de tailles encore plus importantes. Une analyse par spectrométrie de masse du produit obtenu par chélation de l’entité bis-CH3CN sur le composé trinucléaire à base de TPAC ne nous a pas permis de prouver la présence de l’entité hexanucléaire. La nature du composé identifié semble toutefois confirmer la formation de l’espèce souhaitée à un moment ou un autre. <p><p>La seconde partie de notre travail a consisté à tester le TPAC ainsi que deux ligands dérivés du dipyrrométhène (m-DipyH et m-dpDipyH) comme agents pontants pour la construction de nouveaux complexes polynucléaires cuivrés unidimensionnels. D’une part, nous nous sommes penchés sur la synthèse des sous-unités monométalliques [Cu(II)(Dipy)2]0, [Cu(II)(dpDipy)2]0 et [Cu(I)(dpDipy)2]-. L’ensemble des études réalisées sur les deux composés mononucléaires de Cu(II) a permis la mise en évidence de propriétés extrêmement différentes de celles des complexes de Cu(II) polypyridiniques, tant du point de vue structural, qu’électrochimique et photophysique. Par ailleurs, les analyses consacrées à la caractérisation du [Cu(I)(dpDipy)2]- ont révélé de manière surprenante un comportement instable pour cette entité, à l’inverse des complexes de Cu(I) à base de phénanthrolines « encombrées ». Le recours à des calculs théoriques nous a permis de proposer une hypothèse pouvant expliquer cette différence de comportement. D’autre part, bien que des incertitudes subsistent toujours quant à la possibilité de former des entités polynucléaires à base de Cu(II) et de TPAC, les résultats obtenus par spectrométrie de masse ont clairement prouvé l’obtention d’espèces de Cu(II) de très haute nucléarité au départ du m-DipyH. Les ligands pontants dérivés du dipyrrométhène se révèlent donc être de très bons candidats pour l’élaboration d’entités unidimensionnelles de Cu(II). Celles-ci pourraient susciter un grand intérêt dans le cadre d’une application impliquant l’utilisation de la lumière, en raison des propriétés d’absorption et de luminescence intéressantes détectées pour les sous-unités monométalliques de Cu(II). <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Présente chez les mammifères, mitoNEET (mNT) est une protéine à centre Fe-S ancrée à la membrane externe de la mitochondrie. Cette protéine dimérique possède un centre [2Fe-2S] par monomère lié de façon atypique à la protéine par trois cystéines et une histidine. Notre équipe a auparavant montré l’implication de mNT dans une nouvelle voie de réparation du centre [4Fe-4S] de l’Iron Regulatory Protein-1 (IRP-1), régulateur majeur de l’homéostasie du fer intracellulaire, par transfert du centre Fe-S de mNT à l’IRP-1 à réparer. Au cours de ma thèse, je me suis focalisée sur la caractérisation in vitro de la réaction de transfert de centre Fe-S de mNT vers une protéine réceptrice modèle, l’apo-ferrédoxine d’E. coli. En combinant des approches de biochimie et biophysique (réalisées en collaboration) à l’aide de protéines purifiées, cette étude a permis de démontrer que mNT agit comme un interrupteur moléculaire : lorsque son centre Fe-S est réduit, la protéine est extrêmement stable et le centre ne peut être ni perdu ni transféré; une fois oxydé, il peut alors être transféré à une protéine réceptrice. La présence d’oxygène n’affecte pas cette réaction même s’il s’agit d’un déterminant majeur de la stabilité de la protéine. De plus, la vitesse de transfert du centre est très sensible au pH, ce qui fait de mNT un senseur de pH. Ces études ont aussi montré que mNT est extrêmement résistante à H2O2 en comparaison à d’autres protéines de transfert de centre Fe-S. J’ai également étudié l’interaction d’une molécule anti-oxydante, le resvératrol-3 sulfate, avec mNT. Pour finir, je me suis intéressée à l’effet du glutathion sur mNT. Acteur majeur de la régulation de l’homéostasie rédox, le glutathion existe sous deux formes: oxydée (GSSG) et réduite (GSH). J’ai alors constaté que le GSH déstabilise fortement mNT à certains pH et peut même se lier à cette protéine. La fonction thiol du GSH et la formation de radicaux sur cette dernière sont clairement impliquées dans la déstabilisation de mNT. / Present in mammals, mitoNEET (mNT) is an Fe-S protein anchored to the outer mitochondrial membrane. This dimeric protein contains a [2Fe-2S] per monomer with an atypical ligation involving three cysteines and one histidine. Previously, our team proposed that mNT is involved in a new pathway dedicated to the reparation of the oxidatively damaged [4Fe-4S] cluster of human iron-regulatory protein-1 (IRP-1)/cytosolic aconitase, a key player of the regulation of cellular iron homeostasis. This reparation occurs via Fe-S cluster transfer from mNT to IRP-1 to repair. In the course of my thesis, I focused on the characterization of cluster transfer reaction from mNT to a model receptor protein, the E. coli apo-ferredoxin. Using purified proteins and combining biochemical approaches with biophysical ones performed in colaboration, this study showed that mNT acts as a redox switch: when the Fe-S cluster is reduced, the protein is extremely stable and it cannot be lost or transferred; when it is oxidized, it can be transferred to a receptor protein. Dioxygen does not affect this transfer reaction whereas this is a major determinant of protein stability. The transfer speed is highly sensitive to pH. Thus, mNT seems to act also as a pH sensor. Moreover, this study shows that mNT is extremely resistant to H2O2 compared to other Fe-S cluster transfer proteins. I also looked at the interaction of an antioxidant molecule, the resveratrol-3-sulfate, with mNT. Finally, I studied the effects of glutathione on mNT. Major player of the regulation of redox homeostasis, glutathione exists under two states: a reduced state (GSH) and an oxidized one (GSSG). I observed that GSH strongly destabilizes mNT at specific pHs and can even directly interact with the protein. The thiol function of GSH and the radical formation on this function are clearly involved in the mNT Fe-S destabilization.

La metformine, un médicament couramment utilisé pour le traitement du diabète de type II, fut récemment identifiée comme un composé ayant des propriétés anticancéreuses très intéressantes, notamment pour le cancer du pancréas. Toutefois, malgré les nombreuses expériences in vitro et sur des modèles murins qui ont confirmé cet effet, les essais cliniques sur les humains sont restés infructueux. Un des facteurs mis en cause pour expliquer ces résultats est la grande hydrophilie de la metformine, qui diminue sa biodisponibilité et limite son transport au travers des membranes cellulaires. Nous nous sommes donc intéressés à la synthèse de sels de biguanidium amphiphiles inspirés de la metformine qui se partitionnent plus facilement dans les bicouches phospholipidiques et qui possèdent de meilleures activités anticancéreuses. Pour ce faire, nous avons tout d’abord étudié la perturbation des membranes par de simples alkylbiguanidium. Nous avons démontré que ces composés peuvent transporter des ions H+/OH- et dépolariser les membranes bactériennes, ce qui leur confère des propriétés antibactériennes et antifongiques. Afin de limiter l’hémolyse associée à ces composés, des sels de biguanidium substitués par le groupement phényléthynylbenzyle ont par la suite été synthétisés. La structure de ceux-ci leur permet de mieux se partitionner dans les membranes et s’accumuler dans les mitochondries, tout en diminuant la toxicité associée à une perturbation membranaire trop forte. Leur activité sur les cellules cancéreuses du pancréas est ainsi beaucoup plus importante que celle de la metformine, de même que leur capacité à inhiber la croissance de xénogreffes chez les souris. Ces résultats nous ont ensuite amené vers la synthèse d’une petite librairie de sels de biguanidium et l’étude de leurs activités anticancéreuses et antibactériennes. Les modifications structurales et les changements de contre-ion apportés à cette librairie ont permis d’obtenir des composés encore plus efficaces et surtout beaucoup plus sélectifs envers les cellules saines, ouvrant ainsi la porte à une nouvelle classe de médicaments anticancéreux à base de sels de biguanidium. / Metformin, a common drug used for the treatment of type II diabetes, has recently been linked to interesting anticancer properties, notably on pancreatic cancer. Although there have been many experiments in vitro and on murine models that have confirmed this effect, human clinical trials featuring metformin have been unsuccessful. One of the reasons brought forward to explain these results is the high hydrophilicity of metformin, which limits its bioavailability and transport through cellular membranes. For this reason, we have been interested in the synthesis of amphiphilic biguanidium salts inspired from metformin that can partition more easily in phospholipid membranes and thus have better anticancer properties. We first studied the membrane perturbation properties of simple alkylbiguanidium salts and showed that these compounds can transport H+/OH- ions and depolarize bacterial membranes, which in turn gives them antibacterial and antifungal properties. To limit the hemolytic activity associated with these compounds, biguanidium salts substituted by the phenylethynylbenzyl moiety were then synthesised. Their structure allows them to partition more easily in membranes and accumulate in mitochondria, while lowering the toxicity associated with high membrane perturbation. For those reasons, their activity on pancreatic cancer cells is much higher than metformin, as is their inhibition of xenograft growth in mice. These results encouraged us to synthesise a small library of biguanidium salts and study their anticancer activity. The structural modifications and counter-anion variations brought to this library have improved the efficiency of these compounds as well as their selectivity towards healthy cells, thus opening the door to a new class of anticancer drugs based on biguanidium salts.

Le système de sécrétion type VII (T7SS) présent chez les mycobactéries comporte cinq loci, nommés ESX-1 à ESX-5, chacun possédant leurs propres fonctions. Le système ESX-3, le plus conservé entre les espèces de mycobactéries, participe au transport du fer et à la sécrétion de protéines dont la protéine EsxH. EsxH interagit avec le système ESCRT dans le macrophage et contribue à la persistance de M. tuberculosis (Mtb) dans l’hôte. Afin de mieux comprendre le mécanisme du T7SS, nous avons surexprimé le locus ESX-3 de Mtb dans les organismes recombinants M. smegmatis et M. marinum. Nous avons purifié un coeur protéique partiel du complexe ESX-3 par chromatographie liquide de protéine rapide (FPLC) et déterminé différentes structures in vitro qui pourraient représenter son dynamisme par une analyse des particules individuelles. Nous avons localisé le complexe ESX-3 aux pôles chez M. marinum par microscopie de fluorescence (fLM) et microscopie super-résolution d’illumination de structure (SR-SIM). Finalement, nous avons reconstruit un modèle in vivo 3D de ce complexe en jumelant une technique de corrélation entre la microscopie par localisation photoactivée (PALM) et la tomographie électronique en conditions cryogéniques (cryo-ET). En jumelant nos structures in vitro et notre modèle in vivo, nous discutons d’un mécanisme possible du complexe ESX-3. Ces analyses pourront aussi supporter le criblage d’inhibiteurs potentiels pour traiter les infection mycobactériennes. / A novel, type VII secretion system (T7SS) was recently discovered in Mycobacteria. Five subsystems, called ESX-1 to ESX-5, have been identified, with the ESX-3 being the most conserved. The ESX-3 system is essential for growth and pathogenesis, and has been implicated in iron transport and secretion of effector proteins into the host. The secreted proteins are shown to prevent phagosome maturation by interacting with the ESCRT machinery of the macrophage. To characterize the structure and mechanism of secretion employed by the T7SS, we use the ESX-3 system from Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and recombinantly express it in M. smegmatis and M. marinum cells. By combining Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) and Single Particle electron microscopy analysis, we have reconstructed several in vitro models that contain at least three of the ESX-3 cluster proteins and may represent the dynamic nature of the core complex. Using fluorescent light microscopy (fLM) and super-resolution structure illumination microscopy (SR-SIM), we localized the ESX-3 complex to the lateral pole in M. marinum cells. We also used super-resolution photoactivated localization microscopy (PALM) in correlation with cryo-electron tomography (cryo-ET) of whole M. marinum cells to localize and reconstruct an in vivo 3D model of the ESX-3 secretion system. By combining the single particle reconstructions and the cryotomography data, we discuss a possible mechanism of ESX-3 secretion. Such analysis may support future inhibitor screens to prevent mycobacterial infections.

La cholestase intrahépatique de la grossesse (CIG) est la maladie du foie la plus répandue au cours de la grossesse. Elle est caractérisée par un prurit et est associée à une augmentation de la concentration des acides biliaires dans le sang, ce qui peut mener à un risque accru de conséquences périnatales indésirables, y compris un accouchement prématuré spontané et une augmentation des risques de mort de l’enfant à l’accouchement, entre autres. Le traitement médical de cette maladie repose actuellement sur l’acide ursodésoxycholique (UDCA) qui diminue le prurit et les anomalies biochimiques maternelles dans certains cas. Actuellement, le diagnostic de la CIG est posé suite à un test de quantification des acides biliaires sériques totaux par une méthode enzymatique. Nous émettons l'hypothèse que certains profils d’acides biliaires permettraient d’évaluer le risque de complications chez les femmes atteintes de CIG. En analysant les profilages, il pourrait être possible de déterminer la ou les espèces responsables de ces complications et ainsi déterminer des sous-groupes de patientes plus à risque de complications ou qui répondraient mieux au traitement. De plus, nous pensons que le traitement à l’UDCA, étant lui-même un acide biliaire, pourrait interférer lors de la quantification des acides biliaires totaux sériques, particulièrement dans les cas les plus problématiques de CIG où de fortes doses de ce composé sont administrées. Si c’était le cas, cela ferait en sorte que les valeurs de référence pourraient être modifiées en fonction du traitement administré. Le projet de recherche présenté vise au développement d’une méthode de quantification des acides biliaires sériques par la chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (LC-MS/MS), qui permettrait un profilage des acides biliaires sériques chez les femmes enceintes atteintes de la CIG et qui permettrait également d’évaluer l’effet du traitement à l’UDCA sur ce profilage. Une méthode de quantification des acides biliaires par chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem a été développée et validée. Les surnageants obtenus par précipitation de protéines avec le méthanol ont été injectés sur le LC-MS/MS. La séparation est réalisée par chromatographie en phase inverse sur une colonne C18 de type interactions hydrophobes. Les transitions ioniques sur le spectromètre de masse ont été déterminées pour toutes les espèces d’acides biliaires au préalable et l’acide cholique deutéré, l’acide chénodésoxycholique deutéré ainsi que l’acide désoxycholique deutéré ont été utilisés comme standards internes. Quinze acides biliaires, y compris les acides biliaires conjugués et libres, ont été séparés et quantifiés par LC–MS/MS en utilisant l’ionisation par électro nébulisation (ESI) en mode ion négatif. La quantification a été réalisée en mode de surveillance de réactions multiples (MRM) avec des méthodes de courbes d'étalonnage externes. Les coefficients de corrélation des courbes standards pour tous les acides biliaires étaient supérieurs à 0,9966. La méthode développée a démontré une précision acceptable, avec une imprécision intra analyse inférieure à 3,2% pour toutes les espèces d’acide biliaire étudiées (pour des échantillons à 0,8 et 5 μg/mL) et une imprécision inter analyse inférieure à 15%. Une suppression d’ion moyenne de 8,2% a été observée, qui a été jugée acceptable. Une bonne corrélation a été obtenue entre la méthode LC-MS/MS et une méthode enzymatique (r=0,964). En conclusion, une méthode fonctionnelle, efficace et rapide a été développée pour quantifier les acides biliaires sériques individuels et différents profils d’acides biliaires représentant une large gamme de concentrations ont été comparés. La comparaison des profilages d’acides biliaires suggère que les acides biliaires principaux responsables de l’augmentation de la concentration des acides biliaires totaux dans le sang pour des échantillons à une concentration de plus de 10 μmol/L sont l’acide cholique glyco-conjugué (GCA), l’acide cholique tauro-conjugué (TCA) ainsi que l’acide ursodésoxycholique glyco- conjugué (GUDCA). Cette nouvelle méthode validée, et les données préliminaires sur les profils d’acides biliaires dans les échantillons cliniques, permettront de lancer des analyses cliniques prospectives pour évaluer l’effet du traitement par l’UDCA sur les concentrations totales d’acides biliaires sériques et sur les profils d’acides biliaires individuels chez les patientes atteintes de la CIG. / Intrahepatic cholestasis of pregnancy (ICP) is the most common liver disease during pregnancy. It is characterized by pruritus and is associated with an increased concentration of bile acids in blood, which may lead to an increased risk of perinatal consequences, including spontaneous preterm delivery and an increased risk of death at birth, among others. The medical treatment of this disease currently relies on ursodeoxycholic acid (UDCA) which reduces pruritus and maternal biochemical abnormalities in some cases. Currently, the diagnosis of ICP is made using an enzymatic assay to measure total serum bile acids. We hypothesize that profiling of the individual bile acids would make it possible to assess the risk of complications in women with ICP. By analyzing the bile acid profiles, it could be possible to determine which specie(s) is responsible for these complications and thus to distinguish subgroups of patients at higher risk of complications or who would respond better to treatment. In addition, we believe that UDCA treatment, being a bile acid itself, could interfere with the quantification of total serum bile acids, particularly in the most problematic cases of CIG where high doses of this compound are administered. If this was the case, it would mean that the reference values would need to be changed depending on the administered treatment. The research project aims to develop and validate a method for quantifying bile acids in serum by liquid chromatography coupled to a tandem mass spectrometer (LC-MS/MS), which would allow profiling of serum bile acids in affected women and which would also make it possible later to evaluate the effects of UDCA treatment on this profiling. A method for the quantification of bile acids by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry has been developed and validated. The supernatants obtained by precipitation of proteins with methanol were injected onto the LC-MS/MS. The separation was carried out using reversed-phase chromatography on a C18 hydrophobic interactions type column. Ionic transitions on the mass spectrometer were determined for all bile acids species beforehand and deuterated cholic acid, deuterated chenodeoxycholic acid and deuterated deoxycholic acid were used as internal standards. Fifteen bile acids, including conjugated and free bile acids, were separated and quantified by LC–MS/MS using electrospray ionization (ESI) in negative ion mode. Quantification was performed in multiple reaction monitoring (MRM) mode with external calibration curve methods. Correlation coefficients for standard curves for all bile acids were greater than 0.9966. The method developed showed acceptable precision, with intra-assay imprecision of less than 3.2% for all the bile acid species studied (for samples at 0.8 and 5 μg/mL) and inter-assay imprecision under 15%. An average ion suppression of 8.2% was observed, which was judged acceptable. Finally, a good correlation was obtained between the LC-MS/MS method and an enzymatic method (r = 0.964). In conclusion, a functional, efficient and rapid method was developed to quantify the individual serum bile acids and different bile acids profiles representing a wide range of concentrations were compared. The comparison of the bile acid profiles suggests that the main bile acids responsible for the increase in total bile acids concentration in blood for samples at a concentration of more than 10 μmol/L are glycocholic acid (GCA), taurocholic acid (TCA), glycoursodeoxycholic acid (GUDCA). This new validated method, and the preliminary data on bile acid profiles in clinical samples, will allow us to initiate prospective clinical analyses to assess the effect of UDCA treatment on total bile acid concentrations and profiles in patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy.