L’interaction d’un ligand avec un récepteur à sept domaines transmembranaires (7TMR) couplé aux protéines G, mène à l’adoption de différentes conformations par le récepteur. Ces diverses conformations pourraient expliquer l’activation différentielle des voies de signalisation. Or, le lien entre la conformation et l’activité du récepteur n’est pas tout à fait claire. Selon les modèles classiques pharmacologiques, comme le modèle du complexe ternaire, il n’existe qu’un nombre limité de conformations qu’un récepteur peut adopter. Afin d’établir un lien entre la structure et la fonction des récepteurs, nous avons choisi dans un premier temps, le récepteur de chimiokine CXCR4 comme récepteur modèle. Ce dernier, est une cible thérapeutique prometteuse, impliqué dans l’entrée du VIH-1 dans les cellules cibles et dans la dissémination de métastases cancéreuses. Grâce au transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) nous pouvons détecter les changements conformationnels des homodimères constitutifs de CXCR4 dans les cellules vivantes. En conséquence, nous avons mesuré les conformations de mutants de CXCR4 dont les mutations affecteraient sa fonction. Nous montrons que la capacité des mutants à activer la protéine Galphai est altérée suite au traitement avec l’agoniste SDF-1. Notamment, ces mutations altèrent la conformation du récepteur à l’état basal ainsi que la réponse conformationnelle induite suite au traitement avec l’agoniste SDF-1, l’agoniste partiel AMD3100 ou l’agoniste inverse TC14012. Ainsi, différentes conformations de CXCR4 peuvent donner lieu à une activation similaire de la protéine G, ce qui implique une flexibilité des récepteurs actifs qui ne peut pas être expliquée par le modèle du complexe ternaire (Berchiche et al. 2007). Également, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CCR2, exprimé à la surface des cellules immunitaires. Il joue un rôle important dans l’inflammation et dans des pathologies inflammatoires telles que l’asthme. CCR2 forme des homodimères constitutifs et possède différents ligands naturels dont la redondance fonctionnelle a été suggérée. Nous avons étudié le lien entre les conformations et les activations d’effecteurs (fonctions) de CCR2. Notre hypothèse est que les différents ligands naturels induisent différentes conformations du récepteur menant à différentes fonctions. Nous montrons que les réponses de CCR2 aux différents ligands ne sont pas redondantes au niveau pharmacologique et que les chimiokines CCL8, CCL7 et CCL13 (MCP-2 à MCP-4) sont des agonistes partiels de CCR2, du moins dans les systèmes que nous avons étudiés. Ainsi, l’absence de redondance fonctionnelle parmi les chimiokines liant le même récepteur, ne résulterait pas de mécanismes complexes de régulation in vivo, mais ferait partie de leurs propriétés pharmacologiques intrinsèques (Berchiche et al. 2011). Enfin, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CXCR7. Récemment identifié, CXCR7 est le deuxième récepteur cible de la chimiokine SDF-1. Cette chimiokine a été considérée comme étant capable d’interagir uniquement avec le récepteur CXCR4. Notamment, CXCR4 et CXCR7 possèdent un patron d’expression semblable dans les tissus. Nous avons évalué l’effet de l’AMD3100, ligand synthétique de CXCR4, sur la conformation et la signalisation de CXCR7. Nos résultats montrent qu’AMD3100, tout comme SDF-1, lie CXCR7 et augmente la liaison de SDF-1 à CXCR7. Grâce au BRET, nous montrons aussi qu’AMD3100 seul est un agoniste de CXCR7 et qu’il est un modulateur allostérique positif de la liaison de SDF-1 à CXCR7. Aussi, nous montrons pour la première fois le recrutement de la beta-arrestine 2 à CXCR7 en réponse à un agoniste. L’AMD3100 est un ligand de CXCR4 et de CXCR7 avec des effets opposés, ce qui appelle à la prudence lors de l’utilisation de cette molécule pour l’étude des voies de signalisation impliquant SDF-1 (Kalatskaya et al. 2009). En conclusion, nos travaux amènent des évidences qu’il existe plusieurs conformations actives des récepteurs et appuient les modèles de structure-activité des récepteurs qui prennent en considération leur flexibilité conformationnelle. / Ligand binding to 7TMRs is thought to induce conformational changes within the receptor that translate into activation of downstream effectors. The link between receptor conformation and activity is still poorly understood, as current models of receptor activation fail to take an increasing amount of experimental data into account. Classical pharmacological models such as the ternary complex model are based on the concept that receptors can only adopt a limited number of conformations. To clarify structure-function relationships in 7TMRs, first we studied chemokine receptor CXCR4. This receptor is an important drug target, involved in HIV-1 entry and cancer metastasis. Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) allows us to directly probe conformational changes within pre-formed CXCR4 homodimers in live cells. Using BRET, we measured the conformation of CXCR4 mutants and we also monitored their function by measuring their ability to induce Galphai activation. The analyzed mutants had substitutions in locations which are pivotal molecular switches for receptor conformation and activation. We show that agonist induced Gi activation is altered for most mutants. These mutations also alter CXCR4’s conformation at basal conditions (in absence of ligand) and in the presence of the agonist, SDF-1, the partial agonist, AMD3100 and the inverse agonist, TC14012. Moreover, different conformations of active receptors were detected in the presence of SDF-1, suggesting that different receptor conformations are able to trigger Galphai activity. These data provide biophysical evidence for different active receptor conformations, that cannot be explained by classical models of receptor function (Berchiche et al. 2007). Furthermore, the second part of our work focused on chemokine receptor CCR2. Mainly expressed on immune cells, CCR2 is involved in many inflammatory and vascular diseases. This receptor binds seven natural ligands that have been referred to as redundant. We set out to explore whether the different chemokine ligands of CCR2 receptor induce different conformational changes leading to different functional consequences. Our results show that the different natural ligands of CCR2 are not pharmacologically redundant. Moreover, chemokines CCL8, CCL7 and CCL13 (MCP-2 to MCP-4) are partial agonists of CCR2, at least in the systems we used. Our results support the validity of models for receptor-ligand interactions in which different ligands stabilize different receptor conformations also for endogenous receptor ligands, demonstrating that these natural ligands are not pharmacologically and functionally redundant (Berchiche et al. 2011). As the third part of this work, we studied chemokine receptor CXCR7, the alternative receptor for SDF-1. Until recently, CXCR4 was the only receptor known to bind SDF-1. Moreover, the expression patterns are similar for receptors CXCR4 and CXCR7. Therefore, we investigated the conformational and functional consequences of the synthetic inhibitor of CXCR4, AMD3100, on CXCR7. We show that AMD3100 also binds the alternative SDF-1 receptor, CXCR7. SDF-1 or AMD3100 alone trigger beta-arrestin recruitment to CXCR7, which we identify as a previously unreported signalling pathway of CXCR7. In addition, AMD3100 has positive allosteric effects on SDF-1 binding to CXCR7, on SDF-1-induced conformational rearrangements in the receptor dimer as measured by BRET, and on SDF-1-induced beta-arrestin recruitment to CXCR7. The finding that AMD3100 not only binds CXCR4, but also to CXCR7, with opposite effects on the two receptors, call for caution in the use of this compound as a tool to dissect SDF-1 effects on the respective receptors in vitro and in vivo. Finally, these data provide biophysical evidence for different active receptor conformations, and support models of 7TMR structure-activity relationships that take conformational heterogeneity into account.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) demeurent au tournant de ce siècle la principale cause de mortalité dans le monde. Parmi les facteurs de risque, l’hypercholestérolémie et l’obésité abdominale sont directement liées au développement précoce de l’athérosclérose. L’hypercholestérolémie familiale, communément associée à une déficience des récepteurs des lipoprotéines de basse densité (LDLR), est connue comme cause de maladie précoce d’athérosclérose et de calcification aortique chez l’humain. La subtilisine convertase proprotéine/kexine du type 9 (PCSK9), membre de la famille des proprotéines convertases, est trouvée indirectement associée aux MCV par son implication dans la dégradation du LDLR. Chez l'humain, des mutations du gène PCSK9 conduisent soit à une hypercholestérolémie familiale, soit à une hypocholestérolémie, selon que la mutation entraîne un gain ou une perte de fonction, respectivement. Il demeure incertain si les individus porteurs de mutations causant un gain de fonction de la PCSK9 développeront une calcification aortique ou si des mutations entraînant une perte de fonction provoqueront une obésité abdominale. Dans cette étude, nous avons examiné : 1) l’effet d’une surexpression de PCSK9 dans le foie de souris sur la calcification aortique ; 2) les conséquences d’une déficience en PCSK9 (Pcsk9 KO), mimant une inhibition pharmacologique, sur le tissu graisseux. Nous avons utilisé un modèle de souris transgénique (Tg) surexprimant le cDNA de PCSK9 de souris dans les hépatocytes de souris et démontrons par tomographie calculée qu’une calcification survient de façon moins étendue chez les souris PCSK9 Tg que chez les souris déficientes en LDLR. Alors que le PCSK9 Tg et la déficience en LDLR causaient tous deux une hypercholestérolémie familiale, les niveaux seuls de cholestérol circulant ne parvenaient pas à prédire le degré de calcification aortique. Dans une seconde étude, nous utilisions des souris génétiquement manipulées dépourvues de PSCK9 et démontrons que l’accumulation de graisses viscérales (adipogenèse) apparaît régulée par la PCSK9 circulante. Ainsi, en l’absence de PCSK9, l’adipogenèse viscérale augmente vraisemblablement par régulation post-traductionnelle des récepteurs à lipoprotéines de très basse densité (VLDLR) dans le tissu adipeux. Ces deux modèles mettent en évidence un équilibre dynamique de la PCSK9 dans des voies métaboliques différentes, réalisant un élément clé dans la santé cardiovasculaire. Par conséquent, les essais d’investigations et d’altérations biologiques de la PCSK9 devraient être pris en compte dans un modèle animal valide utilisant une méthode sensible et en portant une attention prudente aux effets secondaires de toute intervention. / Cardiovascular disease (CVD) is the leading cause of death in the 21st century. Among risk factors, hypercholesterolemia and abdominal obesity are directly linked to premature development of atherosclerosis. Familial hypercholesterolemia, commonly due to low-density lipoprotein receptor (LDLR) deficiency, is known to cause premature atherosclerosis and aortic calcification in humans. Proprotein convertase subtilisin/kexin 9 (PCSK9), a member of the proprotein convertase family, is indirectly associated with CVD through enhanced LDLR degradation. Mutations in the human PCSK9 gene lead to either familial hypercholesterolemia or hypocholesterolemia, depending on whether the mutation causes a gain or a loss of function, respectively. It is uncertain if individuals carrying mutations causing a gain-of-function of PCSK9 will develop aortic calcification or whether loss-of-function mutations will lead to abdominal obesity. In this thesis, we investigated: 1) the effect of PCSK9 overexpression on aortic calcification; 2) the consequences of PSCK9 deficiency, mimicking pharmacological inhibition of PCSK9 on fat tissue. We employed a transgenic (Tg) mouse model overexpressing mouse PCSK9 and illustrated by micro-computerized tomography that calcification occurs to a lesser extent in PCSK9 Tg mice than in LDLR-deficient mice. While both PCSK9 Tg and LDLR deficiency caused familial hypercholesterolemia, circulating cholesterol levels alone could not dictate the degree of aortic calcification. In another study, we used genetically modified mice lacking PCSK9 and demonstrated that visceral fat accumulation (adipogenesis) is regulated by circulating PCSK9. Thus in the absence of PCSK9, visceral adipogenesis increases likely via post-translational regulation of very-low-density lipoproteins receptors (VLDLR) in the adipose tissue. In conclusion, these two studies highlight the dynamic balance of PCSK9 in different metabolic pathways, making it a key element in cardiovascular health. Consequently, attempts to survey and/or alter PCSK9 biology should be performed in a valid animal model using sensitive methods and with careful attention to side effects of any given intervention.

Les estrogènes jouent un rôle primordial dans le développement et le fonctionnement des tissus reproducteurs par leurs interactions avec les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ. Ces récepteurs nucléaires agissent comme facteurs de transcription et contrôlent l’expression des gènes de façon hormono-dépendante et indépendante grâce à leurs deux domaines d’activation (AF-1 et AF-2). Une dérégulation de leur activité transcriptionnelle est souvent à l’origine de pathologies telles que le cancer du sein, de l’endomètre et des ovaires. Alors que ERα est utilisé comme facteur pronostic pour l’utilisation d’agents thérapeutiques, l’importance de la valeur clinique de ERβ est encore controversée. Toutefois, des évidences récentes lui associent un pouvoir anti-tumorigénique en démontrant que sa présence favorise l’inhibition de la progression de ces cancers ainsi que l’efficacité des traitements. En combinaisons avec d’autres études, ces observations démontrent que bien que les deux isoformes partagent une certaine similitude d’action, les ERs sont en mesure d’exercer des fonctions distinctes. Ces différences sont fortement attribuables au faible degré d’homologie observé entre certains domaines structuraux des ERs, comme le domaine AF-1, ce qui fait en sorte que les différents sites de modifications post-traductionnelles (MPTs) présents sur les ERs sont très peu conservés entre les isoformes. Or, l’activité transcriptionnelle ligand-dépendante et indépendante des ERs est hautement régulée par les MPTs. Elles sont impliquées à tous les niveaux de l’activation des ERs incluant la liaison et la sensibilité au ligand, la localisation cellulaire, la dimérisation, l’interaction avec l’ADN, le recrutement de corégulateurs transcriptionnels, la stabilité et l’arrêt de la transcription. Ainsi, de par leur dissimilitude, les ERs seront différemment régulés par la signalisation cellulaire. Comme un débalancement de plusieurs voies de signalisation ont été associées à la progression de tumeurs ER-positives ainsi qu’au développement d’une résistance, une meilleure compréhension de l’impact des MPTs sur la régulation spécifique des ERs s’avère essentielle en vue de proposer et/ou développer des traitements adéquats pour les cancers gynécologiques. Les résultats présentés dans cette thèse ont pour objectif de mieux comprendre les rôles des MPTs sur l’activité transcriptionnelle de ERβ qui sont, contrairement à ERα, très peu connus. Nous démontrons une régulation dynamique de ERβ par la phosphorylation, l’ubiquitination et la sumoylation. De plus, toutes les MPTs nouvellement découvertes par mes recherches se situent dans l’AF-1 de ERβ et permettent de mieux comprendre le rôle capital joué par ce domaine dans la régulation de l’activité ligand-dépendante et indépendante du récepteur. Dans la première étude, nous observons qu’en réponse aux MAPK, l’AF-1 de ERβ est phosphorylé au niveau de sérines spécifiques et qu’elles jouent un rôle important dans la régulation de l’activité ligand-indépendante de ERβ par la voie ubiquitine-protéasome. En effet, la phosphorylation de ces sérines régule le cycle d’activation-dégradation de ERβ en modulant son ubiquitination, sa mobilité nucléaire et sa stabilité en favorisant le recrutement de l’ubiquitine ligase E6-AP. De plus, ce mécanisme d’action semble être derrière la régulation différentielle de l’activité de ERα et ERβ observée lors de l’inhibition du protéasome. Dans le second papier, nous démontrons que l’activité et la stabilité de ERβ en présence d’estrogène sont étroitement régulées par la sumoylation phosphorylation-dépendante de l’AF-1, processus hautement favorisé par l’action de la kinase GSK-3. La sumoylation de ERβ par SUMO-1 prévient la dégradation du récepteur en entrant en compétition avec l’ubiquitination au niveau du même site accepteur. De plus, contrairement à ERα, SUMO-1 réprime l’activité de ERβ en altérant son interaction avec l’ADN et l’expression de ses gènes cibles dans les cellules de cancers du sein. Également, ces recherches ont permis d’identifier un motif de sumoylation dépendant de la phosphorylation (pSuM) jusqu’à lors inconnu de la communauté scientifique, offrant ainsi un outil supplémentaire à la prédiction de nouveau substrat de la sumoylation. En plus de permettre une meilleure compréhension du rôle des signaux intracellulaires dans la régulation de l’activité transcriptionnelle de ERβ, nos résultats soulignent l’importance des MPTs dans l’induction des différences fonctionnelles observées entre ERα et ERβ et apportent des pistes supplémentaires à la compréhension de leurs rôles physiopathologiques respectifs. / Estrogens play a pivotal role in reproductive physiology through direct interaction with the estrogen receptors ERα and ERβ, which belong to the nuclear hormone receptor family of ligand-activated transcription factors. Harbouring two activation domains (AF-1 and AF-2), gene expression can be controlled by ERs either in a hormone-dependent and/or independent manner. Disruption of ER transcriptional regulation is associated with pathological events such as breast and endometrial cancers. While ERα is considered a strong predictive factor in endocrine therapy of reproductive cancers, the clinical value of ERβ is still debated, although greater expression of ERβ has been associated with a favourable outcome since recent evidence has associated ERβ with anti-tumorigenic properties and a better response to anti-estrogenic compounds. Along with others studies, those individual outcomes indicate that even though the two receptors can exert similar roles by sharing resemblances in terms of structure and general response to hormone, they can also carry out distinct functions. These variations can be attributed to the fact that most of the structural domains shared by ERs exhibit a low level of homology, especially at the AF-1 domain. Consequently, the majority of the post-translational modifications sites (PTMs) on ERs are not shared between both isoforms. In fact, ligand-induced and ligand-independent activities of ERs are critically influenced by PTMs. PTMs controls the multiple aspects of ER-dependent activation by modulating ERs ligand binding, specificity, cellular localization, dimerization, interaction with their cognate DNA response element, combinatory recruitment of transcriptional coregulators, stability and transcriptional arrest. Hence, by their discrepancies, ERs will be differently influenced by the cellular environment. Furthermore, as the deregulation of different signalling pathway in cancers is associated with ER-dependant tumour progression and in the acquisition of a therapeutic resistant phenotype, it is crucial to understand the how PTMs affect ERs transactivation in order to eventually propose and/or develop adequate treatment. The results presented in this thesis were carried out with the objective of gaining a better understanding of PTM’s roles on ERβ transcriptional control which, as opposed to ERα, remain unclear. We demonstrate here a dynamic regulation of ERβ by phosphorylation, ubiquitination and sumoylation. Furthermore, as all the newly identified PTM are located within de AF-1 domain of ERβ, our results highlight the key role of this domain in the regulation of ligand-dependent and independent transcriptional properties of this receptor. The first study shows that in response to MAPK, specific serine residues in the AF-1 of ERβ are phosphorylated and play an important role in the regulation of ERβ ligand-independent activity by the ubiquitin-proteasome pathway. In fact, the activation-degradation cycle of ERβ induced by MAPK is regulated upon phosphorylation of these serines coordinating ERβ ubiquitination, subnuclear mobility and stability by promoting the recruitment of the ubiquitin ligase E6-AP. Moreover, this molecular process plays part in the differential regulation of ERα and ERβ activity upon proteasome inhibition. In the second paper, we demonstrate that ERβ activity and stability in presence of estrogen is closely regulated by the phosphorylation-dependent sumoylation of the AF-1 domain, amplified by GSK-3 action. SUMO-1 attachment prevents ERβ degradation by competing with ubiquitin at the same acceptor site and dictates ERβ transcriptional inhibition, as opposed to ERα, by altering estrogen-responsive target promoter occupancy and gene expression in breast cancer cells. Furthermore, these findings uncover a novel phosphorylated sumoylation motif (pSuM) and offer a valuable tool to predict novel SUMO substrates under protein kinase regulation. In combination to our better understanding on how intracellular signals controls ERβ transcriptional activity, our results highlight the significant role of PTMs in ERs isoforms discrepancies and allows supplementary comprehension of their respective physiopathologicals roles.

Les mécanismes cellulaires anti-prolifératifs, lesquels comprennent l’apoptose, aussi appelée la mort cellulaire programmée, l’arrêt transitoire du cycle cellulaire et la sénescence, permettent à la cellule de prévenir, en réponse à différents stress, l’accumulation de mutations pouvant conduire à une prolifération incontrôlée et, éventuellement, au développement d’une tumeur. La régulation de ces différents mécanismes requiert l’activation de protéines appelées des suppresseurs de tumeur, dont le principal est p53. p53 est un facteur de transcription dont la stabilisation et l’activation conduit à une hausse de l’expression de gènes directement impliqués dans l’arrêt de la prolifération. Au cours des dernières années, l’ensemble des travaux sur p53 ont permis de mettre en évidence la complexité de sa fonction, de même que la multitude de voies de signalisation et de protéines avec lesquelles il coopère pour maintenir l’intégrité du génome. De ce fait, l’étude des mécanismes d’activation de p53 est de mise pour la compréhension de sa régulation et, éventuellement, pour la prévention et l’élaboration de nouvelles stratégies de traitement contre le cancer. L’objet de cette thèse est la mise en évidence d’un mécanisme d’activation de p53 et de la sénescence par la protéine SOCS1, un suppresseur de la signalisation par les cytokines. Ce mécanisme implique une interaction directe entre les deux protéines, plus précisément entre le domaine SH2 de SOCS1 et le domaine de transactivation de p53. SOCS1 interagit également, au niveau de son SOCS Box, avec les kinases ATM et ATR de la voie du dommage à l’ADN de façon à faciliter la phosphorylation de p53 en sérine 15. Ainsi, en interagissant à la fois avec p53 et ATM/ATR, SOCS1 contribue à la stabilisation et à l’activation de p53. En accord avec ce modèle, l’inhibition de SOCS1 dans des fibroblastes humains normaux tend à diminuer le nombre de cellules sénescentes suite à l’expression de l’oncogène ca-STAT5A et à réduire l’accumulation nucléaire de p53 dans ces cellules. De la même façon, les lymphocytes T provenant de souris Socs1-/-Ifnγ-/- sont moins susceptibles d’entrer en apoptose que les lymphocytes provenant de souris Socs1+/+Ifnγ+/+, suite à une exposition à des radiations. Dans les deux contextes, on observe une baisse de l’expression des gènes cibles de p53, ce qui démontre que SOCS1 est impliquée dans l’activation de p53 in vivo. Cette thèse a également pour but de mettre en évidence l’implication de SOCS1 dans l’activation d’autres facteurs de transcription et, par le fait même, de démontrer qu’elle peut agir comme un régulateur plus général de la transcription. Une étude approfondie de l’interaction entre SOCS1 et p53 a permis de démontrer que le domaine de transactivation II de p53 (acides aminés 36-67) est suffisant pour l’interaction. Plus précisément, il semble que le tryptophane 53 (W53) et la phénylalanine 54 (F54) sont les principaux résidus impliqués. Une analyse structurale de ce domaine de p53 a conduit à l’identification d’un motif conservé dans plusieurs autres facteurs de transcription pourvus d’un domaine de transactivation acide, dont p63, p73 et E2F1. En accord avec ces résultats, SOCS1 est en mesure d’interagir avec chacune des deux protéines. Ainsi, la capacité de SOCS1 d’interagir et de réguler l’activité de p53 peut s’étendre à d’autres facteurs de transcription. En terminant, le mécanisme présenté dans cette thèse contribue à la compréhension de la régulation de p53, le principal suppresseur de tumeur de la cellule. De plus, il met en évidence une nouvelle fonction de SOCS1, laquelle était jusqu’alors essentiellement connue pour inhiber la voie de signalisation JAK/STAT. Ce nouveau rôle pour SOCS1 permet d’expliquer de quelle manière une activation aberrante de la signalisation par les cytokines peut déclencher la sénescence ou l’apoptose. Enfin, le fait que SOCS1 puisse réguler différents facteurs de transcription permet de la qualifier de régulateur général des facteurs de transcription composés d’un domaine de transactivation acide. / In response to different stress, three anti-proliferative mechanisms, namely apoptosis, also called programmed cell death, transient growth arrest and senescence, prevent the cells from cumulating mutations that can lead to uncontrolled proliferation and, eventually, to tumor development. Regulation of these mechanisms requires the activation of proteins called tumor suppressors. One of them, p53, is a transcription factor whose stabilization and activation lead to an increase in expression of genes directly implicated in cell cycle arrest. In the past years, studies about p53 showed how much its function is complex and with how many signaling pathways and proteins it cooperates to maintain genome integrity. Thus, studying the activation mechanisms of p53 is essential to understand its regulation and, thereby, to prevent tumor development and to elaborate new strategies for cancer treatment. The first aim of this thesis is to show a new activation mechanism of p53 and of senescence by the protein SOCS1, a suppressor of cytokine signaling. This mechanism implies a direct interaction between the two proteins, specifically between the SH2 domain of SOCS1 and the N-terminal transactivation domain of p53. SOCS1 also interacts with the DNA damage-regulated kinases ATM and ATR via its C-terminal domain, which contains a SOCS Box, to facilitate the phosphorylation of p53 on its serine 15. Thus, by interacting at the same time with p53 and ATM, SOCS1 contributes to stabilization and activation of p53. In accordance with this model, SOCS1 inhibition in human normal fibroblasts decreases the number of senescent cells in which the activated oncogene STAT5A is expressed and reduces p53 nuclear accumulation in these cells. In the same way, T cells from Socs1-/-Ifnγ-/- mice are less likely to undergo apoptosis than T cells from Socs1+/+Ifnγ+/+ mice, after exposure to γ radiation. In both contexts, the expression of p53 target genes is decreased, which indicates that SOCS1 is implicated in p53 activation in vivo. This thesis also aims to show the role of SOCS1 in the activation of other transcription factors and, thereby, to show that it can act as a more general regulator of transcription. A detailed study of the interaction between SOCS1 and p53 showed that the transactivation domain II of p53 (amino acids 36-67) is sufficient for the interaction. Specifically, it seems that tryptophan 53 (W53) and phenylalanine 54 (F54) are essential for the interaction. A structural analysis of this p53 region highlights an acid transactivation domain actually conserved in many others transcription factors, such as p63, p73 and E2F1. In accordance with this observation, SOCS1 is able to interact with both proteins. Thus, the capacity of SOCS1 to interact with p53 and to regulate its activity may extend to other transcription factors. The mechanism showed in this thesis contributes to the understanding of p53 regulation and highlights a new function for the SOCS1 protein. Indeed, until now, SOCS1 was mostly known to be a negative regulator of the JAK/STAT pathway. Moreover, this new role for SOCS1 explains how an aberrant cytokine signaling can trigger senescence or apoptosis. Finally, the fact that SOCS1 can regulate different transcription factors allows us to consider it as a general regulator of transcription factors containing an acid transactivation domain.

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité, la conformation ou la localisation d’une protéine et régulant divers processus. Les kinases et phosphatases sont responsables de la dynamique de phosphorylation et agissent de manière coordonnée. L’activation anormale ou la dérégulation de kinases peuvent conduire au développement de cancers ou de désordres métaboliques. Les récepteurs tyrosine kinase (RTKs) sont souvent impliqués dans des maladies et la compréhension des mécanismes régissant leur régulation permet de déterminer les effets anticipés sur leurs substrats. Dans ce contexte, le but de cette thèse est d’identifier les évènements de phosphorylation intervenant dans la voie de l’insuline chez la drosophile impliquant un RTK : le récepteur de l’insuline (InR). La cascade de phosphorylation déclenchée suite à l’activation du récepteur est conservée chez le mammifère. Afin d’étudier le phosphoprotéome de cellules S2 de drosophile, nous avons utilisé une étape d’enrichissement de phosphopeptides sur dioxyde de titane suivie de leur séparation par chromatographie liquide (LC) et mobilité ionique (FAIMS). Les phosphopeptides sont analysés par spectrométrie de masse en tandem à haute résolution. Nous avons d’abord démontré les bénéfices de l’utilisation du FAIMS comparativement à une étude conventionnelle en rapportant une augmentation de 50 % dans le nombre de phosphopeptides identifiés avec FAIMS. Cette technique permet de séparer des phosphoisomères difficilement distinguables par LC et l’acquisition de spectres MS/MS distincts où la localisation précise du phosphate est déterminée. Nous avons appliqué cette approche pour l’étude des phosphoprotéomes de cellules S2 contrôles ou traitées à l’insuline et avons identifié 32 phosphopeptides (sur 2 660 quantifiés) pour lesquels la phosphorylation est modulée. Étonnamment, 50 % des cibles régulées possèdent un site consensus pour la kinase CK2. Une stratégie d’inhibition par RNAi a été implémentée afin d’investiguer le rôle de CK2 dans la voie de l’insuline. Nous avons identifié 6 phosphoprotéines (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 et mu2) positivement régulées suite à l’insuline et négativement modulées après le traitement par RNAi CK2. Par essai kinase in vitro, nous avons identifié 29 cibles directes de CK2 dont 15 corrélaient avec les résultats obtenus par RNAi. Nous avons démontré que la phosphorylation de su(var)205 (S15) était modulée par l’insuline en plus d’être une cible directe de CK2 suite à l’expérience RNAi et à l’essai kinase. L’analyse des données phosphoprotéomiques a mis en évidence des phosphopeptides isomériques dont certains étaient séparables par FAIMS. Nous avons déterminé leur fréquence lors d’études à grande échelle grâce à deux algorithmes. Le script basé sur les différences de temps de rétention entre isomères a identifié 64 phosphoisomères séparés par LC chez la souris et le rat (moins de 1 % des peptides identifiés). Chez la drosophile, 117 ont été répertoriés en combinaison avec une approche ciblée impliquant des listes d’inclusion. Le second algorithme basé sur la présence d’ions caractéristiques suite à la fragmentation de formes qui co-éluent a rapporté 23 paires isomériques. L’importance de pouvoir distinguer des phosphoisomères est capitale dans le but d’associer une fonction biologique à un site de phosphorylation précis qui doit être identifié avec confiance. / Phosphorylation is a reversible post-translational modification that modulates protein activity, and can impart conformational changes and affect translocation of their protein substrates. Kinases and phosphatases are responsible for the dynamic of changes in protein phosphorylation and act in a coordinated manner. Abnormal activation or misregulation of kinase activity can lead to the development of cancers and metabolic disorders. Tyrosine kinase receptor (RTK) associated signaling pathways are often implicated in numerous diseases and the further understanding of mechanisms affecting their regulation is necessary to determine their activity and effects anticipated on their substrates. In this context, the primary objective of this thesis is to study the phosphorylation events arising from the activation of the insulin receptor (InR) following stimulation of drosophila S2 cells with insulin. The phosphorylation cascade triggered after InR activation is conserved in mammals. In order to study the phosphoproteome of drosophila S2 cells, we enriched phosphopeptides on titanium dioxide (TiO2) stationary phase prior to their separation by liquid chromatography (LC) and ion mobility (FAIMS) mass spectrometry (MS). Phosphopeptides were then analysed by tandem MS at high resolution. We first compared the benefits of FAIMS to conventional LC-MS, and observed a 50% increase in the number of identified phosphopeptides when using ion mobility. FAIMS enables the separation of phosphoisomers that are typically unresolved by LC, enabling high confidence assignment of modification sites via distinct MS/MS spectra. This approach was used to profile phosphorylation changes taking place between control and insulin-treated drosophila cells and enabled the identification of 32 phosphopeptides (out of 2 660 quantified) showing differential regulation. Interestingly, 50% of the regulated targets have a CK2 consensus site. These preliminary experiments were followed-up by RNAi mediated inhibition of CK2 and revealed that 6 phosphoproteins (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 and mu2) were positively modulated after insulin stimulation and negatively regulated after CK2 RNAi treatment. Using in vitro kinase assay, we identified 29 direct CK2 targets, of which 15 were correlated with results from the CK2 RNAi experiment. We demonstrated specifically that the su(var)205 (S15) is regulated by insulin and is a direct CK2 target based on RNAi and kinase assays. Our phosphoproteomics data also highlighted the presence of isomeric phosphopeptides, several of which could be distinguished using FAIMS. We developed two algorithms to determine the occurrence of phosphoisomers in large scale studies. The first algorithm based on differences in retention times between isomers identified 64 candidates in mouse and rat phosphoproteome datasets corresponding to less than 1% of all identified phosphopeptides. We also identified 117 isomer candidates in drosophila using a targeted LC-MS/MS approach with inclusion lists. The second algorithm is based on the presence of characteristic fragment ions present in MS/MS spectra of co-eluting or partially resolved species and allowed the identification of 23 isomeric pairs. The ability to distinguish phosphoisomers in large-scale phosphoproteome datasets is of significance to correlate phosphorylation events taking place on specific residues with biological activities.

Il existe un lien étroit entre la structure tridimensionnelle et la fonction cellulaire de l’ARN. Il est donc essentiel d’effectuer des études structurales de molécules d’ARN telles que les riborégulateurs afin de mieux caractériser leurs mécanismes d’action. Une technique de choix, permettant d’obtenir de l’information structurale sur les molécules d’ARN est la spectroscopie RMN. Cette technique est toutefois limitée par deux difficultés majeures. Premièrement, la préparation d’une quantité d’ARN nécessaire à ce type d’étude est un processus long et ardu. Afin de résoudre ce problème, notre laboratoire a développé une technique rapide de purification des ARN par affinité, utilisant une étiquette ARiBo. La deuxième difficulté provient du grand recouvrement des signaux présents sur les spectres RMN de molécules d’ARN. Ce recouvrement est proportionnel à la taille de la molécule étudiée, rendant la détermination de structures d’ARN de plus de 15 kDa extrêmement complexe. La solution émergeante à ce problème est le marquage isotopique spécifique des ARN. Cependant, les protocoles élaborées jusqu’à maintenant sont très coûteux, requièrent plusieurs semaines de manipulation en laboratoire et procurent de faibles rendements. Ce mémoire présente une nouvelle stratégie de marquage isotopique spécifique d’ARN fonctionnels basée sur la purification par affinité ARiBo. Cette approche comprend la séparation et la purification de nucléotides marqués, une ligation enzymatique sur support solide, ainsi que la purification d’ARN par affinité sans restriction de séquence. La nouvelle stratégie développée permet un marquage isotopique rapide et efficace d’ARN fonctionnels et devrait faciliter la détermination de structures d’ARN de grandes tailles par spectroscopie RMN. / The tridimensional structure of a given RNA molecule is closely linked to its cellular function. For this reason, it is crucial to study the structure of RNA molecules, such as riboswitches, to characterize their mechanism of action. To do so, NMR spectroscopy is often used to gather structural data on RNA molecules in solution. However, this approach is limited by two main difficulties. First, the production of preparative quantities of natively folded and purified RNA molecules is a long and tedious process. To facilitate this step, our laboratory has developed an RNA-affinity purification method using an ARiBo tag. The second limiting step comes from the extensive signal overlap detected on NMR spectra of large RNA molecules. This overlap is proportional to the length of the RNA, which often prevents high-resolution structure determination of RNAs larger than 15 kDa. To solve this problem, specific isotopic labeling of RNAs can now be achieved. However, existing labeling protocols are expensive, require several weeks of laboratory manipulations and usually provide relatively low yields. This thesis provides an alternative strategy to achieve specific isotopic labeling of RNA molecules, based on the ARiBo tag affinity purification technique. The protocol includes the separation and the purification of isotopically labeled nucleotides, an enzymatic ligation step performed on a solid support and the affinity purification of the RNA of interest, without any sequence restriction. This new strategy is a fast and efficient way to label functional RNAs isotopically and should facilitate NMR structure determination of large RNAs.

La régulation de l’expression des gènes est ce qui permet à nos cellules de s’adapter à leur environnement, de combattre les infections ou, plus généralement, de produire la quantité exacte de protéine nécessaire pour répondre à un besoin spécifique. Parmi les joueurs les plus importants dans cette régulation de l’expression des gènes on retrouve les microARN (miARN). Ces petits ARN de 22 nucléotides sont présents chez la majorité des espèces multicellulaires et sont responsables du contrôle direct de plus de 30% des gènes exprimant des protéines chez les vertébrés. La famille de miARN lethal-7 (let-7) est composée de miARN parmi les plus connus et ayant des fonctions cruciales pour la cellule. La régulation du niveau des miARN let-7 est essentielle au bon développement cellulaire. La biogenèse de ces miARN, du transcrit primaire jusqu’à leur forme mature, est régulée principalement par Lin28, une protéine pluripotente très conservée. Cette protéine est composée d’un domaine cold shock (CSD) et de deux domaines de liaison au zinc. C’est grâce à ces domaines de liaison à l’ARN que Lin28 peut lier et inhiber la maturation des miARN let-7. L’objectif de cette thèse est de caractériser l’interaction entre Lin28 et le microARN précurseur let-7g afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans l’inhibition de la biogenèse du miARN. À l’aide de techniques biochimiques et biophysiques, nous avons d’abord défini les principaux déterminants de l’interaction entre Lin28 et la boucle terminale du miARN précurseur let-7g (TL-let-7g). Nous avons conclu que le domaine C-terminal de Lin28, composé d’un motif riche en lysines et arginines ainsi que de deux motifs de liaison au zinc, permet à la protéine de lier spécifiquement et avec haute affinité un renflement riche en guanine conservé chez les précurseurs de la famille let-7. Aussi, parce que la séquence et la spécificité de liaison à l’ARN de ce domaine C-terminal sont semblables à celles de la protéine NCp7 du VIH, nous avons défini ce dernier comme le domaine NCp7-like de Lin28. Par la suite, nous avons caractérisé la multimérisation de trois protéines Lin28 sur la boucle terminale de pre-let-7g. Ceci a permis de réconcilier d’apparentes contradictions retrouvées dans la littérature actuelle concernant les sites de liaison de Lin28 lors de sa liaison aux miARN précurseurs. Nous avons identifié trois sites de liaison à haute affinité sur TL-let-7g qui sont liés dans un ordre précis par trois protéines Lin28. Lors de la formation du complexe multimérique, le CSD permet une déstabilisation de l’ARN, ce qui rend accessible plusieurs sites de liaison. Le domaine NCp7-like permet plutôt un assemblage ordonné de la protéine et facilite la liaison initiale de cette dernière. Ces nouveaux résultats rendent possible la mise au point d’un nouveau modèle de l’interaction entre Lin28 et le miARN précurseur let-7g. En conclusion, les études réalisées dans cette thèse apportent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle d’une importante famille de miARN et permettront de guider les futures études dans le domaine de recherche en pleine effervescence qu’est celui de la biogenèse des miARN. / The regulation of gene expression is what allows our cells to adapt to their environment, to fight infections or, more generally, to express the appropriate level of proteins to meet a specific need. The microRNAs (miRNAs) are among the most important players in the regulation of gene expression. These small RNAs of 22 nucleotides are present in most multicellular species and are responsible for the direct control of more than 30% of protein-expressing genes in vertebrates. The miRNA lethal-7 (let-7) family consist of some of the most studied miRNAs and plays crucial roles in the cell. The appropriate regulation of the let-7 miRNAs level is essential for proper cellular development. The biogenesis of these miRNAs, from the primary transcript to their mature form is mainly regulated by Lin28, a highly-conserved pluripotent protein. This protein is composed of a cold shock domain (CSD) and two zinc-binding domains. These RNA-binding domains allow Lin28 to bind and inhibit the maturation of the let-7 miRNA. The objective of this thesis is to characterize the interaction between the Lin28 protein and the let-7g miRNA precursor to better understand the role of this protein in the inhibition of miARN biogenesis. Using biochemical and biophysical techniques, we first identified the main determinants of the interaction between Lin28 and the terminal loop of the precursor miRNA let-7g (TL-let-7g). We concluded that the C-terminal domain of Lin28, composed of a lysine-rich and arginine-rich motif in addition to two zinc-binding motifs, is sufficient to bind with high affinity a conserved guanine-rich bulge located on the TL-let-7g. In addition, because the sequence and RNA-binding specificity of this C-terminal domain are similar to those of the HIV protein NCp7, we defined this region as the NCp7-like domain of Lin28. Subsequently, we characterized the multimerization of three Lin28 proteins on the terminal loop of pre-let-7g. This study helped to reconcile apparent contradictions found in the current literature regarding the Lin28-binding sites on miRNA precursors. We identified three high-affinity binding sites on TL-let-7g that are bound in a stepwise manner by the three Lin28 proteins. As part of the formation of the multimeric complex, both RNA-binding domains of Lin28 play an important role. The CSD destabilizes the RNA and this exposes several binding sites, whereas the NCp7-like domain allows an orderly protein assembly and facilitates the initial binding of the protein. These results lead us to propose a new model for the interaction between Lin28 and pre-let-7g. In conclusion, these studies provide a better understanding of the molecular mechanisms involved in the post-transcriptional regulation of an important family of miRNAs and will help guide future projects in the expanding research area of miRNA biogenesis.

La scoliose est la déformation de la colonne vertébrale la plus répandue. Elle atteint 3 à 4% de la population pédiatrique et dans 85% des cas, aucune cause n’a été identifiée. Ces cas sont appelés idiopathiques et les symptômes apparaissent durant la puberté; d’où le terme de ‘scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA). Cette pathologie atteint le plus souvent les jeunes filles, en nombre et en sévérité. Ces dernières années, plusieurs hypothèses ont été proposées afin d’élucider l’étiologie de cette pathologie. Celles-ci ont mis de l’avant différents facteurs génétiques, biochimiques, mécaniques, neurologiques, musculaires ou hormonaux. Plusieurs études ont rapporté des formes familiales de scoliose, soutenant la thèse d’une prédisposition génétique. Nous avons démontré que les patients souffrant de SIA présentent un défaut de signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi et un taux élevé d’ostéopontine (OPN) circulante. En utilisant une approche de type ‘gène candidat’, nous avons montré que la protéine tyrosine phosphatase μ (PTPμ) régule l’activité du complexe d’intégrines α5/β1 (récepteur de l’OPN) via la protéine kinase PIPKIγ. Dans ce but, nous avons utilisé des cultures primaires d’ostéoblastes issues de biopsies de patients et de cas traumatiques comme sujets contrôles. Les biopsies osseuses de patients ont été obtenues lors de l’intervention chirurgicale à partir des vertèbres T3 à L4, selon les différentes procédures. Les biopsies issues de cas traumatiques proviennent d’autres types d’os (tibia, crête iliaque, fémur). Les profils d’expression du gène PTPRM (codant pour la protéine PTPμ) ont été étudiés par PCR quantitative (qPCR). Les taux de protéines PTPμ ont été analysés par immunoprécipitation suivi d’un western blot. Pour évaluer le rôle de cette protéine, nous avons bénéficié d’un modèle murin. Machida et al. ont démontré qu’il existe un taux plus élevé de scoliose parmi les souris C57Bl/6 bipèdes obtenues suite à l’amputation des membres supérieurs, sous anesthésie, cinq semaines après la naissance. Nous avons utilisé des cultures primaires d’ostéoblastes issues de la colonne ii vertébrale de souris C57Bl/6 bipèdes, délétées du gène PTPRM (souris dites ‘KO’), afin d’évaluer le niveau de signalisation cellulaire spécifique des protéines Gi par un test fonctionnel: la technique de spectroscopie cellulaire di-électrique (SCD). Selon nos données, 85% des souris bipédales ‘KO’ pour le géne PTPRM développent une scoliose (modérée à sévère) contre 55% des souris contrôles C57Bl6 bipèdes. De plus, les niveaux de PTPμ exprimée par les ostéoblastes de 34 patients SIA se trouvent diminués par comparaison à 17 sujets contrôles. Nos études de souris bipèdes ont montré que l’inactivation du gène PTPRM augmente l’incidence et la sévérité de la scoliose, sans pour autant affecter les taux circulant d’OPN ou l’expression de ses récepteurs. Par ailleurs, dans ce même contexte, nous avons remarqué une augmentation de l’interaction entre l’OPN et l’intégrine β1 en l’absence du gène PTPRM. Les cellules issues de ces souris bipèdes KO montrent une réduction dans leurs niveaux de signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi après stimulation par l’OPN. Cette diminution est en grande partie récupérée après traitement des cellules par un siRNA spécifique de la protéine PIPK1γ, substrat de PTPμ qui favorise la fixation de ligands aux intégrines. Ces études apportent les premières indications que la perte d’expression de PTPμ est impliquée dans le développement de la SIA, en amplifiant probablement l’effet inhibiteur de l’OPN sur la signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi. Ces études permettent une meilleure compréhension de l’étiologie de la SIA. Elles pourraient avoir une contribution importante dans le développement futur de méthodes diagnostique et thérapeuthique dans le but d'arrete l’apparition et l’évolution de la maladie chez les enfants atteints. / Adolescent idiopathic scoliosis (AIS) is the most common form of scoliosis that affects 3-4% of the global pediatric population. In more than 85% of cases, no specific cause can be identified. Such cases are called idiopathic and occur mostly during adolescence. AIS affects mainly females in number and severity. Over the past years, many hypotheses were proposed to explain the etiology of AIS, including genetic, biochemical, mechanics, neurological, muscular and hormonal factors. Several studies have reported a high incidence of scoliosis in some families, which argues for a genetic cause of this disease. We demonstrated that AIS patients have a Gi protein signaling defect and exhibit high levels of circulating Osteopontin (OPN). The goal of this thesis is to identify the mechanisms regulating OPN signaling activity in AIS patients. We have used a candidate gene driven approach and discovered that protein tyrosine phosphatase μ (PTP μ) regulates α5β1 integrin (a known OPN receptor) through phosphate kinase type 1 gamma (PIPK1γ). To achieve our goal, we have used primary osteoblast cell cultures derived from AIS patients and biopsies from control subjects. Bone specimens were obtained intraoperatively from vertebras (varying from T3 to L4 according to the surgical procedure performed) while with trauma cases used as non-scoliotic controls, bone specimens were obtained from other anatomical sites (tibia, femur or iliac crest). Expression profiles of the RPTPM gene (encoding for PTPμ) were studied by qPCR. On the other hand, PTPμ protein levels were determined by immunoprecipitation followed by western blot. To evaluate the role of this protein in AIS etiopathogenesis, we took advantage of an animal model exhibiting a higher scoliosis incidence when maintained in a bipedal state. [1], [2] Bipedal surgeries were performed on C57Bl/6 mice after weaning (5-weeks after birth) by amputation of the forelimbs and tail under anesthesia as reported by Oyama et al. (2006). [1] We used the same approach with PTPμ knockout mice and primary osteoblast culture were derived from the spine of these mice to assess Gi protein signaling through a functional assay termed Cellular Dielectric Spectroscopy (CDS). Bipedal PTPμ knockout mice develop scoliosis more often (85%) in number and severity, than control C57Bl/6 bipedal mice (55%). Interestingly, functional analysis of osteoblasts derived from PTPμ KO mice by CDS method showed a flaw in the transmission of Gi protein coupled receptor signaling similar to a specific AIS patient subgroup. Furthermore, the clinical relevance of PTPμ was strengthened by the fact that a decrease in the gene expression level of PTPμ was observed in 34 AIS patients when compared to 17 control subjects. Such a decrease was also confirmed at the protein level. We demonstrated that genetic deletion of PTPμ enhances the incidence and severity of scoliosis without affecting plasma levels of OPN or the expression of its receptors. In contrast, increased interaction of OPN with β1 integrin was noticed in cells depleted of PTPμ. Furthermore, reduction of Gi- protein coupled receptor GiPCR signaling by OPN was also enhanced in these cells, while their response to GiPCR stimulation was improved with siRNA of phosphatidylinositol-phosphate kinase type 1 gamma (PIPK1γ), a PTPμ substrate that favours ligand binding to integrins. These studies provide the first indication that the loss of PTPμ influences the nature of idiopathic scoliosis, possibly by amplifying the inhibitory effect of OPN on GiPCR signaling. This study allows a better understanding of AIS etiology and could have an impact for the future development of innovative diagnostic methods and eventual pharmacological approaches in order to prevent AIS and stop its progression in affected children.

Le tri et le transport efficace des hydrolases acides vers le lysosome jouent un rôle critique pour la fonction des cellules. Plus de 50 maladies humaines sont dues à des mutations des enzymes lysosomales, des protéines régulant des processus-clés du transport vers le lysosome ou des enzymes effectuant des modifications posttraductionnelles importantes pour la fonction du lysosome. L’objectif de cette thèse est d’identifier des protéines et des mécanismes permettant à la cellule de réguler le transport des enzymes vers le lysosome. Nous avons formulé l’hypothèse que des protéines mutées dans des maladies lysosomales et dont les fonctions étaient inconnues pouvaient jouer un rôle dans le transport vers le lysosome. Les céroïdes-lipofuscinoses neuronales forment une famille de maladies lysosomales rares mais sont aussi les maladies neurodégénératives infantiles les plus fréquentes. Plusieurs gènes impliqués dans les NCL encodent des protéines aux fonctions inconnues. Les travaux présentés dans cette thèse ont identifié la protéine « ceroid lipofuscinosis neuronal-5 » (CLN5) qui est localisée à l’endosome et au lysosome comme élément nécessaire au recrutement et à l’activation de rab7. Rab7 est une protéine Rab-clé qui contrôle le trafic à l’endosome tardif. Cette petite GTPase est impliquée dans le recrutement de retromer, un complexe protéique qui régule le trafic de l’endosome vers l’appareil de Golgi des récepteurs de tri lysosomal comme sortilin et le récepteur du mannose-6-phosphate. Dans les cellules où CLN5 est déplété, les récepteurs de tri lysosomal sont moins recyclés plus rapidement dégradés. En utilisant des expériences de photomarquage nous avons aussi pu démontrer que Rab7 est moins activées en l’absence de CLN5. Pour exécuter leur fonction les protéines rabs doivent être recrutée à la membrane et activées par l’échange d’une molécule de GDP pour une molécule de GTP. Le recrutement des Rabs à la membrane nécessite une modification posttraductionnelle lipidique pour être facilités. En utilisant un modèle de levures nous avons démontré que l’homologue de Rab7, Ypt7 est palmitoylée. Nous avons aussi démontré que la palmitoyltransférase Swif1 est nécessaire au recrutement de Ypt7 à la membrane. Nous avons aussi remarqué que les sous- unités de retromer chez la levure sont moins recrutées lorsque les palmitoyltransférases sont déplétées. Dans les cellules de mammifères nous avons démontré que Rab7 est également palmitoylé et que cette palmitoylation est possiblement effectuée par les palmitoyltransférases DHHC1 et DHHC8. La palmitoylation de Rab7 a lieu sur les cystéines en C-terminal qui sont nécessaires au recrutement membranaire et qui auparavant étaient uniquement décrites comme prénylées. En utilisant la méthode de « click chemistry » nous avons découvert que lorsque la prénylation de Rab7 est bloquée le niveau de palmitoylation augmente. Pour caractériser l’interaction entre CLN5 et Rab7 nous avons performé des expériences afin d’établir définitivement la topologie de cette protéine. Nous avons ainsi démontré que CLN5 est une protéine hautement glycosylée qui est initialement traduite en protéine transmembranaire et subséquemment clivée par un membre de la famille des peptidase de peptide signal (SPP). Cette protéine soluble peut alors possiblement interagir avec CLN3 qui est aussi palmitoylée pour recruter et activer Rab7. Nos études suggèrent pour la première fois que CLN5 pourrait être un recruteur et un activateur de Rab7 qui agirait avec la protéine CLN3 pour séquestrer Rab7 avec les autres récepteurs palmitoylés et permettre leur recyclage vers l’appareil de Golgi. / The proper sorting and trafficking of acid hydrolases plays a critical role in the normal function of cells. Over 50 known human diseases are caused by mutations of lysosomal enzymes, of proteins that regulate key processes of transport to the lysosome or of enzymes that perform posttranslational modifications which are important for the function of the lysosome. The main objective of this thesis is to identify proteins and mechanisms that allow the cell to regulate the transport of enzymes toward the lysosome. We formulated the hypothesis that proteins mutated in lysosomal diseases and that have no known functions could play a role in transport toward the lysosome. Neuronal ceroid-lipofuscinoses form a family of lysosomal storage disorders that are very rare but are also the most frequent infantile neurodegenerative diseases. The work presented in this thesis identified ceroid-lipofuscinosis neuronal-5 (CLN5), which is located at the late-endosomal/lysosomal compartment as a necessary element for the recruitment and activation of Rab7. Rab7 is an important GTPase that controls traffic from the late-endosome to the trans-Golgi network. Rab7 has been implicated in the recruitment of the retromer complex, which regulates retrograde transport of the lysosomal sorting receptor such as sortilin and the mannose-6-phosphate receptor. In the cells where CLN5 is depleted, the lysosomal sorting receptors are less recycled and degraded more rapidly. Using photolabelling assays we were also able to show that Rab7 is less activated in the absence of CLN5. To perform their function, Rab proteins have to be recruited to membranes and activated by the exchange of a GDP nucleotide for GTP. The recruitment of Rabs to membranes necessitates a lipidic posttranslational modification to raise the affinity. Using yeast as a model we demonstrated that the Rab7 homolog, Ypt7 is palmitoylated. We have also showed that the yeast palmitoyltransferase Swif1 is required for Ypt7 membrane recruitment. We have also observed that retromer subunits in yeast are less recruited when palmitoyltranferases are depleted. In mammals we have shown that Rab7 is also palmitoylated and that this palmitoylation may be done by palmitoyltransferases DHHC1 and DHHC8. The palmitoylation of Rab7 occurs on the C-terminal cysteines that are required for membrane recruitment and were previously only shown to be prenylated. By using Click chemistry we have discovered that when Rab7 prenylation is blocked the level of palmitoylation is augmented. To characterize the interaction of Rab7 and CLN5 we performed experiments to definitively establish the topology of this latter protein. Our results show that CLN5 is a heavily glycosylated protein that is initially translated as a type II transmembrane protein and subsequently cleaved by a member of the signal-peptide peptidase (SPP) family. This protein can then possibly interact with another member of the CLN family, CLN3 that is predicted to be palmitoylated to recruit and activate Rab7. Our studies establish for the first time that CLN5 is required for the recruitment and activation of Rab7 and may cooperate with the possibly palmitoylated protein CLN3 to sequester Rab7 in specific membrane domains with sorting receptors to allow their recycling toward the trans-Golgi network.

La possibilité de programmer une cellule dans le but de produire une protéine d’intérêt est apparue au début des années 1970 avec l’essor du génie génétique. Environ dix années plus tard, l’insuline issue de la plateforme de production microbienne Escherichia coli, fut la première protéine recombinante (r-protéine) humaine commercialisée. Les défis associés à la production de r-protéines plus complexes et glycosylées ont amené l’industrie biopharmaceutique à développer des systèmes d’expression en cellules de mammifères. Ces derniers permettent d’obtenir des protéines humaines correctement repliées et de ce fait, biologiquement actives. Afin de transférer le gène d’intérêt dans les cellules de mammifères, le polyéthylènimine (PEI) est certainement un des vecteurs synthétiques le plus utilisé en raison de son efficacité, mais aussi sa simplicité d’élaboration, son faible coût et sa stabilité en solution qui facilite son utilisation. Il est donc largement employé dans le contexte de la production de r-protéines à grande échelle et fait l’objet d’intenses recherches dans le domaine de la thérapie génique non virale. Le PEI est capable de condenser efficacement l’ADN plasmidique (vecteur d’expression contenant le gène d’intérêt) pour former des complexes de petites tailles appelés polyplexes. Ces derniers doivent contourner plusieurs étapes limitantes afin de délivrer le gène d’intérêt au noyau de la cellule hôte. Dans les conditions optimales du transfert de gène par le PEI, les polyplexes arborent une charge positive nette interagissant de manière électrostatique avec les protéoglycanes à héparane sulfate (HSPG) qui décorent la surface cellulaire. On observe deux familles d’HSPG exprimés en abondance à la surface des cellules de mammifères : les syndécanes (4 membres, SDC1-4) et les glypicanes (6 membres, GPC1-6). Si l’implication des HSPG dans l’attachement cellulaire des polyplexes est aujourd’hui largement acceptée, leur rôle individuel vis-à-vis de cet attachement et des étapes subséquentes du transfert de gène reste à confirmer. Après avoir optimisées les conditions de transfection des cellules de mammifères CHO et HEK293 dans le but de produire des r-protéines secrétées, nous avons entrepris des cinétiques de capture, d’internalisation des polyplexes et aussi d’expression du transgène afin de mieux comprendre le processus de transfert de gène. Nous avons pu observer des différences au niveau de ces paramètres de transfection dépendamment du système d’expression et des caractéristiques structurelles du PEI utilisé. Ces résultats présentés sous forme d’articles scientifiques constituent une base solide de l’enchaînement dans le temps des évènements essentiels à une transfection efficace des cellules CHO et HEK293 par le PEI. Chaque type cellulaire possède un profil d’expression des HSPG qui lui est propre, ces derniers étant plus ou moins permissifs au transfert de gène. En effet, une étude menée dans notre laboratoire montre que les SDC1 et SDC2 ont des rôles opposés vis-à-vis du transfert de gène. Alors que tous deux sont capables de lier les polyplexes, l’expression de SDC1 permet leur internalisation contrairement à l’expression de SDC2 qui l’inhibe. De plus, lorsque le SDC1 est exprimé à la surface des cellules HEK293, l’efficacité de transfection est augmentée de douze pourcents. En utilisant la capacité de SDC1 à induire l’internalisation des polyplexes, nous avons étudié le trafic intracellulaire des complexes SDC1 / polyplexes dans les cellules HEK293. De plus, nos observations suggèrent une nouvelle voie par laquelle les polyplexes pourraient atteindre efficacement le noyau cellulaire. Dans le contexte du transfert de gène, les HSPG sont essentiellement étudiés dans leur globalité. S’il est vrai que le rôle des syndécanes dans ce contexte est le sujet de quelques études, celui des glypicanes est inexploré. Grâce à une série de traitements chimiques et enzymatiques visant une approche « perte de fonction », l’importance de la sulfatation comme modification post-traductionnelle, l’effet des chaînes d’héparanes sulfates mais aussi des glypicanes sur l’attachement, l’internalisation des polyplexes, et l’expression du transgène ont été étudiés dans les cellules CHO et HEK293. L’ensemble de nos observations indique clairement que le rôle des HSPG dans le transfert de gène devrait être investigué individuellement plutôt que collectivement. En effet, le rôle spécifique de chaque membre des HSPG sur la capture des polyplexes et leur permissivité à l’expression génique demeure encore inconnu. En exprimant de manière transitoire chaque membre des syndécanes et glypicanes à la surface des cellules CHO, nous avons déterminé leur effet inhibiteur ou activateur sur la capture des polyplexes sans pouvoir conclure quant à l’effet de cette surexpression sur l’efficacité de transfection. Par contre, lorsqu’ils sont présents dans le milieu de culture, le domaine extracellulaire des HSPG réduit l’efficacité de transfection des cellules CHO sans induire la dissociation des polyplexes. Curieusement, lorsque chaque HSPG est exprimé de manière stable dans les cellules CHO, seulement une légère modulation de l’expression du transgène a pu être observée. Ces travaux ont contribué à la compréhension des mécanismes d'action du vecteur polycationique polyéthylènimine et à préciser le rôle des protéoglycanes à héparane sulfate dans le transfert de gène des cellules CHO et HEK293. / With the aim to express a protein of interest, the transfer of exogenous genetic material into host cells was established in early 70s with the development of genetic engineering. Approximately ten years later, insulin was the first human recombinant protein (r-protein) produced at large scale in Escherichia coli and commercialized. Challenges associated with the production of more complex and glycosylated r-proteins brought the pharmaceutical industry to develop mammalian expression platforms. Thus, the expressed r-proteins are correctly folded and biologically actives. As a means to transfer genetic materials of interest into mammalian cells, the synthetic vector polyethylenimine (PEI) is probably the most popular due to its efficacy, ease of use, cost-effectiveness and stability in solution. Consequently, PEI is largely employed for the production of r-proteins by large scale and extensively studied in the context of non-viral gene therapy. PEI is capable to efficiently condense plasmid DNA (expression vector containing the gene of interest) to form small nanoparticles termed polyplexes. The latter must circumvent several steps to deliver the gene of interest to the cell nucleus. When formed at the optimum conditions, polyplexes exhibit a net positive charge which can interact electrostatically with negatively charged heparan sulfate proteoglycans (HSPG) located at the cell surface. There are two major families of HSPG that are largely expressed at the surface of mammalian cells: the syndecans (4 members, SDC1-4) and the glypicans (6 members, GPC1-6). Although it is generally accepted that HSPG are involved in the binding of polyplexes, their individual role toward polyplex binding and the subsequent phases of gene transfer need to be confirmed. Following optimization of the mammalian CHO and HEK293 cells transfection conditions, we undertook an in-depth study of polyplexes uptake, internalization kinetics, as well as transgene expression kinetics with the aim to better understand the mechanisms underlying gene transfer. We observed several contrasting differences between the two cell lines and the type of PEI used. Our results presented as a scientific article, establish strong basis of the gene transfer process over-time. Every cell type possesses its own expression profile of HSPG which can display individual potency toward gene transfer. Indeed, a preliminary study conducted in our laboratory showed that SDC1 and SDC2 have distinct features with regard to gene transfer. While both are capable to bind polyplexes at the cell surface, the expression of SDC1 enhances polyplexes internalization whereas the expression of SDC2 drastically inhibits it. Furthermore, when SDC1 is expressed at the surface of HEK293 cells, the transfection efficiency is increased by twelve percent compared to control cells. By using the ability of SDC1 to mediate efficient internalization of polyplexes, we have studied the intracellular traffic of SDC1 / polyplexes complexes. Our conclusions lead to new insights concerning the path by which polyplexes can mediate efficient transfection. In the context of gene transfer, HSPG have been essentially studied in their entirety. Although the role of syndecans is the subject of some studies, that of glypicans is unexplored. Thanks to a series of chemical and enzymatic treatments leading to « loss of functions », the importance of sulfation as post-translational modification, the effect of HS chains and of glypicans on the attachment, internalization of polyplexes as well as transgene expression were investigated in CHO and HEK293 cells. Taken together, our observations indicate clearly that the role of HSPG should be investigated individually instead of collectively. Consequently, the individual potency of each HSPG member regarding gene transfer remains to be defined. We demonstrated that, in fact, the transient expression of some HSPG in CHO cells have a beneficial effect on polyplexes uptake while others have a negative effect. Unfortunately, this method did not allow concluding about their effect on transfection efficacy. However, when present in the culture medium, the extracellular domain of HSPG decreases transfection efficacy of CHO cells without inducing polyplexes dissociation. Strangely, when each HSPG is stably expressed in CHO cells, only subtle modulations of the gene expression level were observed. This study contributed to a better understanding of the mechanisms underlying PEI mediated gene transfer in CHO and HEK293 cells and clarify the role of HSPG in gene transfer.