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La diversité végétale exceptionnelle des forêts tropicales a toujours suscité une part d’incompréhension chez les scientifiques qui tentent de comprendre les processus à l’origine de cette diversité, ainsi que les mécanismes expliquant les changements spatiaux de composition spécifique. Une des clés de ce dernier mystère résiderait dans l’influence de la différentiation des niches écologiques, mais aussi de la dispersion limitée des graines et d’événements stochastiques (purement aléatoires et non prévisibles). La niche d’une espèce contraint celle-ci à s’établir dans un habitat présentant des gammes de conditions bien délimitées en termes de propriétés du sol (disponibilité en nutriments et toxicité de certains éléments) et d’intensité lumineuse. Par exemple, certaines espèces sont plus tolérantes à l’ombrage (espèces « sciaphiles ») que d’autres qui ne peuvent s’établir que dans des trouées forestières offrant suffisamment de lumière (espèces « héliophiles »). En Afrique centrale, les communautés d’arbres sont aujourd’hui en grande partie composées de ces espèces dites « héliophiles », alors que les ouvertures forestières naturelles sont rares. Il est fortement suspecté que la dominance de ces espèces soient la conséquence de trouées générées par l’homme qui, jusqu’au début de la période coloniale (vers 1900), occupait de vastes surfaces de forêt où il pratiquait l’agriculture sur brûlis. Cependant, peu d’études ont jusqu’à présent déterminé dans quelle mesure ces pratiques agricoles ont influencé la composition spécifique des forêts à l’échelle régionale comme à l’échelle locale.<p>L’objectif du présent travail est de faire la lumière sur l’impact de ces perturbations humaines mais aussi plus généralement sur l’influence relative de la niche écologique des espèces d’arbres par rapport à d’autres facteurs (dispersion limitée et facteurs stochastiques) sur leur distribution spatiale. Pour cela nous avons utilisé des données botaniques et environnementales provenant d’inventaires réalisés dans une forêt tropicale située en République Démocratique du Congo (quatre transects parallèles mesurant chacun 500 à 600 m de long), ainsi que des données similaires complémentées d’inventaires anthracologiques (estimation de la quantité de charbons de bois dans le sol, utilisée comme indicateur de feux passés d’origine anthropique) récoltées dans trois régions du sud du Cameroun (208 parcelles de 0,2 ha chacune). <p>Les données récoltées nous ont permis de mettre en évidence un impact significatif des propriétés physico-chimiques du sol sur la composition en espèces d’arbres. Plus précisément, nous avons pu constater une différence floristique marquée entre deux habitats très contrastés (sol sableux vs. sol argileux, Rép. Dém. Du Congo), et cela à une échelle spatiale locale (< 1 km²) où l’on pensait que de l’influence des facteurs stochastiques et de dispersion limitée étaient prépondérante. Mes analyses ont également démontré que cette différence était plus marquée pour les arbres de la canopée que pour les arbres des strates inférieures (« sous-canopée »), ce qui est sans doute lié au fait que de nombreux individus de la sous-canopée sont composés de juvéniles régénérant la canopée, parmi lesquels de nombreux arbres subissent une exclusion compétitive en cours (brouillant ainsi les signaux d’association espèce-habitat). <p>À une échelle spatiale beaucoup plus large cette fois (de 5 à 100 km, inventaires du Sud Cameroun), nous avons démontré que la diversité floristique était également influencée de manière significative par l’hétérogénéité spatiale de propriétés abiotiques du sol, notamment par les concentrations en (i) certains nutriments essentiels pouvant présenter des valeurs potentiellement limitantes (K, Mg, Ca et P) ainsi qu’en en (ii) élements pouvant être présents en quantités toxiques (Al et Mn). Cependant, alors que le signal environmental a été clairement détecté à l’échelle communautaire, seule les abondances d’une minorité d’espèces (< 15%) ont répondu significativement à la variation des conditions de sol. En outre, le nombre de réponses significatives a augmenté avec l’échelle d’observation ainsi qu’avec le degré d’hétérogénéité environnementale et/ou floristique. Pour mettre en évidence cet effet du sol, nous avons introduit une nouvelle approche permettant de tester la fraction d’une analyse de partition de variance correspondant à la part de variation floristique expliquée par l’effet de conditions édaphiques spatialement structurées (co-variation entre effets spatiaux et édaphiques), en combinant l’analyse de partition de variance avec des vecteurs propres de Moran (« Moran’s eigenvector maps ») et des translations toroïdales. Bien que cette méthode nous ait permis de déterminer si la fraction en question était significative, nous avons également mis en doute son interprétation habituelle suggérant que cette fraction représente une structure floristique directement induite par des structures spatiales de conditions de sol. Grâce à des simulations de populations végétales liées à des propriétés environnementales, nous avons mis en évidence que la valeur de la fraction étudiée ne semble finalement pas influencée par le degré de structuration spatiale des conditions environnementales, remettant donc en question l’utilité de l’analyse de partition de variance pour inférer des effets de processus écologiques sous-jacents sur la distribution spatiale des espèces d’arbres.<p>Enfin, les données floristiques et anthracologiques du Sud Cameroun ne nous ont pas permis de démontrer statistiquement l’hypothèse que les perturbations humaines passées sont en partie responsables de la dominance actuelle des espèces héliophiles. L’absence de corrélation significative entre l’abondance relative de ces espèces et la quantité de charbons de bois dans le sol peut s’expliquer par le fait que la majorité de ces charbons (60%) étaient trop vieux (1500 à 3000 ans) pour refléter des perturbations ayant influencé la diversité végétale présente. <p>Les conclusions générales de ma thèse de doctorat soutiennent que la niche écologique des espèces d’arbres des forêts tropicales africaines contribue de manière significative à déterminer leur assemblage dans l’espace, mais aussi que ces effets de niche dépendent fortement du contexte environnemental étudié ainsi que de l’échelle spatiale d’observation. Ce travail lève donc en partie un voile sur l’écologie des écosystèmes forestiers d’Afrique centrale qui restent largement méconnus par rapport à ceux d’Asie du Sud-Est et des régions néotropicales.<p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie végétale / info:eu-repo/semantics/nonPublished

In tropical forests, ants are numerous, diversified and ecologically important, being present from forest floor to upper canopy and exploiting a wide variety of diets. Nearly half of the ant species are directly in contact with the ground stratum, including the leaf-litter and the underlying soil, for nesting or foraging. The main factors known to influence ant distribution and abundance can be environmental (e.g. heterogeneous distribution of microhabitat size, nutrient availability, microclimate, soil properties) or biotic (e.g. inter- and intraspecific competition, prey availability). Some of these factors, such as leaf-litter volume or prey availability, may also vary seasonally. Also, the Ecuadorian Andes are known as being a hotspot of biodiversity for a large array of organisms, but it was not documented until now if this is also the case for ants.<p><p>The general aim of the PhD project was to identify, by both descriptive and experimental approaches, the factors determining the structure of a ground-dwelling ant assemblage at a small-spatial scale and its temporal variation in an evergreen premontane tropical forest of the Ecuadorian Andes.<p><p>In the descriptive part of the project, we studied both horizontal (along a transect) and vertical (across ground layers) species diversity and distribution of ground-dwelling ants. To attempt to explain the observed patterns, we measured a series of environmental factors varying at small spatial scale and/or seasonally: canopy openness, leaf-litter quantity, slope, and a series of soil physico-chemical properties (e.g. texture). The ant assemblage richness appeared to be at least as high as in the Amazonian Basin, with up to 33 species per m². The heterogeneity of species spatial distribution at small spatial scale was high, with distinct species composition (average Jaccard index = 0.2 ± 0.08 SD) and abundance (up to 40 fold) in contiguous plots. We observed a strong seasonal effect on the ant assemblage structure. The higher ant diversity and abundance found at the surface and in the mineral soil during the dry season suggested a seasonal peak of activity on the ground surface and the seasonal migration of drought-sensitive species downwards in the soil. Ant diversity was related to distinct environmental factors according to the ground layer considered. We found strong correlations between litter amount and dominant ant distribution in the leaf-litter layer, while we found no correlation with any factor in the soil layer. The low amount of negative association between dominant species suggested a low interspecific competition.<p><p>In the experimental part of the project, our aim was to identify experimentally the relative importance of habitat size vs. prey availability in structuring the leaf-litter ant assemblage. We studied the response of various ant trophic groups to an increased nutrient availability which boosted the decomposition of their leaf-litter habitat and enhanced the abundance of their prey. Bottom-up effect on the ant fauna (and other predaceous arthropods) regarding species composition and dominance was also studied. Stable isotope analysis was used to distinguish trophic groups among ants and mesofauna. Ants responded differentially according to their trophic group: despite increased prey availability, predatory species were negatively affected by nutrient supply, while other ant trophic group densities did not change. Our results showed that predatory ants are limited by habitat size rather than by prey availability, and that these ants are more affected by habitat loss than their prey, other ant trophic groups and other macrofauna taxa. Furthermore, a taxonomic shift occurred within each ant trophic group, leading to the replacement of dominant genera in fertilized plots.<p><p>As a conclusion, our results emphasize the importance of distinguishing layers among the ground matrix, since both ant faunas and their response to environmental factors vary vertically and seasonally. The distribution of ground-dwelling ants was only weakly explained by both the environmental factors measured and by biotic interactions, at a small spatial scale. Also, our results emphasize the importance of distinguishing trophic groups among the ant assemblage, since the response of these groups under changing conditions was different. In this regard, stable isotope analysis was a useful tool for investigating the trophic ecology of various leaf-litter taxa, and it was successfully used for the first time to assess the diet of leaf-litter ants and their position in the Brown Food Web relative to other taxa. Also, the isotopic approach allowed us to increase the knowledge about the biology of a rare and cryptic ant species, by revealing its top-predatory position. The outstanding local species richness that we observed confirms that the Ecuadorian Andes are also a biodiversity hotspot for ants. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La vitesse de réplication du HIV-1(Human Immunodeficiency Virus type 1), qui semble corrélée de manière directe à la vitesse de progression de la maladie vers le stade SIDA, est essentiellement contrôlée au niveau transcriptionnel. La transcription du HIV-1 est régulée par la structure chromatinienne, des éléments agissant en cis localisés dans les LTRs, des facteurs de transcription agissant en trans et par la protéine virale trans-activatrice Tat (revu dans Quivy et al. 2007, Bisgrove et al. 2005, Rohr et al. 2003, Rabson and Graves 1997). En plus de l’enhancer localisé dans le LTR5’ du HIV-1, un enhancer intragénique, localisé dans le gène pol du HIV-1, inductible par le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) a été identifié. La localisation progressive de l’activité enhancer a permis de définir deux domaines distincts et indépendants dans cet enhancer intragénique :les fragments 5103 et 5105 localisés respectivement dans la partie centrale du gène pol et dans une région couvrant la fin du gène pol, le gène vif, le gène vpr et le premier exon codant des gènes tat et rev (Verdin et al. 1990). Les fragments 5103 et 5105 se comportent tous deux comme des enhancers inductibles par le PMA lorsqu’ils sont clonés en amont du promoteur de la thymidine kinase dans un vecteur rapporteur en cellules HeLa. Notre laboratoire a précédemment identifié trois sites de liaison pour les facteurs de transcription AP-1 dans le fragment 5103 (Van Lint et al. 1991). <p><p>Au cours de notre thèse, nous avons poursuivi la caractérisation de ces sites de liaison AP-1 et avons montré que les facteurs c Fos, JunB et JunD interagissent in vitro avec ces motifs. Pour chaque site, nous avons identifié des mutations qui abolissent la liaison des facteurs AP-1 sans altérer la séquence en acides aminés sous-jacente de la transcriptase inverse. Par des expériences de transfection transitoire, nous avons démontré que les sites AP 1 intragéniques sont entièrement responsables de l’activité enhancer PMA-dépendante du fragment 5103. De plus, l’activité PMA-inductible du fragment 5103 est inhibée par le mutant dominant négatif A-Fos à condition que les sites ne soient pas mutés. A l’inverse, l’expression ectopique de dimères forcés AP-1 affecte positivement l’activité enhancer du fragment 5103. Enfin, nous avons étudié le rôle biologique des sites AP-1 intragéniques dans la réplication virale et avons montré que ces sites contribuent positivement à l’infectivité du virus.<p><p>Durant la seconde partie de notre thèse, nous avons entamé la caractérisation physique et fonctionnelle du fragment 5105. Nos résultats de transfection transitoire montrent que l’activité PMA inductible du fragment 5105 est localisée dans le dernier tiers de ce dernier :le sous fragment 5105.3. L’analyse bioinformatique de cette région a permis de mettre en évidence un site de liaison pour les facteurs AP-1 in vitro. Des mutations ponctuelles permettent d’abolir la liaison des facteurs à leur site mais altèrent la séquence en acides aminés sous-jacente codant pour les protéines Tat et Rev. Nous avons montré que ce site est impliqué dans l’activité transcriptionnelle de ce fragment. L’expression ectopique du mutant dominant négatif A-Fos inhibe l’activité transcriptionnelle PMA-inductible du fragment 5105. Une analyse bioinformatique plus large nous a ensuite permis d’identifier in vitro, par retard de migration sur gel, 5 sites de liaison pour le facteur YY1 et 2 sites de liaison pour le facteur PU.1 dont les implications pour le virus restent encore à déterminer.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Une compréhension sans cesse plus pointue des processus élémentaires de transferts de charges et d’énergie, qui sont à la base même de nombreux processus biologiques, permet non seulement l’élaboration mais aussi l’amélioration de la mise au point de molécules photoactives utiles dans différentes applications. C'est le cas (i) de systèmes moléculaires et supramoléculaires destinés à mimer efficacement la photosynthèse, ou encore (ii) de molécules photoactives capables d’interagir avec des macromolécules biologiques et d’induire une transformation de ces biomolécules. C’est dans ce cadre général que s’inscrit l’élaboration de nouveaux complexes polyazaaromatiques de Ru(II) capables d’interagir avec la double hélice d’ADN et de photoréagir avec sa base la plus réductrice, la guanine, par transfert d’électron photoinduit. C’est sur la base de ces processus que des nouveaux agents antitumoraux photoactivables ont pu être développés. L’utilisation de complexes de Ru(II) dans le design d’entités supramoléculaires polymétalliques destinées à jouer le rôle de collecteurs de lumière et permettant ainsi de mimer les systèmes d’antennes naturels s’intègre également dans cette démarche. <p><p>L’ensemble de notre travail s’est concentré sur ces deux domaines d’applications. Par l’étude de différents processus de transfert de charges/d’énergie au sein des complexes seuls (processus intramoléculaires) ou en interaction avec un environnement spécifique (processus intermoléculaires), nous avons souhaité mettre en évidence l’intérêt de l’utilisation d’un nouveau ligand plan étendu, le tpac, au sein de complexes du Ru(II). Un tel ligand permet en effet de conférer d’une part une affinité élevée des complexes résultants pour l’ADN, et d’autre part, de par sa nature pontante, de connecter des unités métalliques entre elles au sein d’entités supramoléculaires de taille importante. <p><p>Les propriétés photophysiques de quatre complexes basés sur le ligand plan étendu tpac, le [Ru(phen)2tpac]2+ (P) et son homologue dinucléaire le [(phen)2Ru tpac Ru(phen)2]4+ (PP) (à base de ligands ancillaires phen), ainsi que le [Ru(tap)2tpac]2+ (T) et son homologue dinucléaire le [(tap)2Ru tpac Ru(tap)2]4+ (TT) (à base de ligands ancillaires tap), ont été étudiées et comparées entre elles.<p><p>L’examen de ces propriétés, d’abord pour les complexes seuls en solution, en parallèle avec celles de complexes dinucléaires contenant un ligand pontant PHEHAT, a permis de mettre en évidence l’importance de la nature du ligand pontant utilisé. Ces résultats ont ainsi révélé qu’un choix judicieux du ligand pontant permet de construire des entités de grande taille capables de transférer l’énergie lumineuse vers un centre (cas du ligand PHEHAT), ou, au contraire, de relier entre elles des entités ne s’influençant pas l’une l’autre d’un point de vue photophysique (cas du ligand tpac). <p><p>Les propriétés des complexes du tpac, étudiés cette fois en présence de matériel génétique (mononucléotide GMP, ADN ou polynucléotides synthétiques), se sont révélées très différentes selon que le complexe portait des ligands ancillaires phen (P, PP) ou tap (T, TT). Seuls les complexes à base de tap sont en effet photoréactifs envers les résidus guanine. Nous avons dès lors focalisé cette partie de notre travail sur les deux complexes T et TT. Cette photoréaction, ainsi que le transfert d’électron photoinduit entre ces complexes excités et la guanine, ont pu être mis en évidence par différentes techniques de spectroscopie d’émission tant stationnaire que résolue dans le temps, ainsi que par des mesures d’absorption transitoire dans des échelles de temps de la nano à la femto/picoseconde. L’étude du comportement photophysique des complexes en fonction du pH a en outre révélé de manière très intéressante que, pour des études en présence d’ADN, la protonation des états excités des complexes devait être considérée. Les résultats de cette étude nous ont fourni des pistes quant à l’attribution des processus observés en absorption transitoire.<p><p>Le transfert d’électron a également fait l’objet d’une étude par des méthodes théoriques. Ces calculs ab initio ont permis de mettre en évidence une faible influence de l’énergie de réorganisation sur la vitesse de transfert d’électron, qui semble dépendre plus sensiblement de la non-adiabaticité du processus, mais surtout de l’énergie libre de la réaction et d’un éventuel couplage à un transfert de proton. <p><p>L’ensemble des résultats obtenus avec les complexes T et TT en présence de matériel génétique, qui, de manière assez inattendue, sont très semblables, indiquent que ces complexes présentent tous deux un grand intérêt pour le développement de nouvelles drogues antitumorales photoactivables.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cette thèse s’inscrit dans le cadre de l’étude de la relation structure-activité d’analogues de ligands naturels de récepteurs nicotiniques et purinergiques. Ce travail se divise en deux parties.<p><p>Dans la première partie de cette thèse, nous avons réalisé la synthèse d’analogues de la 11-homosédinone, alcaloïde isolé de la plante Sedum acre, qui présente une activité agoniste sur différents récepteurs nicotiniques du système nerveux central. Les différents analogues ont été synthétisé par application de la méthoxylation anodique pour introduire succesivement deux substituants en postion 2 et 6 d’un noyau pipéridinique. Les analogues synthétisés se différencient par la nature du noyau aromatique, la présence d’un groupement méthyle sur l’atome d’azote de la pipéridine et l’oxydation du sustituant en position 2. Ce travail a notamment permis de montré l’importance du groupement N-méthyle vis-à-vis de l’activité des analogues. Nous avons également pu mettre en évidence que l’introduction d’un halogène sur le noyau aromatique diminuait l’activité de l’analogue sur le récepteur a7 tout en augmentant l’acitivité sur le récepteur a4b2 et que l’introduction d’un noyau furanique permettait d’augmenter la sélectivité vis-à-vis du récepteur a4b2 tandis que l’introduction sur le noyau aromatique d’un groupement nitro ou méthoxy conduit à une perte totale de l’activité.<p><p>Dans la seconde partie de cette thèse, nous avons réalisé la synthèse d’analogues de la dATP, afin d’évaluer leur effet agoniste sur le récepteur P2Y11, impliqué dans différents mécanismes de différentiation cellulaire, dont notamment celui de la maturation des cellules leucémiques HL60 en cellules de type neutrophile. Les analogues synthétisés se différencient de la dATP par la présence d’un groupement méthylène ou dichlorométhylène entre les phosphores b et g de la chaîne polyphosphate, ainsi que par l’estérification de l’alcool en position 3’ du sucre. Ce travail a pu confirmer que les analogues en série 2’-désoxy conduisent à de meilleures activités que ceux de la série 2’-OH. Nous avons également pu montrer que l’estérification de la position 3’ conduit à une diminution de l’activité agoniste, à l’exception du groupement a-naphtoyle qui conduit à une augmentation significative de l’activité sur P2Y11.<p><p> / Doctorat en sciences, Spécialisation chimie / info:eu-repo/semantics/nonPublished

<P align="justify">Le but du travail de doctorat est la mise au point et l’étude fondamentale de voies de synthèse de diamines sous forme de leurs énantiomères optiquement purs. Ces derniers doivent être testés comme complexes dichloroplatiniques afin de quantifier leur pouvoir antitumoral. Les qualités souhaitées de ces synthèses sont leur application à des molécules de structure variées, les meilleures énantiosélectivité et diastéréosélectivité et les méthodes les plus simples possibles.</P><p><P align="justify">Les énantiomères des 1,2-diamino-1-(4-fluorophényl)propanes ainsi que les 1,2-diamino-1-(4-fluorophényl)-3-méthylbutanes ont été obtenus avec des rendements approximatifs globaux de 10 %. Les premières diamines ont été synthétisées par la méthode de Tytgat permettant l’obtention des deux séries d’énantiomères (érythro et thréo) au départ d’un énantiomère aminoalcool intermédiaire érythro. Les diamines érythro sont obtenues par une synthèse de Gabriel stéréospécifique tandis que la série thréo l’est par formation et ouverture par NH3 d’une aziridine, de manière stéréo- et régiosélective. Les butanediamines ont été synthétisées à partir des acides aminés optiquement purs (D- et L-alanine). Les thréos sont obtenues par une réaction de Grignard sur la nitrone dérivée de l’acide aminé N-boc. Les isomères érythro ont été fournis par la formation et l’ouverture régiosélective d’un N,Ndibenzylaziridinium, formé à partir de N,N-dibenzyl-2-amino-1-(4-fluorophényl)-3-méthylbutan-1-ol.</P><p><P align="justify">La synthèse des 1,2-diamino-1-(4-fluorophényl)butanes a été entreprise de la même manière mais les aminoalcool intermédiaires n’ont pu être isolés, suite à une réaction secondaire lors de la débenzylation des N,N-dibenzyl-2-amino-1-(4-fluorophényl)butan-1-ol, et ayant conduit à la 2,5-diéthyl-3,6-di(4-luorophényl)pyrazine-[1,2].</P><p><P align="justify">L’obtention des 1,2-diamino-1-(2-méthoxyphényl)propanes n’a pu être menée à bien suite aux effets négatifs de l’encombrement stérique et de l’effet mésomère du OMe sur le C-. Ni la voie de Tytgat, ni la synthèse via les diols produits par dihydroxylation asymétrique de Sharpless n’ont abouti.</P><p><P align="justify">La pureté énantiomérique a été vérifiée par dérivation chimique au (1R)-(-)-myrténal et enregistrement du spectre RMN 1H des imines obtenues. La réaction est réalisée in situ dans le tube RMN, avec le CDCl3 comme solvant. Cette technique a également permis la confirmation de la configuration absolue par comparaison avec les valeurs déjà obtenues avec les composés non-substitués. La méthode a été vérifiée quant à son étendue et ses limites sur toute une série de composés comprenant des acides-aminés, des amines primaires aliphatiques et des b-aminoalcools. On a pu ainsi prouver que les a-et b-phénylalkylamines sont les seules molécules sur lesquelles la technique est efficace.</P><p><P align="justify"> Les tests pharmacologiques préliminaires ont été effectués au moyen des complexes dichloroplatiniques de nos produits, sur les cellules cancéreuses mammaires MCF-7. L’introduction du fluor a augmenté l’activité des produits de façon importante, par rapport aux complexes non substitués. L’activité est fortement diastéréosélectives et modérément énantiosélective. Les isomères thréo sont toujours plus actifs que les érythro.</P><p><P align="justify">L’examen des résultats a permis de faire l’hypothèse qu’il existe, si pas un transport énantiosélectif, du moins un mécanisme de résistance qui favorise un énantiomère par rapport à l’autre. L’isomère thréo-1S2S est le seul à être cytotoxique à une dose de 1µM.</P> / Doctorat en sciences pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le projet de recherche a été réalisé en collaboration avec Professeur Jean-François Masson du Département de Chimie de l'Université de Montréal. The research project was made in collaboration with Professor Jean-François Masson from the Chemistry department of University of Montreal. / L'objectif du projet de recherche est de développer une méthode de criblage d’inhibiteurs basée sur une technologie émergente, soit un dispositif portatif utilisant la résonance des plasmons de surface (SPR). La cible du criblage est la dihydrofolate réductase R67 (DHFR R67), une enzyme qui confère une résistance bactérienne à l'antibiotique triméthoprime. Ici, l'enzyme cible est immobilisée sur une surface d'or mince avec des propriétés plasmoniques (optiques) spécifiques qui varient en fonction de la masse des molécules se liant à cette surface. Cette technique permet de suivre les événements de liaison de molécules à la DHFR R67 immobilisée, et ainsi peut permettre l'identification d'inhibiteurs potentiels. Cependant, la masse molaire des inhibiteurs typiquement utilisés lors de criblages préliminaires (i.e. 500-1000 g/mol) est trop faible pour générer un signal SPR détectable. Afin de contrer cette lacune, ce mémoire a pour objet de développer un essai compétitif indirect qui mettra en jeu des molécules de masse supérieure. D’abord, une nanoparticule d'or portant un analogue de substrat se liera à la DHFR R67 immobilisée à la surface d’or, générant ainsi un signal SPR important en raison de la masse molaire élevée de la nanoparticule. Ensuite, lors du criblage d'inhibiteurs potentiels, les nanoparticules liées seront déplacées de l'enzyme cible si la molécule criblée fournit une affinité suffisante. Ainsi, il sera possible de suivre indirectement la liaison d'un inhibiteur à la cible. Ce projet vise donc à tester et à valider l'approche de criblage SPR appliquée à la DHFR R67. / The objective of the research project is to develop a method for inhibitor screening based on a portable Surface Plasmon Resonance (SPR) device, an emerging technology. The target is R67 dihydrofolate reductase (R67 DHFR), an enzyme that confers bacterial resistance to the antibiotic trimethoprim. Here, the target enzyme is linked to a thin gold surface having specific plasmonic (optical) properties that vary as a function of the mass of bound molecules. This allows monitoring binding to the surface-linked R67 DHFR, and thus permits identification of inhibitors. However, the mass of the low-affinity inhibitors typically identified in early stages of screening (i.e. 500-1000 g/mol) is too low to produce a significant SPR signal. To address this shortcoming, a competitive assay will be developed: a gold nanoparticle carrying a substrate analog will bind the surface-immobilized R67 DHFR, resulting in a strong SPR signal due to its high mass. Then, upon screening for potential inhibitors, the bound nanoparticle will be displaced from the target enzyme if a molecule provides sufficient affinity. By those means, it will be possible to indirectly monitor the binding of an inhibitor to the target. This goal of this project is to test and validate the SPR screening approach applied to R67 DHFR.

Les récepteurs de type B de l'endothéline (ETB) sont présents sur l'enveloppe nucléaire des cardiomyocytes ventriculaires adultes (MVCAs). Il a été démontré que dans les MVCAs et les cellules endothéliales de rat, l’endocytose de l’endothéline marqué à la rhodamine colocalise avec le Lysotracker, un marqueur des lysosomes, mais n'est pas observée sur l’enveloppe nucléaire. Dans cette étude, nous avons caractérisé la localisation subcellulaire et la régulation de la biosynthèse de l’endothéline 1 dans les MVCAs et les fibroblastes cardiaques adultes de rat. Dans les deux types cellulaires les expériences d’immunocytofluorescence ont révélé une immunoréactivité de l’endothéline 1 correspondant à tous les stades de maturation du peptide, et détectable sur ou à proximité de la membrane nucléaire. L'enzyme de conversion d'endothéline 1(ECE1) est une métalloprotéase qui convertit la ̏ big˝ endothéline 1 en un peptide de 21 acides aminés biologiquement actif. L’immunoréactivité de l’ECE1 a été associée avec les tubules-T et les membranes nucléaires ou périnucléaires dans les MVCAs. Par contre, nous avons observé une immunoréactivité de l’ECE1 à la fois dans le noyau et le cytoplasme, mais pas sur la membrane plasmatique, dans les fibroblastes cardiaques à passage 3. L'ARNm de l’ET-1 a été détecté dans les deux types cellulaires. La régulation de la production de l'endothéline est principalement transcriptionnelle. L’application du facteur de croissance transformant ß1 (TGFß1) a augmenté l’ARNm de l’ET-1 dans les MVCAs et l'angiotensine II a stimulé l'augmentation de l’ARNm de l'ET-1 dans les fibroblastes. Dans les MVCAs, l'augmentation de l'ARNm ET-1 a été associée à une élévation du peptide intracellulaire ET-1 et du calcium nucléaire. Ces données suggèrent que l'endothéline endogène est disponible et serait capable d’activer le récepteur ETB nucléaire dans les MVCAs en réponse à des stimuli extracellulaires. / Type B endothelin receptors (ETB) are located in the nuclear envelope of adult ventricular cardiomyocytes (ACVMs). In both ACVMs and endothelial cells, endocytosed rhodamine endothelin colocalized with Lysotracker but was not observed at the nuclear membrane. In this study we have characterized the regulation and subcellular localization of endothelin biosynthesis in ACVMs and adult cardiac fibroblasts. In both cell types immunocytofluorescence experiments revealed endothelin-1 immunoreactivity, comprising all stages of peptide maturation, either on or near the nuclear membrane. Endothelin converting enzyme 1 (ECE1) is a metalloprotease that converts big endothelin to the biologically active 21-amino acid peptide. ECE1 immunoreactivity was associated with the T-tubules and nuclear or perinuclear membranes in ACVMs. In contrast, ECE1 immunoreactivity was observed both in the nucleus and the cytosol, but not at the plasma membrane, in passage 3 cardiac fibroblasts. Endothelin-1 mRNA was detected in both cell types. Regulation of endothelin production is primarily at the level of transcription. Application of TGFβ1 increased ET-1 mRNA in ACVMs whereas angiotensin II was effective in increasing ET-1 mRNA in fibroblasts. In AVCMs, the increase in ET-1 mRNA was associated with an increase of intracellular ET-1 peptide and nuclear calcium. These data suggest that endogenous endothelin is available and may activate nuclear ETB in ACVMs in response to extracellular stimuli.