Le développement de composés permettant le passage de molécules à travers la membrane cellulaire constitue un domaine de grand intérêt de la chimie et de la biochimie. Certaines maladies, comme la fibrose kystique, sont le résultat d'un dysfonctionnement du transport d'ions chlorure et bicarbonate à travers la bicouche lipidique. Ces dernières années, de nouvelles familles de transporteurs synthétiques ont fait leur apparition comme solution de remplacement aux transporteurs naturels. Cependant, la synthèse de systèmes supramoléculaires permettant le transport de larges molécules de part et d’autre de la bicouche lipidique reste, quant à elle, un défi. Ainsi nous présentons dans cette thèse deux systèmes différents: l’un permettant le transport d’ions chlorures et le second capable de combiner transport anionique et transport de macrocycles biologiquement actifs. Dans un premier temps, nous avons étudié le potentiel ionophore d’un dérivé benzimidazole. Des études mécanistiques ont été menées sur le 2,4,7-triphénylbenzimidazole afin de déterminer son mode d’assemblage dans la membrane phospholipidique, responsable de son efficacité à transporter les anions. Basé sur ces résultats, des analogues de cette molécule possédant des sites de complexation métallique ont été synthétisés afin d’augmenter l’efficacité de ces transporteurs benzimidazole et de contrôler leur auto-assemblage. Ces complexes ont été testés dans des membranes bactériennes afin d’étudier leur capacité à inhiber la croissance des bactéries et à diminuer la tolérance d’une souche bactérienne résistante envers les antibiotiques. Dans le second volet de cette thèse, nous avons étudié l’utilisation de dérivés parapluies capables de changer de conformation dépendamment de la polarité du solvant, pour le transport d’anions et de macrocycles. La synthèse et la caractérisation d’un nouvel axe et son dimère parapluie sont rapportées dans cette partie. Leur capacité à transporter les anions à travers la membrane des liposomes ou leur insertion dans des membranes bactériennes ont été étudiées. Les premiers essais de synthèses de rotaxanes à partir de ces dérivés parapluies pour le transport de macrocycle biologiquement actif sont rapportés. / The development of compounds able to transport molecules through cellular membranes is an emerging area of chemistry and biochemistry. Several diseases, such as cystic fibrosis, are the result of a dysfunction of chloride and bicarbonate transport across cellular membranes. In the last few years, new families of synthetic transmembrane transporters were developed in order to restore chloride transport. However, the synthesis of supramolecular systems for the transport of large molecules from one side to the other one of the lipid bilayer remains a challenge. Herein we present two different systems: one for chloride transport and a second one that combines the transport of ions and biologically active macrocycles through cellular membranes. We first present the anionophoric potential of benzimidazole derivatives. Mechanistic studies were conducted on 2,4,7-triphenylbenzimidazole to determine its self-assembly in a phospholipid membrane and its capacity to transport anions. Two analogues possessing metal coordination sites were also developed and studied for their anion transport properties, as well for the formation of metal-organic assemblies. These complexes were studied in bacterial membranes for their ability to inhibit bacterial growth and to reduce the tolerance of a resistant strain to antibiotics. In the second part of this thesis, we present the use of umbrella compounds that are able to change their conformation depending on the polarity of the environment. The synthesis and characterization of a new umbrella thread and its dimer are reported in this section. Their ability to transport anions through liposomal membranes or their insertion into more complex bacterial membranes are studied. The first attempts to assemble rotaxanes with the umbrella compounds and an active macrocycle are presented.

L’émergence de la résistance à une multitude d’agents antimicrobiens chez des bactéries pathogènes est considérée comme une menace majeure pour la santé publique (2). Ces souches sont reconnues comme des organismes multirésistants aux médicaments ou MDR (multidrug-resistant) (4). Les recherches progressent chez les bactéries, à Gram positif, à Gram négatif et acido-alcoolo-résistantes au vu de l’ampleur de la menace pour la santé publique, ces bactéries multirésistantes sont devenues les cibles potentielles à cette fin de recherche. De ce fait, les objectifs de la présente étude ont consisté en la caractérisation structurale et fonctionnelle de différents transporteurs transmembranaires de la famille des RND (Resistance-Nodulation-Division) encore énigmatiques, à savoir: le MmpL3 chez Mycobacterium tuberculosis (Mtb) via l’étude de son orthologue CmpL1 chez Corynebacterium glutamicum (Cgl) et le TriAxBC chez Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Ainsi, comme première démarche présentée dans le chapitre 2, la structure du transporteur MmpL3 Mtb (un transporteur d'acides mycoliques – sous forme de tréhalose de monomycolates (ou TMM) - essentiel pour la viabilité de Mtb) (5) et celle de son orthologue CmpL1 Cgl ont été prédites via le serveur I-TASSER (6-8). Ces structures ont été validées par la suite en comparant à la carte électronique générée pour CmpL1 (18 Å) par des analyses de microscopie électronique en transmission à coloration négative (TEM). La caractérisation du transporteur CmpL1 purifié par chromatographie à exclusion stérique a confirmé le complexe trimérique de taille avoisinant les 315 KDa (incluant la couronne du détergent) en accord avec des analyses par gel SDS-PAGE. Des études génétiques et biochimiques en collaboration ont d’autre part identifié des résidus engagés dans le transport du TMM chez MmpL3 ainsi que d’autres impliqués dans la résistance à des inhibiteurs ciblant ce transporteur. L’ensemble de ces données a mis en évidence la localisation des résidus essentiels au transport et à la résistance au niveau du canal central du modèle trimérique de MmpL3. La région de MmpL3 activant le transport par force protomotrice a été localisée au niveau d’une cavité centrale qui est une caractéristique intrinsèque de la famille des RND. Les cartes électroniques de faible résolution déjà obtenues pour la protéine CmpL1 font de ce projet une des directions futures du laboratoire. Dans le chapitre 3, nous illustrons le deuxième aspect du présent projet qui repose sur l’extension de l’étude du potentiel thérapeutique du ciblage du transporteur transmembranaire MmpL3 chez les différentes souches de Mycobacterium. Nos collaborateurs ont effectué une analyse biochimique de l’effet thérapeutique des inhibiteurs les plus prometteurs du transporteur MmpL3 Mtb sur certaines souches mycobactériennes non-tuberculeuses (NTB) multi-résistantes. Basés sur nos modélisations structurales comparatives obtenues par I-TASSER (6-8), nous avons pu complémenter les informations biochimiques en soulignant les similitudes et les différences de structure entre les souches TB et NTB ainsi que leurs impacts fonctionnels. Ce chapitre met en évidence l’intérêt du ciblage thérapeutique de MmpL3 chez les espèces NTB. En effet, l’efficacité de certains inhibiteurs de MmpL3 Mtb sélectionnés sur le traitement des infections pulmonaires NTB promet de pouvoir généraliser cette nouvelle voie de traitement pour d’autres souches multi-résistantes NTB voire à contribuer à remédier à la problématique de la résistance aux antibiotiques et décomplexifier le traitement actuel. D’autres études en collaboration entreprenant les mêmes approches d’études structurales ont été réalisées pour les transporteurs tripartites TriAxBC (P. aeruginosa), des pompes à efflux appartenant à la famille des RND. Le but du chapitre 4 était de générer une structure du complexe et de déchiffrer son mode d’assemblage et d’expulsion des antibiotiques vers le milieu externe. Un modèle à structure quaternaire de TriAxBC a été prédit par I-TASSER (6-8) et validé contre sa carte électronique à 4.3 Å générée en Cryo-EM. Le complexe TriAxBC a été également caractérisé par filtration sur gel confirmant une taille approximative de 620 KDa et sa composition en trimère par visualisation sur gel SDS-PAGE. En conclusion, nous avons pu à travers cette étude combiner différentes approches biochimiques, génétiques et structurales soutenant la nécessité d’une approche multidisciplinaire pour l’approfondissement de la compréhension de la structure et du mode de fonctionnement des transporteurs RND. Ces derniers demeurent toujours énigmatiques; toutefois, nos avancées et d’autres à venir permettront la génération de nouveaux médicaments spécifiques traitant les bactéries multirésistantes. / The emergence of resistance to a multitude of antimicrobial agents in pathogenic bacteria is considered a major threat to public health (2). These strains are recognized as multidrug resistant organisms (MDR) (4). Research is progressing in Gram positive, Gram positive high GC and Gram negative bacteria, and given the scale of the public health threat, these MDR have become potential targets for this research. The objectives of the present study consist of the structural and functional characterization of various transmembrane transporters of the still enigmatic RND (Resistance-Nodulation-Division) family, namely: MmpL3 in Mycobacterium tuberculosis (Mtb) via the study of its ortholog CmpL1 in Corynebacterium glutamicum (Cgl) and TriAxBC in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). The first component of this project, presented in Chapter 2, studies the structure of the transporter MmpL3 Mtb (a TMM mycolic acid transporter essential for the viability of Mtb (5) and that of its CmpL1 Cgl orthologue, which have been predicted via the I- Tasser Pack (6-8). These structures were subsequently validated by comparing to the electronic map generated for CmpL1 (18 Å) by negative staining transmission electron microscopy (TEM). Characterization of the purified CmpL1 transporter by size exclusion chromatography confirmed the trimeric complex size around 315 KDa (including the detergent crown) corroborated by SDS-PAGE gel analyses. Collaborative genetic and biochemical studies have also identified residues involved in the transport of TMM in MmpL3 as well as those residues conferring antibiotic resistance. This data highlighted the location of the essential residues of transport and resistance in the central channel of the trimeric Mmpl3 model. The MmpL3 region activating proto-motor transport has been located at a central cavity, which is an intrinsic feature of the RND family. The low-resolution electronic maps obtained for the protein CmpL1 may serve as the foundation of future studies. In Chapter 3 we explore the therapeutic potential of the targeting of the transmembrane transporter MmpL3 in different Mycobacterium strains. Our collaborators studied the therapeutic effect of the most promising inhibitors of the MmpL3 Mtb transporter on certain multi-resistant mycobacterial non-tuberculous (NTB) strains. Based on our comparative structural modeling obtained by I-TASSER (6-8), we supplemented the biochemical data by highlighting the structural similarities and differences between the TB and NTB strains as well as their functional impacts. This chapter highlights the interest of direct or indirect targeting of MmpL3 in NTB species. Indeed, the efficacy of certain selected MmpL3 Mtb inhibitors on the treatment of NTB pulmonary infection have potential as generalizable treatment options for other NTB multi-resistant strains, or even to help address the problem of resistance to antibiotics and simplify current combination approaches. Other collaborative studies undertaking the same structural approaches were carried out for TriAxBC tripartite carriers (P. aeruginosa), efflux pumps belonging to the RND family. The purpose of Chapter 4 was to generate a structure of the complex and decipher its mode of assembly and expulsion of antibiotics from the intracellular environment. A quaternary structure model of TriAxBC was predicted by I-TASSER (6-8) and validated against its 4.3 Å electronic map generated by Cryo-EM. The TriAxBC complex was also characterized by gel filtration confirming an approximate size of 620 KDa and its trimer composition by SDS-PAGE. In conclusion, this study is combining different biochemical, genetic and structural approaches to highlight the need for a multidisciplinary approach to characterizing the structure function of RND transporters. The latter remain enigmatic; however, our contribution and the progress of others will allow the generation of new specific drugs targeting multiresistant strains.

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The development of synthetic molecular receptors that can selectively bind anions, translocate them through a lipidic bilayer membrane and release them on the other side is a very topical and emerging field of supramolecular chemistry, warranted by the biological importance of transmembrane anion transport.The first part of this thesis is devoted to the study of the transmembrane transport of chloride and of the organic ion pair propylammonium chloride with calix[6]arene receptors functionalized with three (thio)urea arms on their small rim. The transport of chloride across the lipid bilayer of liposomes was monitored by fluorescence spectroscopy using the lucigenin assay. We report the first example of calix[6]arenes able to act as mobile carrier for the transport of chloride via a Cl-/NO3- antiport. We furthermore show that our calixarene systems are able to perform the cotransport of propylammonium chloride, with the chloride bound at the level of the (thio)urea groups and the ammonium included in the calixarene cavity. To provide direct proof of cotransport, we developed a 1H NMR methodology involving a thulium- complex shift reagent with which we were able to distinguish the signals of the ammonium transported inside the liposomes from those of the external ammonium. We also highlight the role of the complexing calixarene cavity for the cotransport by comparing the calixarenes to known transporters deprived of a cavity. The transmembrane transport organic ion pairs could find applications in the transport of biologically relevant ammonium compounds such as catecholamines and amino acids. Our results are reported in the publication “Repositioning Chloride Transmembrane Transporters: Transport of Organic Ion Pairs” Grauwels, G. Valkenier, H. Davis, A. P. Jabin, I. Bartik, K. Angew. Chemie - Int. Ed. 2019, 58, 6921–6925.The second part of this thesis is devoted to the study of binding of chloride to receptors embedded in a lipid membrane, the first step of the transmembrane transport process. Both 1H and 31P NMR spectroscopy proved to be inadequate to study the binding using liposomes or micelles as model membranes. With liposomes, the NMR signals are too broad to be exploited and in the case of micelles, the competition between the lipid headgroups and chloride made it impossible to obtain a NMR signature which unambiguously characterizes chloride binding. The 35Cl NMR signal is on the other hand strongly affected by the presence of anion receptors, both in organic solvents and when incorporated lipid bilayers. We developed a methodology to evaluate the binding of chloride, based on the monitoring of the chloride linewidth during titration experiments. A linear relationship between the linewidth and the concentration of receptors is observed and the slopes can be exploited to compare the binding strengths of different structurally related receptors. We show that 35/37Cl NMR is a versatile tool which can help in the understanding and development of new transporters by providing new insights of the physicochemical understanding of the transport process. / Doctorat en Sciences de l'ingénieur et technologie / info:eu-repo/semantics/nonPublished

STAUFEN1 (STAU1) est une protéine de liaison à l’acide ribonucléique (ARN) double brin jouant un rôle important dans le contrôle post-transcriptionnel de nombreux ARN messager (ARNm). Sa déplétion diminue la prolifération des cellules non cancéreuses en altérant les transitions G1/S et G2/M. En revanche, Ceci n’a aucun impact sur la prolifération des cellules tumorales. La déplétion de STAU1 module le niveau d’expression des transcrits et/ou des protéines impliquées dans la régulation des points de contrôle des transitions de phase. Notamment, STAU1 module le niveau d’expression de la protéine CDK4 ainsi que l’abondance de l’ARNm E2F1, deux régulateurs indispensables de la transition G1/S. Le transcrit de ces deux gènes possède un site de liaison à STAU1 ou STAU1 binding site (SBS) dans la région codante ou coding sequence (CDS) et dans la région non codante en 3’ (3’UTR), respectivement. Cependant, l’importance de la liaison de STAU1 à ces transcrits n’a pas encore été étudiée. Étonnamment, la sensibilité des cellules non tumorales et tumorales à l’expression de STAU1 est inversée lors de la surexpression de STAU1. En effet, sa surexpression altère l’entrée en mitose des cellules cancéreuses et diminue leur prolifération, alors qu’elle n’a aucun effet sur la prolifération des cellules non tumorales. Lors de la mitose, STAU1 s’associe au fuseau mitotique (FM), ce qui lui permet de localiser des ARNm et de contrôler leur séquestration et/ou leur traduction locale. Cependant, le mécanisme qui permet à STAU1 de lier le FM est encore inconnu. Pour ce mémoire, nous avons donc poursuivi deux objectifs. Le premier but est de comprendre la régulation post-transcriptionnelle médiée par STAU1 des transcrits essentiels à la transition G1/S chez les cellules non tumorales. Notre hypothèse est que STAU1 par sa liaison directe à ses transcrits cibles via le SBS module leur expression. Pour ce faire, des cellules de type sauvage ou déplétées en STAU1 étaient transfectées par des plasmides exprimant les transcrits de CDK4 et d’E2F1 contenant un SBS endogène ou muté de telle sorte qu’il ne reconnait plus STAU1. L’expression des protéines CDK4 et E2F1 est dosée par un essai luciférase ou un immunobuvardage de type western ou western blot (WB). Nous avons observé que STAU1 régule négativement et positivement l’expression endogène de CDK4 et d’E2F1, respectivement, ce qui contribue au passage de la transition G1/S, donc à la prolifération cellulaire non tumorale. Les essais luciférases ont confirmé le rôle de STAU1 dans la régulation positive d’E2F1 lorsque liée au SBS dans le 3’UTR du transcrit E2F1. Malheureusement, les plasmides utilisés pour l’expression de CDK4 se sont avérés non fonctionnels, ce qui nous a forcés à mettre de côté cette expérience. Le deuxième but est d’étudier les déterminants qui régulent la localisation de STAU1 au FM chez les cellules tumorales. Pour ce faire, la localisation de STAU1 ou des mutants au FM est détectée par WB à partir de préparations des FM purifiés. Nos données montrent que le déterminant est composé de plusieurs acides aminés (aa) situés entre le 26ème et 37ème aa du côté N-terminal de la protéine STAU1. En somme, nos résultats montrent les différents rôles de STAU1 dans les cellules tumorales vs cellules non tumorales. De ce fait, STAU1 pourrait être une cible thérapeutique spécifique potentielle dans le traitement du cancer. / STAUFEN1 (STAU1) is a double stranded RNA binding protein that plays an important role in the post-transcriptional control of many mRNAs. Its depletion decreases the proliferation of non-cancer cells by altering G1/S and G2/M transitions. In contrast, this has no impact on the proliferation of tumor cells. The decrease of STAU1 expression modulates the level of transcripts/proteins of several genes involved in phase transition checkpoints, including CDK4 and E2F1, two essential regulators in G1/S transition. In addition, CDK4 and E2F1 transcripts have a STAU1 binding site (SBS) in the coding sequence (CDS) and the non-coding region in 3’ (3’UTR), respectively. However, the molecular consequence of STAU1 association with the SBS is not yet studied. Surprisingly, the sensibility of non-cancer and cancer cells to STAU1 expression is reversed following STAU1 overexpression. Indeed, its overexpression alters the entry into mitosis of cancer cells and decreases their proliferation, while it has no effect on non-cancer cells. During mitosis, STAU1 associates with the mitotic spindle, which allows it to localize mRNAs and other non-coding RNAs. STAU1 likely controls their sequestration and/or local translation during mitosis. However, the molecular determinant involved in STAU1-spindle association is still not known. Therefore, for this master thesis, we had two objectives. The first goal is to understand the post-transcriptional regulation mediated by STAU1 on transcripts that are essential for G1/S transition in non-tumor cells. Our hypothesis is that STAU1, by its direct binding to the SBS of its target transcripts, modulates their expression. To do this, plasmids coding for CDK4 and E2F1 containing a wild-type or mutated SBS that does not recognized STAU1 were transfected in wild-type and STAU1-depleted cells. Expression of CDK4 and E2F1 was detected by dual luciferase assay and western blot (WB). Our results first indicate that STAU1 negatively and positively regulates the endogenous expression of CDK4 and E2F1, respectively, which contributes to the passage of G1/S transition, and therefore to the proliferation non-tumor cells. Then, the luciferase assays confirm the role of STAU1 in E2F1 expression, depending on STAU1 binding to E2F1 SBS in its 3’UTR. Unfortunately, the plasmids used for CDK4 expression turned out to be non-functional. The second goal is to identify the molecular determinants responsible for the localization of STAU1 to the mitotic spindle in tumor cells. To this end, the localization of STAU1 or of several mutants was measured by WB using purified spindle preparations. Our data show that the determinant is composed of several amino acids (aa) located between the 26th and 37th aa at the N-terminal end of STAU1. In summary, our results show the different roles of STAU1 in tumor and non-tumor cells. Therefore, STAU1 could be a potential specific therapeutic target in cancer treatments.

La leucémie aiguë promyélocytaire (APL) est un cancer des globules blancs qui se caractérise par l’accumulation de granulocytes immatures appelés promyélocytes. Dans la majorité des cas, la maladie est causée par la translocation réciproque des gènes RARα et PML, menant à l’expression de la protéine de fusion PML/RARα qui compromet à la fois les fonctions assurées normalement par RARα et par PML. Ainsi, la répression de la transcription des gènes cibles de RARα et la perturbation de la formation des corps nucléaires PML seraient la cause de la non-différenciation et de la survie par inhibition de l’apoptose des promyélocytes. Un des agents thérapeutiques utilisés dans le traitement de la maladie est le trioxyde d’arsenic (ATO) et malgré le fait que son efficacité soit prouvée, les mécanismes moléculaires par lesquels il exerce son action ne sont pas entièrement caractérisés. PML étant SUMOylée en réponse à l’ATO, nous avons émis l’hypothèse que d’autres protéines pourraient être régulées dans leurs modifications post-traductionnelles (PTMs) en réponse à l’agent thérapeutique et pourraient occuper un rôle dans le processus de guérison. Une analyse par protéomique quantitative de cellules HEK293 traitées à l’ATO a permis d’identifier 92 protéines significativement régulées en SUMOylation, incluant certains substrats connus de la caspase-3. Suite à cette observation, nous avons supposé que la SUMOylation pourrait protéger les substrats de la caspase-3 de leur clivage protéolytique. À l’aide d’essais in vitro et d’immunobuvardages, nous avons confirmé que la SUMOylation de PARP1 empêche son clivage par la caspase-3, ce qui pourrait jouer un rôle dans le destin cellulaire. / Acute promyelocytic leukemia (APL) is a cancer of white blood cells characterized by the accumulation of immature granulocytes called promyelocytes. In most cases, the disease is caused by the reciprocal translocation of the RARα and PML genes, leading to the expression of the PML/RARα fusion protein that compromises both the functions normally provided by RARα and by PML. Thus, repression of the transcription of RARα target genes and disruption of the formation of PML nuclear bodies may cause the non-differentiation of promyelocytes and the promotion of their survival by inhibition of apoptosis. One of the therapeutic agents used to treat the disease is arsenic trioxide (ATO) and despite the fact that its effectiveness is proven, the molecular mechanisms through which it exerts its action are not fully characterized. Since PML is SUMOylated in response to ATO, it is likely that other proteins may also exhibit changes in their post-translational modifications (PTMs) and play a role in the response. By using large-scale proteomic workflows on HEK293 cells following ATO treatment, we identified 92 proteins that shown significant changes in SUMOylation, including some known capase-3 substrates. Following this observation, we surmised that SUMOylation may protect these substrates from caspase-3 cleavage. Using in vitro assays and immunoblots, we confirmed that SUMOylation of PARP1 prevents its cleavage by caspase-3, an event that could mediate cell fate.

La sénescence se caractérise par un arrêt en phase G1/S du cycle cellulaire et peut être induit par une variété de stress tels que des télomères trop courts, l’activation d’oncogène ou encore à cause de stress oxydatifs. Cette réponse cellulaire s’accompagne de profonds changements au niveau de l’expression génique et les ARN non codants sont d’importants acteurs de ceux-ci. Bien que cette catégorie d’ARN ait longtemps été considérée comme un sous-produit non fonctionnel de la transcription, on sait maintenant qu’ils sont impliqués dans une pléthore de fonctions essentielles à l’homéostasie de la cellule. Les microARN (miR), de petits ARN non codants d’une vingtaine de nucléotides, sont souvent diminués ou surexprimés dans les maladies, soulignant leurs rôles importants dans le développement de celles-ci. C’est le cas notamment de deux oncomirs, miR-19 et miR-155, qui s’accumulent de manière aberrante dans les cancers hématopoïétiques. En condition normale, STAT5A, qui est souvent dérégulé dans ces cancers, induit SOCS1 qui agit comme un frein sur cette voie de signalisation afin de prévenir une prolifération incontrôlée. Des travaux conduits dans notre laboratoire montrent que SOCS1 est aussi impliqué dans la sénescence, car il est capable d’activer p53, un important suppresseur tumoral. SOCS1 peut être ciblé par les deux oncomirs et nos résultats montrent qu’une inhibition de ces derniers à l’aide d’éponges artificielles favorisait l’accumulation d’un p53 actif. De plus, en intégrant le ribozyme à tête de marteau dans la conception des éponges, nous avons créé une nouvelle génération d’outils (éponges catalytiques) qui sont plus efficaces. Effectivement, l’utilisation de ces éponges contre miR-155 résultait en une diminution de la prolifération, de formation de colonie ainsi que de la migration de cellule de myélome multiple. En second lieu, nous nous sommes penchés sur l’étude d’éponges naturelles dans le contexte de la sénescence. Il existe en effet quelques exemples de lARNnc (Long Non-Coding RNA) qui peuvent agir de la sorte pour un miR donné. Nous pensons que c’est par ce mécanisme de régulation que miR-146a, un miR impliqué dans la réponse anti-inflammatoire, peut s’accumuler dans la sénescence induite par RAS sans toutefois sembler être pleinement actif. Effectivement, les cellules sénescentes sécrètent une variété de facteurs pro-inflammatoires. À l’aide d’une nouvelle technique nommée miR-CLIP, nous avons pu étudier l’interactome de miR-146a et avons identifié plusieurs lARNnc qui selon des outils de prédiction, semblent s’hybrider de manière extensive en région 3’ du miR. Ceci est requis pour l’initiation d’un TDMD (Target-Directed miR Degradation) et nous avons donc investigué la possibilité d’un tel évènement dans la régulation de miR-146a. Nos résultats montrent que la surexpression de XXBAC-B444P24.13 mène à une diminution des niveaux de miR-146a qui n’est pas due à une baisse de sa transcription. Bien que le premier article illustre les avantages d’une éponge catalytique artificielle, le second article suggère que cette stratégie pourrait déjà être en place dans les systèmes biologiques, et ce, de manière naturelle. En effet, une fois miR-146a lié à XXBAC-B444P24.13, ce dernier induirait la dégradation du miR par un TDMD. Ceci ouvre donc la porte au développement d’outils qui pourraient être plus performants à des niveaux d’expression plus bas. / Cellular senescence is characterized by a cell cycle arrest in the G1/S phase and can be induced by a variety of stresses which include telomere shortening, oncogene activation or oxidative stress. Its establishment is known to require changes in the genetic expression program and non-coding RNA play an important part in this phenomenon. For a long time, this RNA subtype was considered to only be a transcriptional byproduct, but we now know that they are involved in a plethora of functions which are essential to cell homeostasis. Various diseases display aberrant expression of microRNA (miR), small non-coding RNA of 18-22 nucleotides, suggesting they are involved in their development. Such is the case for miR-19 and miR-155, two oncomirs which are found to be overexpressed in hematopoietic cancers. In normal conditions, STAT5A, which is often found dysregulated in those cancers, induces SOCS1 which acts as a retro-inhibitor of this signaling pathway, preventing uncontrolled proliferation. Furthermore, our lab has shown that SOCS1 can also be involved in senescence by facilitating p53 activation. SOCS1 can be targeted by both oncomirs and our results show that artificial sponges, that inhibit miR-19 or miR-155’s functions, lead to the activation of p53. Also, we have incorporated the hammerhead ribozyme in the miR binding sites in the sponge, creating a sponge 2.0 (catalytic sponges). Expressing the latter in a multiple myeloma cell line (RPMI8226) resulted in less proliferation, colony formation and migration. Secondly, we aimed at studying natural sponges in the context of senescence. Indeed, there are quite a few examples of lncRNA (Long Non-Coding RNA) acting as a miRNA inhibitor by quenching them. We think that this mode of regulation could provide an explanation as to how an anti-inflammatory miR, miR-146a, can accumulate in senescence even though it is a pro-inflammatory response. Using a novel technique called miR-CLIP, we were able to study specifically miR-146a’s interactome and have found that it can interact with many lncRNAs. Interestingly, using computational tools, we noticed that miR-146a was predicted to interact with extensive 3’ end hybridization with a number of these lncRNA. This characteristic is known to be required to induce TDMD (Target-Directed miR Degradation). Indeed, when we overexpressed XXBAC-B444P24.13, miR-146a levels went down and this is not caused by a decrease in transcription of the miR. In the first part of this thesis, we show that artificial catalytic sponges have an advantage over a more “classical” design. This is further supported by the fact that this strategy seems to be employed in nature. Indeed, we might have uncovered a lncRNA that when bound to by miR-146a would lead to its degradation using TDMD. This could be taken advantage of in the development of new tools for miR inhibition that would be more powerful and could be potentially used at lower levels of expression.

L'obésité est un facteur de risque majeur de cancer. Il est connu qu’une adiposité élevée prédispose à un stress inflammatoire accru et potentialise la croissance tumorale. Néanmoins, les mécanismes restent mal définis. De façon intéressante, la sénescence cellulaire, ou le programme moléculaire causant l’arrêt du cycle cellulaire suite à un stress insurmontable, favorise l'inflammation chronique et délétère pendant l'obésité. Nous avons donc émis l’hypothèse que l'obésité puisse être un inducteur de sénescence protumoral qu’il est possible d’exploiter, via une stratégie sénolytique, pour ralentir ou même bloquer le développement de tumeurs. Grâce à des marquages de coupes histologiques de tumeurs métastatiques, nous avons montré que les masses malignes de patients ayant un indice de masse corporelle (IMC)>35 sont associées à des marqueurs de sénescence. Cette découverte suggère une charge élevée de cellules sénescentes chez ses patients. Alors que la sénolyse, ou l’élimination thérapeutique des cellules sénescentes, s'est révélée très prometteuse dans le traitement de plusieurs maladies liées à l'âge, son efficacité en tant que traitement du cancer est souvent mitigé et dépend des antécédents du patient. Dans notre étude, nous avons utilisé un modèle murin d'obésité induit par la diète combinée avec un modèle d’injections syngéniques de différentes lignées cancéreuses occasionnant des réponses immunogéniques faibles, légères ou hautes. Chez les souris sur une diète riche en gras, nous avons identifié des cellules cancéreuses sénescentes spécifiquement dans les tumeurs faiblement immunogènes, soit faiblement reconnue par le système immunitaire et donc difficile à traiter. Un traitement sénolytique avec l'inhibiteur de la famille BCL-2 ABT-263 abolit la réponse protumorale observée via l'ablation des cellules cancéreuses sénescentes. Ainsi, nous proposons que les thérapies combinatoires avec des agents sénolytiques devraient être envisagées pour traiter les patients cancéreux présentant une adiposité accrue. De plus, dans la même cohorte de patients où nous avons rapporté des marqueurs de sénescence dans les tissus malins, les patients obèses ont aussi montré une expression importante de Toll-like receptor 4 (TLR4). Nous avons donc émis l’hypothèse que le récepteur TLR4 joue un rôle important dans l’établissement d’un microenvironnement tumoral qui favorise la sénescence cellulaire et la croissance tumorale de souris en surplus de poids. Dans notre étude, nous rapportons que l'expression systémique de TLR4 est importante pour la croissance tumorale induite par l'obésité. Nous montrons également que l’induction d’un stress du réticulum endoplasmique médié par Inositol requiring enzyme 1a (IRE1ɑ) dans les cellules myéloïdes associées à une tumeur, favorise la sénescence des cellules cancéreuses, dans un contexte de faible immunogénicité, via TLR4. Ce travail établit les fondements d’une compréhension moléculaire du lien entre les régimes à forte teneur calorique et l'immunité protumorale. / Obesity is a major risk factor for cancer. High adiposity predisposes to increased inflammatory stress, which potentiates tumor growth. However, the mechanisms remain poorly defined. Interestingly, cellular senescence, or the molecular program causing cell cycle arrest following insurmountable stress, is known to promote chronic and deleterious inflammation during obesity. We therefore hypothesized that obesity could be an inducer of a protumoral senescence that can be exploited, via a senolytic strategy, to slow down or even block tumor development. Through histological sections of metastatic tumor, we show that malignant masses from patients with a body mass index (BMI)>35 are associated with markers of senescence, suggesting a high burden of senescent cells in these patients. While senolysis, or the therapeutic elimination of senescent cells, has shown great promises in the treatment of several age-related diseases, its efficacy as a treatment for cancer is often elusive and depends on patients’ history. In our study, we used a mouse model of diet-induced obesity (DIO) combined with a model of syngeneic injections of different cancer cell lines causing low, mild, or high immunogenic responses. In mice under a DIO, we have identified senescent cancer cells specifically in weakly immunogenic tumors, or tumors poorly recognized by the immune system, and therefore difficult to treat. Moreover, a senolytic treatment with the BCL-2 family inhibitor ABT-263 abolishes the protumor response seen in these mice via the ablation of senescent cancer cells. Thus, combination therapies using senolytic agents should fall into consideration to treat cancer patients with increased adiposity. In addition, in the same cohort of patients where we reported markers of senescence in malignant tissues, obese patients also showed significant expression of TLR4. We therefore hypothesized that the TLR4 receptor plays an important role in establishing a tumor microenvironment that promotes cellular senescence and tumor growth in mice subjected to experimental obesity. In our second study, we report that systemic expression of TLR4 is important for obesity-induced tumor growth. Moreover, we show that the induction of an IRE1ɑ-mediated endoplasmic reticulum stress, in tumor-associated myeloid cells, promotes the senescence of cancer cells, in a context of low immunogenicity, via TLR4. This work lays the foundation for a molecular understanding of the link between high-calorie diets and protumoral immunity.

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est une des premières causes de cécité pour les personnes âgées de plus de 50 ans. Elle existe sous deux formes : sèche et humide. La forme causant les pertes de vision les plus sévères et rapides est DMLA humide où des nouveaux vaisseaux sanguins anormaux se forment dans la rétine; ce processus est appelé la néovascularisation choroïdienne. Celui-ci est causé par la dégradation des différentes membranes de la rétine et de l’augmentation du VEGF stimulant la croissance de ces vaisseaux. L’obésité, l’hypertension, le diabète et la cigarette sont connus pour être des facteurs modifiables et fortement corrélés avec la maladie. Avec l’arrivée des nombreuses diètes tendances, le jeûne intermittent pourrait être une intervention non-pharmacologique impactant l’obésité, l’hypertension et le diabète. En effet, cette diète est reconnue pour améliorer la santé, améliore la sensibilité à l’insuline et la tolérance glucose, diminuer le cholestérol sanguin et exercerait un effet bénéfique sur l’obésité. Ce mémoire a été entrepris dans le but d’évaluer les avantages potentiels du cycle de diète, soit le jeûne intermittent, sur la néovascularisation choroïdienne dans un modèle de DMLA. Nous avons émis l’hypothèse que le jeûne intermittent permet la diminution de la néovascularisation choroïdienne. Nos résultats montrent que les souris sous le régime jeûne intermittent que nous avons utilisé, c’est-à-dire 2 jours d’alimentation pour 1 jour de jeûne, ne perdent pas de poids, et suivent le même schéma de prise de poids que les souris nourries à volonté. De plus, les souris sous jeûne intermittent n’ont pas d’avantage métabolique que ce soit au niveau du glucose et, encore, moins au niveau de l’insuline. Les résultats ne permettent pas de montrer une différence au niveau de la néovascularisation choroïdienne induit par notre modèle. Le modèle de jeûne intermittent choisit ne permet pas d’obtenir des avantages au niveau de la néovascularisation choroïdienne ni pour la sensibilité au glucose et à l’insuline / Age-related macular degeneration (AMD) is one of the most prominent causes of blindness for people over 50 years old. It exists in two forms: dry and wet. The form causing majority of loss of sight is caused by wet AMD from where new abnormal blood vessels form in retina. This process is called choroidal neovascularization. This is caused by degeneration of outer portion of the retina and an increase in VEGF that instigate the growth of the new blood vessels. Obesity, hypertension, diabetes and smoking are known to be modifiable factors and strongly correlated with the disease. The advent of a vast number of trendy diets has introduced the possibility of modulating chronic disease by modifying eating habits. As an example, intermittent fasting can impacting obesity, hypertension, and diabetes. Indeed, this diet has been known to improve health, increase sensitivity of insulin and glucose, lower cholesterol and to have beneficial effect in obesity. The purpose of the research in my master’s thesis is to evaluate the influence of diet cycle, intermittent fasting on choroidal neovascularization in a mouse model of AMD. We hypothesized that the intermittent fasting could be diminish the choroidal neovascularization. There are several experimental paradigms that reproduce intermittent fasting. We selected the intermittent fasting 2 days of eating for one day of fasting (IF 2:1). Our results show that mice on our selected intermittent fasting regimen did not lose weight and follow the same pattern of weight gain as the mice that fed ad libitum. Furthermore, the mice on this intermittent fasting diet paradigm didn’t have metabolic benefits on glucose or insulin tolerance. Our results also did not show any differences in choroidal neovascularization. Hence, the 2:1 paradigm of intermittent fasting didn’t show any benefits on choroidal neovascularization, nor glucose and insulin.

La sénescence est un processus caractérisé par un arrêt stable du cycle cellulaire. Ce mécanisme peut être induit en réponse à de nombreux stress, comme l’activation d’un oncogène, le raccourcissement des télomères ou bien le traitement avec des composés génotoxiques. Cette réponse cellulaire est considérée comme une barrière antitumorale limitant la prolifération des cellules exposées au risque de transformation. La mise en place de la sénescence dépend de profonds changements au niveau moléculaire, dont l’activation d’un programme de dégradation sélective des protéines. Cette dégradation de protéines associée à la sénescence (SAPD) peut expliquer plusieurs caractéristiques des cellules sénescentes, notamment la présence de défauts dans la voie de synthèse des ribosomes (SARD). Ces derniers sont liés à un stress nucléolaire qui mène à l’accumulation de certaines protéines ribosomiques dans le noyau, où elles peuvent effectuer des fonctions indépendantes de leur rôle structurale dans les ribosomes. Parmi ces protéines ribosomiques, RPS14/uS11 peut s’accumuler dans le nucléoplasme et réguler le cycle cellulaire en inhibant CDK4. Ces mécanismes de régulation post-traductionnelle -le SAPD ainsi que les conséquences des SARD- contribuent de manière importante au phénotype sénescent. Nous avons émis l’hypothèse que la caractérisation des effecteurs dans ces voies pourrait mener à l’identification de nouvelles protéines importantes pour la sénescence et la suppression tumorale. Dans un premier temps, nous avons évalué le rôle de la protéine ribosomique RPL22/eL22 dans le cycle cellulaire et la sénescence. Tout comme RPS14, RPL22 a été identifié dans l’analyse de l’interactome de CDK4 lors de la sénescence induite par la perte du facteur de la ribogenèse RSL1D1. Nous avons pensé que RPL22 pourrait agir de manière similaire à RPS14 et ainsi effectuer des fonctions extra-ribosomiques impliquées dans la régulation du cycle cellulaire. Dans le premier article présenté dans cette thèse, nous montrons que la surexpression de RPL22 dans des fibroblastes humains induit un phénotype sénescent et que RPL22 peut lier et inhiber CDK4 afin d’activer la voie de RB. Ensemble, ces données indiquent un rôle suppressif de RPL22 dans le cycle cellulaire. En second lieu, nous nous sommes penchés sur la caractérisation des effecteurs du programme de dégradation sélective de protéines associé à la sénescence. Ce programme est mené à terme par le système ubiquitine-protéasome, un mécanisme finement régulé par différents types de protéines. Parmi celles-ci, les E3 ubiquitine ligases définissent la spécificité de ce système en interagissant avec les substrats à dégrader. Nous avons donc pensé que certaines E3 ubiquitine ligases spécifiques pourraient être importantes pour le mécanisme de dégradation protéique associé à la sénescence. Afin d’identifier celles-ci, nous avons effectué un criblage de shARN ciblant des gènes d’E3 ubiquitine ligases dans le contexte de la sénescence induite par les oncogènes. Ceci a mené à l’identification d’ASB14 comme un acteur important de la sénescence. Dans le deuxième article de cette thèse, nous montrons que la perte d’ASB14 produit un contournement de la sénescence induite par l’oncogène RAS dans plusieurs modèles cellulaires. ASB14 est une protéine peu caractérisée et nous avons généré des anticorps afin d’analyser son expression. Nous montrons ensuite qu’ASB14 s’exprime fortement dans le pancréas sain, tandis que ses niveaux diminuent dans les tumeurs pancréatiques. Enfin, nous avons identifié les partenaires d’interaction d’ASB14 dans le contexte de la sénescence induite par l’oncogène RAS. Globalement, les travaux présentés dans cette thèse nous ont permis d’identifier deux nouvelles protéines impliquées dans la sénescence cellulaire : la protéine ribosomique RPL22 et l’E3 ubiquitine ligase ASB14. Ces deux protéines contribuent à la régulation post-traductionnelle du phénotype sénescent. D’un côté, RPL22 peut inhiber l’activité de CDK4 afin d’activer la voie de RB et ainsi réguler le cycle cellulaire. D’une autre part, ASB14 est importante pour le maintien du phénotype sénescent et semble avoir un rôle dans la suppression tumorale du pancréas. Nos résultats suggèrent que RPL22 et ASB14 sont importants pour la sénescence et la suppression tumorale. / Cellular senescence is characterized by a stable cell cycle arrest. This process can be induced by a variety of cellular stresses, including oncogene activation, telomere shortening and genotoxic treatments. In fact, senescence is considered an antitumor barrier that prevents cellular transformation. Senescence is associated with widespread molecular changes, including the activation of a selective protein degradation program. This senescence-associated protein degradation (SAPD) could regulate some senescence-associated phenotypes, including the senescence-associated ribosome biogenesis defects (SARD). Senescence-associated ribosome biogenesis defects are linked to a nuclear accumulation of some ribosomal proteins such as RPS14/uS11 capable of carrying out extra-ribosomal functions. In particular, RPS14 can inhibit CDK4 and mediate senescence. Thus, we hypothesize that the proteins implicated in these pathways -SAPD and SARD- could be important for senescence and tumor suppression. First, we evaluated the ability of the ribosomal protein L22 (RPL22/eL22) to regulate cellular senescence and cell cycle progression. RPL22, as RPS14, was identified as a binding partner for CDK4 in senescent cells induced by depleting the ribosome biogenesis factor RSL1D1. Hence, we though that RPL22 could act in a manner similar to RPS14. In chapter two, we show that RPL22 overexpression induces a senescent phenotype in human fibroblasts. In addition, we show that RPL22 can interact with CDK4 inhibiting its activity and stimulating the RB tumor suppressor pathway. Taken together, these results indicate a suppressive role of RPL22 in cell cycle progression. Next, we focused on the characterization of SAPD effectors. This mechanism is mediated by the ubiquitin-proteasome system which is tightly regulated by E3 ubiquitin ligases. Thus, we thought that specific E3 ubiquitin ligases could be important for SAPD and for senescence. In order to discover E3 ubiquitin ligases that contribute to senescence, we performed an unbiased screening using shRNA libraries in Ras-induced senescent cells. This led to the identification of ASB14 as an important mediator of senescence. In chapter three, we show that ASB14 depletion leads to a bypass of Ras-induced senescence. ASB14 is a poorly characterized E3 ligase, and we generated antibodies in order to analyze its expression levels. We show that ASB14 is highly expressed in the normal pancreas whereas its expression is reduced in pancreatic cancer tissues. Finally, we uncovered the interactome of ASB14 in Ras-induced senescent cells. Overall, we have discovered two new senescence mediators: ribosomal protein L22 and E3 ubiquitin ligase ASB14. These proteins are implicated in the post-translational regulation of the senescent phenotype. RPL22 acts as a CDK4 inhibitor to activate RB pathway and regulate cell cycle arrest and ASB14 is an important mediator of senescence maintenance. Taken together, our results suggest that RPL22 and ASB14 are important for cellular senescence and tumor suppression.