Cell cycle control genes in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe have been studied in detail in the past few years. The cdc25+ and wee1+ genes of S. pombe play key roles in the commitment to division. Genes homologous to the mitotic inducer cdc25+ and the mitotic inhibitor wee1+ of Schizosaccharomyces pombe were searched for in Saccharomyces cerevisiae using DNA cross-hybridization as the method of detection. Such homologs were not found in Saccharomyces cerevisiae by this method. Attention was therefore turned towards sequencing and partially characterizing a previously cloned gene, WHI1+, and its mutant form WHI1-1 (now call CLN3+ and CLN3-1 respectively). Sequence analysis showed that CLN3+ is a cyclin homolog. Cyclins are probably present in all eukaryotes and play an important role in controlling the onset of mitosis. However, unlike these mitotic cyclins, CLN3+ functions in G1. CLN3-1 cells enter a new round of the cell cycle at an aberrantly small cell size and are α-factor resistant. Sequence analysis showed that the CLN3-1 protein was a truncated form of CLN3+ caused by a nonsense mutation in the CLN3+ gene. Cells overexpressing CLN3+ had the same phenotype as CLN3-1 cells, suggesting that the truncated CLN3-l protein was a hyperactive form ofthe wild-type protein. CLN3+ and CLN3-1 were placed downstream of the yeast GAL1 promoter in a shuttle plasmid. Cells transformed with these plasmids and grown in the presence of galactose and the absence of glucose produced CLN3+ or CLN3-1 in large amounts. Cell size was reduced in such cells. These cells were also α-factor resistant. / Thesis / Master of Science (MSc)

Microglia are a unique type of immune cell found within the brain, spinal cord and retina. In the healthy brain, their job is to support neurons, defend against infectious microbes, clear extracellular debris and remove dead or dying cells through phagocytosis. This diverse array of functions presents the possibility of unique subsets of microglia existing in the healthy brain, yet none have been described thus far. By utilizing cellular autofluorescence as a discriminating characteristic, we identified two novel subsets of microglia present in the healthy brains of mice and non-human primates. Approximately 70% of microglia displayed autofluorescence (AF+) while the remaining 30% did not (AF–). While the proportion of AF+ and AF– microglia remained constant throughout most of adult life, the autofluorescence intensity increased exclusively in the AF+ subset at an almost linear rate with age. This gain in autofluorescence correlated with equivalent increases in the size and complexity of storage bodies, as detected by transmission electron microscopy and increases in LAMP1 levels, a key component of the lysosomal compartment. As the brain ages, lysosomal storage material builds up inside AF+ microglia, further increasing the accumulation of autofluorescence as a result. The analysis of protein content in autofluorescent subsets revealed that AF+ microglia produced more proteins and enzymes involved in the storage and degradation of waste material, as well as more proteins involved in the regulation of mTOR, a key cellular pathway governing nutrient availability and energy production. Interestingly, the disruption of lysosomal function in microglia through genetic mutations accelerated the accumulation of storage material in AF+ cells, which led to impaired microglia physiology and increased cell death, mimicking the effects observed during advanced aging. Increasing evidence suggests that the accumulation of waste materials inside the brain contributes to diseases of aging and these data are suggestive of a mechanistic convergence between aging and lysosomal storage disorders.

Résumé : Calnuc est une protéine ubiquitaire qui lie le calcium et qui est présente au réseau trans-golgien (TGN) ainsi qu'aux endosomes. Notre groupe a précédemment mis en évidence le rôle de Calnuc dans le transport de Low density lipoprotein receptor-related protein 9 (LRP9), un récepteur aux lipoprotéines de faible densité qui cycle entre le TGN et les endosomes. Les récepteurs lysosomiaux au mannose-6-phosphate (MPR) et Sortiline sont bien caractérisés et empruntent également cette voie. À l'image de LRP9, nous avons montré que Calnuc prévient leur dégradation aux lysosomes en participant à leur recyclage à partir des endosomes vers le TGN. En fait, Calnuc est importante pour l'activation et l'association membranaire de Rab7, une petite protéine G qui recrute ensuite le complexe Rétromère responsable du transport rétrograde des récepteurs. La glycoprotéine lysosomiale Ceroid lipofuscinosis neuronal 5 (CLN5) est également impliquée dans ce processus. La structure et la fonction de cette dernière n'étant pas clairement définies, nous avons établi qu'elle est synthétisée sous forme d’une glycoprotéine transmembranaire de type II, mais son domaine N-terminal cytoplasmique et son segment transmembranaire sont rapidement éliminés suivant le clivage du peptide signal de manière à former une protéine CLN5 mature fortement associée à la membrane par une hélice amphipathique (AH). La compréhension des propriétés de base de CLN5 est particulièrement pertinente puisque la protéine est impliquée dans certaines variantes de céroïdes-lipofuscinoses neuronales (NCL), une maladie neurodégénérative rare causée par une surcharge des lysosomes. D'ailleurs, nos données indiquent que les mutants pathologiques de CLN5 dépourvus de cette AH perdent leur association membranaire, sont retenus au réticulum endoplasmique et sont rapidement dégradés. En raison de la similitude des fonctions de Calnuc et de CLN5 au niveau du triage endosomial, nous avons exploré le lien entre les deux protéines. Calnuc cytosolique et CLN5 luminale semblent former un complexe, par l'intermédiaire de la protéine transmembranaire CLN3, de façon à influencer l'activité de Rab7. CLN3 étant aussi associée aux NCL, nous avons finalement exploré la potentielle implication de Calnuc dans la maladie. L'absence de Calnuc entraîne des phénotypes cellulaires typiques des NCL comme un engorgement des lysosomes, une accumulation de matériel autofluorescent et une augmentation de l'autophagie. Les niveaux protéiques de Calnuc sont diminués dans toutes les lignées de fibroblastes de patients atteints de NCL disponibles ce qui indique que Calnuc pourrait être impliquée dans certains types de NCL. La présente thèse couvre donc la découverte de la fonction de Calnuc dans le transport intracellulaire, jusqu'à son implication potentielle dans les NCL, de même qu'une étude topologique de CLN5. / Abstract : Calnuc is a ubiquitous Ca2+-binding protein present on the trans-Golgi network (TGN) and endosomes. We previously highlighted the role of Calnuc in the transport of Low density lipoprotein receptor-related protein 9 (LRP9), a low density lipoprotein (LDL) receptor that cycles between the TGN and endosomes. Lysosomal receptors mannose-6-phosphate receptor (MPR) and Sortilin are well-characterized and also use the TGN-to-endosome trafficking pathway. Similarly to LPR9, we showed that Calnuc prevent their degradation in lysosomes by acting in their recycling from endosomes to the TGN. In fact, Calnuc is a important for the activation and the membrane association of Rab7, a small G protein which then recruit the Retromer complex known to be responsible for the retrograde transport of receptors. Lysosomal glycoprotein Ceroid lipofuscinosis neuronal 5 (CLN5) is also involved in this process. Because its structure and function have not yet been clearly defined, we established that it is synthesized as a type II transmembrane (TM) glycoprotein, but its cytoplasmic N-terminus and TM segment are rapidly removed following signal-peptide cleavage to generate mature CLN5 which is tightly associated to membrane through an amphipathic helix (AH). The understanding of the basic properties of CLN5 is particularly important given that CLN5 is involved in some variants of neuronal ceroid lipofuscinosis (NCL), a rare neurodegenerative disease caused by lysosomal overload. Moreover, our data indicate that CLN5 pathological mutants deprived of AH lose their membrane association, are retained in the endoplasmic reticulum, and are rapidly degraded. Based on the similarity featured by Calnuc and CLN5 in endosomal sorting, we explored the link between these two proteins. Cytosolic Calnuc and luminal CLN5 seem to form a complex, through the transmembrane protein CLN3, in order to influence the activity of Rab7. As CLN3 is also associated with NCL, we finally explored the potential involvement of Calnuc in this disease. Canuc depletion leads to typical NCL phenotypes such as lysosome enlargement, accumulation of autofluorescent material and of an increased of autophagy induction. Canuc's levels are decreased in all fibroblasts cell lines of NCL patients available indicating that Calnuc could be involved in some types of NCL. This thesis thus covers the discovery of the function of Calnuc in intracellular transport up to its potential involvement in the NCL, as well as a topological study CLN5.

Mutations in the CLN3 gene cause Juvenile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis (JNCL), a form of Batten disease that is grouped within the broad class of lysosomal storage diseases. JNCL displays a primary central nervous system phenotype characterized by rapid onset blindness, wide spread brain atrophy and reversal of learned abilities with death occurring 10-20 years after symptom onset. The mechanisms underlying these phenotypes are not known. CLN3 encodes CLN3, a protein with no known molecular function. CLN3 is expressed at very low levels natively in most cells, and is highly hydrophobic. Similar to other lysosomal storage diseases, it is difficult to ascertain the primary versus the secondary defects when the protein functions along the endosomal-lysosomal pathway. In JNCL one common finding among several labs, in various cellular systems, is a fluid-phase endocytotic defect. I took this commonality as a key to CLN3 function, and pursued cell biological pathways required for fluid-phase endocytosis. Fluid-phase endocytosis is regulated by cycling of the small GTPase Cdc42 and I discovered increased Cdc42-GTP in CLN3-null mouse brain endothelial cells. In mouse brain endothelial cells enhanced Cdc42-GTP increased Cdc42 dependent signaling, filopodial formation, and retarded cell migration. I also found reduced plasma membrane association of ARHGAP21, a known negative regulator of Cdc42. My data supports a model where loss of CLN3 reduces ARHGAP21 plasma membrane recruitment, and causes aberrant Cdc42 activation. Thus irregular Cdc42 activation underlies the commonly reported fluid-phase endocytic defects in JNCL. Therapeutic development for JNCL has been hampered in part from the varying phenotypes ascribed to CLN3 deficiency. My discovery that the fluid-phase endocytic defects result from Cdc42 pathway aberrations, which in turn contributed to multiple downstream phenotypes, opened the door to novel JNCL therapeutics. Here I present work showing that a Cdc42 inhibitor corrects the Cdc42 dependent defects in vitro and multiple defects in a JNCL mouse model.

Cell cycle control by trophic factors has a key role in regulation of cell proliferation in all organisms. Nutrients are one of these important factors needed by cells to reproduce, so very well regulated mechanisms must exist that connect nutrient availability to cell cycle. Hence the importance on studying how exactly nutrient-dependent signaling pathways work. Cln3, the most upstream G1 cyclin in Saccharomyces cerevisiae, is one well demonstrated common effector of multiple nutrient-dependent signaling pathways. Moreover, its role in cell cycle is crucial. So it is a good candidate to regulate cell cycle progression in response to nutrient availability. One important question is to find the protein that could directly modulate Cln3 levels in response to nutrient availability. This protein could play as a nutrient sensor and as a cell cycle regulator at the same time. In the present thesis, Pho85 is founded to be the protein that could run these two highly different tasks, because of its well-characterized properties on sensing phosphate availability and the well-known functions on modulating cell cycle as CDK. The results of the present work clearly demonstrate that when phosphate is present, Pho85 regulates Cln3 levels by increasing the stability of the cyclin through specific phosphorylations, promoting cell cycle progression. Contrary, under phosphate depletion conditions, Pho85 become inactive and Cln3 is rapidly degraded, leading to a cell cycle arrest in order to maintain cell chronological lifespan. / El control del cicle cel•lular per factors tròfics té un paper important en la proliferació cel•lular de tots els organismes. Els nutrients són uns d’aquests factors importants requerits per les cèl•lules per reproduir-se, per tant deuen existir mecanismes molt ben regulats que connecten la disponibilitat de nutrients amb el cicle cel•lular. Per això, l’estudi de com funciona la senyalització cel•lular de nutrients i com afecta a la progressió del cicle és altament rellevant. Cln3, la ciclina de G1 més primerenca a Saccharomyces cerevisiae, és un efector comú de múltiples vies de senyalització de nutrients. A més, el seu paper en el cicle cel•lular és crucial. Per tant aquesta proteïna és una bona candidata per regular la progressió del cicle cel•lular en resposta a la disponibilitat de nutrients. Una qüestió important a resoldre és trobar la proteïna que podria modular directament els nivells de Cln3 depenent de la presència de nutrients. Aquesta proteïna actuaria com a sensor de nutrients i com a reguladora del cicle cel•lular alhora. A la present tesi, es mostra a Pho85 com la proteïna que pot fer aquestes dues tasques, tant per les seves propietats ben conegudes en la detecció de fosfat, com per les seves funcions de CDK modulant el cicle cel•lular. Els resultats d’aquesta tesi demostren clarament que quan el fosfat és present, Pho85 modula els nivells de Cln3 incrementant l’estabilitat de la ciclina mitjançant fosforilacions específiques, promovent la progressió del cicle cel•lular. Per altra banda, sota condicions de manca de fosfat, Pho85 esdevé inactiva i Cln3 és degradada ràpidament, conduint a un arrest del cicle cel•lular per mantenir la longevitat de la cèl•lula. / El control del ciclo celular por factores tróficos tiene un papel importante en la proliferación celular de todos los organismos. Los nutrientes son uno de estos factores importantes requeridos por las células para reproducirse, por lo tanto deben existir mecanismos muy bien regulados que conecten la disponibilidad de nutrientes con el ciclo celular. Por ello, el estudio de cómo funciona la señalización celular de nutrientes y cómo afecta a la progresión del cicle es altamente relevante. Cln3, la ciclina de G1 más temprana en Saccharomyces cerevisia, es un efector común de múltiples vías de señalización de nutrientes. Además, su papel en el ciclo celular es crucial. Por lo tanto esta proteína es una buena candidata para regular la progresión del ciclo celular en respuesta a la disponibilidad de nutrientes. Un tema importante a resolver es encontrar la proteína que podría modular directamente los niveles de Cln3 dependiendo de la presencia de nutrientes. Esta proteína actuaría como sensor de nutrientes y como reguladora del ciclo celular. En la presente tesis, se muestra a Pho85 como la proteína que puede hacer estas dos tareas, tanto por sus propiedades bien conocidas en la detección de fosfato, como por sus funciones de CDK modulando el ciclo celular. Los resultados de esta tesis demuestran claramente que cuando el fosfato está presente, Pho85 modula los niveles de Cln3 incrementando la estabilidad de la ciclina mediante fosforilaciones específicas, promoviendo la progresión del ciclo celular. Por otro lado, bajo condiciones de ausencia de fosfato, Pho85 es inactivada y Cln3 se degrada rápidamente, conduciendo a una parada del ciclo celular para mantener la longevidad de la célula.

Juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis (JNCL, aka. juvenile Batten disease or CLN3 disease), a lethal pediatric neurodegenerative disease without cure, often presents with vision impairment and characteristic ophthalmoscopic features including focal areas of hyper-autofluorescence. In the associated research article “Loss of CLN3, the gene mutated in juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis, leads to metabolic impairment and autophagy induction in retinal pigment epithelium” (Zhong et al., 2020) [1], we reported ophthalmoscopic observations of focal autofluorescent lesions or puncta in the Cln3Δex7/8 mouse retina at as young as 8 month old. In this data article, we performed differential interference contrast and confocal imaging analyses in all retinal layers to localize and characterize these autofluorescent lesions, including their spectral characteristics and morphology. We further studied colocalization of these autofluorescent lesions with the JNCL marker mitochondrial ATP synthase F0 sub-complex subunit C and various established retinal cell type markers.

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Le tri et le transport efficace des hydrolases acides vers le lysosome jouent un rôle critique pour la fonction des cellules. Plus de 50 maladies humaines sont dues à des mutations des enzymes lysosomales, des protéines régulant des processus-clés du transport vers le lysosome ou des enzymes effectuant des modifications posttraductionnelles importantes pour la fonction du lysosome. L’objectif de cette thèse est d’identifier des protéines et des mécanismes permettant à la cellule de réguler le transport des enzymes vers le lysosome. Nous avons formulé l’hypothèse que des protéines mutées dans des maladies lysosomales et dont les fonctions étaient inconnues pouvaient jouer un rôle dans le transport vers le lysosome. Les céroïdes-lipofuscinoses neuronales forment une famille de maladies lysosomales rares mais sont aussi les maladies neurodégénératives infantiles les plus fréquentes. Plusieurs gènes impliqués dans les NCL encodent des protéines aux fonctions inconnues. Les travaux présentés dans cette thèse ont identifié la protéine « ceroid lipofuscinosis neuronal-5 » (CLN5) qui est localisée à l’endosome et au lysosome comme élément nécessaire au recrutement et à l’activation de rab7. Rab7 est une protéine Rab-clé qui contrôle le trafic à l’endosome tardif. Cette petite GTPase est impliquée dans le recrutement de retromer, un complexe protéique qui régule le trafic de l’endosome vers l’appareil de Golgi des récepteurs de tri lysosomal comme sortilin et le récepteur du mannose-6-phosphate. Dans les cellules où CLN5 est déplété, les récepteurs de tri lysosomal sont moins recyclés plus rapidement dégradés. En utilisant des expériences de photomarquage nous avons aussi pu démontrer que Rab7 est moins activées en l’absence de CLN5. Pour exécuter leur fonction les protéines rabs doivent être recrutée à la membrane et activées par l’échange d’une molécule de GDP pour une molécule de GTP. Le recrutement des Rabs à la membrane nécessite une modification posttraductionnelle lipidique pour être facilités. En utilisant un modèle de levures nous avons démontré que l’homologue de Rab7, Ypt7 est palmitoylée. Nous avons aussi démontré que la palmitoyltransférase Swif1 est nécessaire au recrutement de Ypt7 à la membrane. Nous avons aussi remarqué que les sous- unités de retromer chez la levure sont moins recrutées lorsque les palmitoyltransférases sont déplétées. Dans les cellules de mammifères nous avons démontré que Rab7 est également palmitoylé et que cette palmitoylation est possiblement effectuée par les palmitoyltransférases DHHC1 et DHHC8. La palmitoylation de Rab7 a lieu sur les cystéines en C-terminal qui sont nécessaires au recrutement membranaire et qui auparavant étaient uniquement décrites comme prénylées. En utilisant la méthode de « click chemistry » nous avons découvert que lorsque la prénylation de Rab7 est bloquée le niveau de palmitoylation augmente. Pour caractériser l’interaction entre CLN5 et Rab7 nous avons performé des expériences afin d’établir définitivement la topologie de cette protéine. Nous avons ainsi démontré que CLN5 est une protéine hautement glycosylée qui est initialement traduite en protéine transmembranaire et subséquemment clivée par un membre de la famille des peptidase de peptide signal (SPP). Cette protéine soluble peut alors possiblement interagir avec CLN3 qui est aussi palmitoylée pour recruter et activer Rab7. Nos études suggèrent pour la première fois que CLN5 pourrait être un recruteur et un activateur de Rab7 qui agirait avec la protéine CLN3 pour séquestrer Rab7 avec les autres récepteurs palmitoylés et permettre leur recyclage vers l’appareil de Golgi. / The proper sorting and trafficking of acid hydrolases plays a critical role in the normal function of cells. Over 50 known human diseases are caused by mutations of lysosomal enzymes, of proteins that regulate key processes of transport to the lysosome or of enzymes that perform posttranslational modifications which are important for the function of the lysosome. The main objective of this thesis is to identify proteins and mechanisms that allow the cell to regulate the transport of enzymes toward the lysosome. We formulated the hypothesis that proteins mutated in lysosomal diseases and that have no known functions could play a role in transport toward the lysosome. Neuronal ceroid-lipofuscinoses form a family of lysosomal storage disorders that are very rare but are also the most frequent infantile neurodegenerative diseases. The work presented in this thesis identified ceroid-lipofuscinosis neuronal-5 (CLN5), which is located at the late-endosomal/lysosomal compartment as a necessary element for the recruitment and activation of Rab7. Rab7 is an important GTPase that controls traffic from the late-endosome to the trans-Golgi network. Rab7 has been implicated in the recruitment of the retromer complex, which regulates retrograde transport of the lysosomal sorting receptor such as sortilin and the mannose-6-phosphate receptor. In the cells where CLN5 is depleted, the lysosomal sorting receptors are less recycled and degraded more rapidly. Using photolabelling assays we were also able to show that Rab7 is less activated in the absence of CLN5. To perform their function, Rab proteins have to be recruited to membranes and activated by the exchange of a GDP nucleotide for GTP. The recruitment of Rabs to membranes necessitates a lipidic posttranslational modification to raise the affinity. Using yeast as a model we demonstrated that the Rab7 homolog, Ypt7 is palmitoylated. We have also showed that the yeast palmitoyltransferase Swif1 is required for Ypt7 membrane recruitment. We have also observed that retromer subunits in yeast are less recruited when palmitoyltranferases are depleted. In mammals we have shown that Rab7 is also palmitoylated and that this palmitoylation may be done by palmitoyltransferases DHHC1 and DHHC8. The palmitoylation of Rab7 occurs on the C-terminal cysteines that are required for membrane recruitment and were previously only shown to be prenylated. By using Click chemistry we have discovered that when Rab7 prenylation is blocked the level of palmitoylation is augmented. To characterize the interaction of Rab7 and CLN5 we performed experiments to definitively establish the topology of this latter protein. Our results show that CLN5 is a heavily glycosylated protein that is initially translated as a type II transmembrane protein and subsequently cleaved by a member of the signal-peptide peptidase (SPP) family. This protein can then possibly interact with another member of the CLN family, CLN3 that is predicted to be palmitoylated to recruit and activate Rab7. Our studies establish for the first time that CLN5 is required for the recruitment and activation of Rab7 and may cooperate with the possibly palmitoylated protein CLN3 to sequester Rab7 in specific membrane domains with sorting receptors to allow their recycling toward the trans-Golgi network.

Dans cette thèse, la dynamique de photodissociation de l'azoture de chlore (ClN3) est étudiée dans le domaine temporel par imagerie de vecteur vitesse des photofragments, spécialement du chlore et de N3. Cette imagerie résolue à l'échelle femtoseconde permet d'extraire les temps de dissociation, l'établissement temporel de la balance d'énergie de la réaction ainsi que la conservation des moments. Cette étude a permis de différencier deux domaines d'énergie: l'un menant à la formation d'un fragment N3 linéaire (étude autour de 4.5 eV d'excitation électronique) et le plus intéressant aboutissant à la formation d'un fragment N3 cyclique (autour de 6 eV). Dans une seconde étude, la dynamique de relaxation électronique du tétrathiafulvalène (C6H4S4-TTF) est étudiée autour de 4 eV par spectroscopie de masse résolue en temps ainsi que par spectroscopie de photoélectron. Les seuils d'ionisation dissociative sont extraits d'une détection en coïncidence entre les photoélectrons de seuil et les fragments ionisés réalisée sur rayonnement synchrotron. Les deux dernières expériences sont basées sur la génération d'harmoniques d'ordre élevé dans l'XUV d'une impulsion femtoseconde à 800 nm ou à 400 nm. Dans la première expérience, les harmoniques sont couplées à un imageur de vecteur vitesse en tant que rayonnement secondaire VUV. Par imagerie de photoélectron résolue en temps, nous avons révélé ainsi les dynamiques de relaxation des états de Rydberg initiée par une impulsion femtoseconde XUV à 15.5 eV dans l'argon et à 9.3 eV dans l'acétylène. Dans la seconde expérience, couramment nommée spectroscopie attoseconde, les harmoniques constituent le signal pompe sonde. Deux types de spectroscopie attoseconde ont été réalisés pour étudier la dynamique vibrationnelle de SF6: une expérience en réseau transitoire créé par deux impulsions pompe Raman avec une impulsion sonde intense générant les harmoniques à partir du réseau d'excitation et une expérience d'interférence de deux rayonnement XUV en champ lointain créés par deux impulsions sonde intenses.